Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Фармакотоксикологическая характеристика азалептина 10
1.1.1. Номенклатура и положение азалептина в Международной статистической " классификации болезней, травм и причин смерти (МКБ) 10
1.1.2. Фармакодинамика азалептина 12
1.1.3. Фармакокинетика азалептина 13
1.1.4. Использование азалептина в медицинской практике 16
1.1.5. Немедицинское применение азалептина 20
1.2. Методы изолирования азалептина 28
1.3. Сохраняемость азалептина в трупном материале 32
1.4. Физико-химические методы в анализе азалептина 32
1.4.1. Обнаружение азалептина методами тонкослойной хроматографии 33
1.4.2. Обнаружение азалептина с применением спектральных методов анализа 35
1.4.3. Применение газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной
хроматографии для определения азалептина в биологическом
материале 37
Выводы по главе 42
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 43
2.1. Объекты исследования 43
2.1.1. Физико-химические свойства азалептина 43
2.1.2. Характеристика биологических объектов 44
2.2. Методы и материалы исследования 46
ГЛАВА 3. Разработка методик обнаружения и количественного определения азалептина хромато-графическими методами в биообъектах 52
3.1. Разработка методик обнаружения азалептина с использованием тонкослойной хроматографии 52
3.2. Разработка методики обнаружения и количественного определения азалептина на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии 58
3.3. Разработка методики обнаружения и количественного определения азалептина на основе газо-жидкостной хроматографии 66
3.4. Использование газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором в анализе азалептина 74
Выводы по главе 79
ГЛАВА 4. Разработка спектральных методик исследования азалептина 81
4.1. Разработка методик обнаружения и количественного определения методом УФ-спектрофотометрии 81
4.2. Использование ИК-спектрофотометрии в исследовании азалептина 89
Выводы по главе 91
Глава 5. Разработка методик изолирования азалептина из биологических объектов 92
5.1. Совершенствование методик изолирования азалептина из внутренних органов и тканей при судебно-химическом анализе общими методами 93
5.1.1. Методика изолирования азалептина подкисленной водой по методу Васильевой 93
5.1.2. Методика изолирования азалептина подкисленным спиртом по методу Стаса-Отто 96
5.2. Использование методики кислотного гидролиза на группу алкалоидов опия для изолирования азалептина из биологических объектов 99
5.3. Разработка методики изолирования азалептина из биологических жидкостей 104
Выводы по главе 109
Общие выводы по
Список литературы
- Номенклатура и положение азалептина в Международной статистической " классификации болезней, травм и причин смерти (МКБ)
- Физико-химические свойства азалептина
- Разработка методики обнаружения и количественного определения азалептина на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии
- Использование ИК-спектрофотометрии в исследовании азалептина
Введение к работе
Современный этап развития судебно-медицинской экспертизы, в частности судебно-химических методов исследования, включает в себя практическую работу врача судебно-медицинского эксперта, научно-исследовательскую деятельность и выпуск нормативно-методических материалов, регламентирующих экспертную деятельность.
Отравления психотропными препаратами занимают 3-4 место в рейтинге отравлений лекарственными средствами. В последние годы, в связи со значительным ростом применения психотропных препаратов в медицинской практике для лечения психических заболеваний, участились случаи отравления азалептином.
Клозапин (азалептин) является производным пиперазино-дибензодиазепина, обладает сильной нейролептической активностью и оказывает быстро наступающее седативное действие.
Препарат показан при острых и хронических формах шизофрении, психозах и других пограничных состояниях сознания. В качестве основных побочных эффектов азалептина можно выделить сонливость, спутанность сознания, миорелаксирующее действие, обморочные состояния.
В последнее время наблюдается увеличение случаев использования азалептина с целью преднамеренного опьянения граждан для осуществления криминальных действий по отношению к ним, поэтому все чаще в заключениях экспертов и врачей-токсикологов в качестве причины отравления выступает азалептин. Клофелин, длительное время использовавшийся преступниками для «отключения» человека, теперь заменен азалептином. При одновременном приёме азалептина с этиловым спиртом наблюдается возрастание тяжести его депрессивного действия на организм человека, что используется злоумышленниками в преступных целях.
Судебно-химическое исследование азалептина представляет собой сложную аналитическую задачу в связи с тем, что необходимо изолирование небольшого количества вещества, введенного в организм, из достаточно большого объема биологического материала. Для азалептина характерна близость терапевтических и токсических концентраций, что может послужить причиной, в том числе, смертельных интоксикаций, поэтому важно исследование биожидкостей (крови, мочи) для оценки степени острого отравления азалептином, динамики заболевания и эффективности проводимых дезинтоксикационных мероприятий в клинике.
Требования, предъявляемые на современном этапе к судебно-химическому исследованию, предполагают наличие утвержденных методических рекомендаций по методам изолирования и анализа токсикологически важных веществ, в том числе азалептина, в биологическом материале [68]. Однако в судебно-химическом отношении азалептин исследован недостаточно.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что не было проведено систематических исследований по разработке методик изолирования, обнаружения и количественного определения азалептина в биологических объектах. Опубликованные данные носят разноречивый характер, поэтому актуальным является комплексное исследование по разработке и оптимизации методик судебно-химического анализа азалептина (клозапина).
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы является разработка и совершенствование методик изолирования, обнаружения и количественного определения азалептина в биологических объектах при судебно-химическом исследовании с использованием современных физико-химических методов.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить условия изолирования азалептина из биологических объектов, определить оптимальные условия изолирования и очистки;
разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методики обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии;
определить возможность использования спектральных методов при судебно-химическом анализе азалептина;
предложить схемы судебно-химического исследования при отравлении азалептином;
разработать проект Новой медицинской технологии определения азалептина при судебно-химическом исследовании.
Научная новизна работы. Оптимизированы методики изолирования азалептина из биологических тканей и жидкостей на основе общих и частных методов.
Показана возможность использования спектральных методов (УФ- и ИК-спектрофотометрии) для целей идентификации и количественного определения азалептина при судебно-химическом исследовании.
Впервые предложен комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Предложены схемы судебно-химического исследования биологических объектов (кровь, моча, желчь, внутренние органы) на наличие азалептина, включающие подготовку проб для анализа, алгоритмы проведения анализа с использованием современных инструментальных методов (спектральных, хроматографических) на предварительном и подтверждающем этапах.
Определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно установить факт отравления при летальном исходе, в соответствии с разработанными схемами для
7 использования в практической экспертной деятельности.
Внесено предложение в Национальный НИИ общественного здоровья
РАМН по изменению рубрикации положения клозапина (азалептина) в
Международной статистической классификации болезней и проблем,
связанных со здоровьем (МКБ-10), с кода «Т42 Отравление
противосудорожными, седативными, снотворными и
противопаркинсоническими средствами. Т42.4 Бензодиазепинами» на код «Т43 Отравление психотропными средствами ... ».
Практическая значимость. Разработанный комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ- и ИК-спектрофотометрии позволяет достоверно установить факт отравления азалептином в практике работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы.
Предлагаемые методики позволяют значительно сократить время анализа по обнаружению азалептина, уменьшить навески биологических объектов (вещественных доказательств) и тем самым повысить эффективность проведения судебно-химического исследования и снизить материальные затраты.
Применение разработанных методик в практике химико-токсикологических лабораторий для диагностирования отравления азалептином позволяет осуществлять оценку степени отравления и оказывать своевременную помощь пострадавшему.
Внедрение. Разработанные методики изолирования азалептина из биологического материала, обнаружения и количественного определения апробированы и внедрены в практику работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Свердловской, Самарской, Оренбургской, Кировской, Челябинской, Курганской областей, Удмуртской Республики, химико-токсикологической лаборатории
8 областного центра острых отравлений Свердловской областной клинической психиатрической больницы, в учебный процесс кафедры токсикологической химии и Регионального центра аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ Пермской государственной фармацевтической академии, имеются акты внедрения (приложение 1).
Подготовлен, направлен и принят к рассмотрению Российским центром судебно-медицинской экспертизы проект Новой медицинской технологии «Определение азалептина при судебно-химическом исследовании», вход. № 1835 от 15. 10. 2007 г. (приложение 7).
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (г. Сочи, 2005), Международной научно-практической конференции «Фармация и здоровье» (г. Пермь, 2005), 80-й Всероссийской студенческой научной конференции (г. Казань, 2006), 2-й Российско-Китайской научной конференции «Фундаментальная фармакология и фармация - клинической практике» (г. Пермь, 2006), 61-й региональной конференции по фармации и фармакологии (г. Пятигорск, 2006), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в
том числе четыре статьи, из них две в ведущих рецензируемых научных
журналах, определенных Высшей атгестационной комиссией: «Проблемы
экспертизы в медицине», «Судебно-медицинская экспертиза».
Основные положения, выносимые на защиту:
Результаты теоретического обоснования и экспериментальных
исследований по определению азалептина на предварительном- и
подтверждающем этапах судебно-химического исследования
биологического материала с использованием современных физико-
9 химических методов.
Оптимизация условий изолирования из биологических объектов (кровь, моча, желчь, печень и другие внутренние органы и ткани) и очистки азалептина.
Результаты разработки методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ - и ИК - спектрофотометрии.
Схемы судебно-химического исследования биологического материала при отравлении азалептином.
Изменение рубрикации положения азалептина (клозапина) в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 125 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4-х глав), общих выводов, содержит 17 рисунков и 31 таблицу, список литературы, включающий 125 источников, из которых 27 — иностранных, приложения.
Номенклатура и положение азалептина в Международной статистической " классификации болезней, травм и причин смерти (МКБ)
Фармакодинамика рассматривает вопросы о действии препарата на организм, изучая механизмы действия, соотношение между структурой и активностью.
Для количественной оценки воздействия лекарственного средства азалептина, значение имеют три вида зависимости: доза - эффект, время -эффект, доза - время. Объективным критерием тяжести острых отравлений азалептином является его концентрация в крови больных, определяемая при отравлении.
Являясь атипичным нейролептиком, азалептин практически не вызывает экстрапирамидных расстройств, усиливает центральные эффекты седативных, наркотических, анальгетических, снотворных и противогистаминных средств, алкоголя, ослабляет - леводопа; всасывание препарата ухудшается при приёме антацидов и холестирамина [54].
Антипсихотическое действие обусловлено блокадой дофаминовых D1-, D2-, D4-penenTopoB мезолимбической и мезокортикальной системы.
Седативное действие обусловлено блокадой адренорецепторов ретикулярной формации ствола головного мозга; противорвотное действие -блокадой дофаминовых Б2-рецепторов триггерной зоны рвотного центра; гипотермическое действие - блокадой дофаминовых рецепторов гипоталамуса.
Оказывает периферическое и центральное м-холиноблокирующее, ос-адреноблокирующее действие [77, 93].
Основой патогенеза острых отравлений азалептином являются его фармакокинетические и фармакодинамические особенности как атипичного нейролептика, обладающего холиноблокирующим, адреноблокирующим, дофаминоблокирующим, антисеротониновым и антигистаминным эффектом, что при действии токсической дозы препарата вызывает целый ряд нарушений функций центральной и периферической нервной системы с последующим расстройствами гомеостаза, которые проявляются нарушениями показателей иммунитета, гемореологии, перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты крови, биогенных аминов и развития эндотоксикоза [10, 27].
В последние годы прослеживаются тенденции по увеличению случаев отравления азалептином в Свердловской области, Пермском крае и других регионах страны.
Фармакокинетика азалептина определяется следующими процессами: абсорбцией, распределением, биотрансформацией и экскрецией.
Элиминация включает удаление препарата путем биотрансформации и экскреции, клиренс - мера скорости элиминации, клиренс является показателем объема крови или плазмы, полностью освобождающего от лекарственного вещества азалептина за определенный период времени. Он состоит из почечного клиренса нативпого лекарственного вещества и клиренса другими путями, например, желчью.
Абсорбируется преимущественно неионизированная фракция, следовательно, азалептин частично всасывается в кислой среде желудка, и затем в щелочной среде кишечника [45, 99]. Для азалептина объем распределения (Vd) - 2 л/кг до 9 л/кг, в других источниках 1,6 и 5 л/кг, объем распределения характеризуется отношением общего содержания вещества в организме к его содержанию в плазме [101, 124].
Азалептин - производное дибензодиазепина, хорошо всасывается из пищеварительного тракта, механизм всасывания - простая диффузия.
Попадая в кровь, азалептин на 95% связывается с белками плазмы крови [19], поэтому скорость абсорбции достаточно высока (градиент концентрации направлен в кровь).
Распределение азалептина по органам происходит в 3 стадии: 1-я характеризуется падением концентрации вещества в крови и накоплением в паренхиматозных органах; во 2-й идет накопление во всех органах; 3-я самая продолжительная по времени - характеризуется накоплением соединения в органах выделения (печени, почках) с одновременным уменьшением концентрации в остальных тканях [73, 106, 117].
Наибольшее количество вещества концентрируется в желудочно-кишечном тракте, печени, почках.
Азалептин активно связывается с белками крови и проявляет сродство к жировым тканям, в которых накапливается. Азалептин имеет достаточно длинный период полувыведения - 7 10 часов (7 4,5-7,5 ч. [101], 7 6 до 17 ч. [76]). Время полувыведения 7 азалептина подвержено большим колебаниям, после приема однократной дозы 75 мкг - 8 часов (в интервале от 4 до 12 ч.), при приёме по 100 мкг 2 раза в сутки - 12 часов (в интервале от 4 до 66 ч.) [15, 19, 100].
Физико-химические свойства азалептина
Биологические объекты, изъятые из трупного материала: кровь, печень, моча — перед приготовлением модельных смесей контролировались на наличие фона, выделяемых веществ из биоматриц и их возможного влияния на результаты исследования, в зависимости от используемой методики исследования.
Кровь представляет собой коллоидно-полимерный раствор, в котором вода является растворителем, соли и низко-молекулярные органические веществ плазмы - растворенными веществами, а белки и их комплексы — коллоидным компонентом, среднее значение рЫ крови 7,4. Моча в судебно-медицинском отношении имеет важную роль при диагностике отравлений разной степени тяжести и смертельных отравлений. Величина относительной плотности мочи (относительно воды) в норме колеблется от 1,001 до 1,040 и связана с суммарным содержанием в моче фосфорной кислоты, пигментов, глюкозы, белков, мочевины, ионов натрия, хлора и др. молекул веществ. Большое значение имеет кислотность мочи, эта величина связана с состоянием кислотно-щелочного равновесия, обычно величина рН мочи колеблется в пределах от 5,0 до 7,0. В состав желчи экскретируются конечные продукты обмена гемоглобина, холестерина. Главными компонентами желчи являются: соли желчных кислот, фосфолипиды, белки, холестерин. Удельный вес печеночной желчи составляет 1,01 и имеет щелочную реакцию рН 7,5-8,0, а пузырной желчи удельный вес - 1,04 и реакция рН среды близка к нейтральной 6,0-7,0. Особенностью желчи является то, что в её составе могут экскретироваться разнообразные вещества, поступающие в организм: различные ксенобиотики, лекарственные вещества, антибиотики. Печень выполняет многообразные функции, важнейшими из которых являются гомеостатическая, метаболическая, экскреторная, барьерная, детоксицирующая и депонирующая. Осуществление этих функций и участие печени в обмене веществ (белков, углеводов, липидов, ферментов, витаминов) возможны благодаря тесной связи печени с другими внутренними органами и кровью.
Уровень токсических веществ и их метаболитов в биологических объектах неодинаков вследствие биохимических изменений, что особенно важно для токсических веществ, в значительной степени связывающихся с белком. С точки зрения присутствия эндогенных соединений в биологическом материале их состав очень разнообразен, экстрагируясь, эти соединения играют отрицательную роль при проведении судебно— химического исследования.
Согласно Приказу МЗ РФ № 161 «Об утверждении инструкции по организации и производству экспертных исследований в бюро судебно-медицинской экспертизы» от 24 апреля 2003 г, для проведения судебно-химического исследования при подозрении на отравление ядовитым веществом направляют комплекс внутренних органов: содержимое желудка, одну треть печени, желчь, одну почку, а также всю мочу (не более 200 мл) и 200 мл крови [30, 66, 71, 79, 82].
В модельных опытах использовали: - трупный биологический материал после проверки объектов на возможное присутствие каких-либо лекарственных веществ в них методом ГХ с масс селективным детектором; - трупный биологический материал (внутренние органы и ткани - желудок, печень, биологические жидкости - кровь, моча, желчь), направленный на исследование, после обнаружения в нём азалептина. Образцы биологического материала хранились при температуре ±4 С.
Модельные смеси (серии) биообъектов представляли собой мелкоизмельченную печень (25 г), кровь и мочу (25 мл), в которые было добавлено 2,5 мг субстанции азалептина. После приготовления модельные смеси выдерживали при комнатной температуре в течение 24 часов. Содержание азалептина в модельных смесях составило: для печени - 100 мкг/г, для мочи и крови - 100 мкг/мл. Нами было изучено влияние «фона» биоматрицы на «холостых опытах». Из 25 г (мл) модельных смесей биообъектов (кровь, моча, печень) осуществляли изолирование по предлагаемым нами методикам: модифицированной методике Стаса-Отто (метод изолирования спиртом, подкисленным щавелевой кислотой); усовершенствованной методике Васильевой (метод изолирования водой, подкисленной щавелевой кислотой); по методике кислотного гидролиза на группу алкалоидов опия; жидкость-жидкостной экстракцией крови и мочи. Из модельных смесей биологических объектов извлечения были получены в объеме 25 мл, отбирали аликвоты извлечений в объёмах 1/25 (1 мл) и 1/10 (2,5 мл), осуществляли исследования по изучению влияния соэкстрактивных веществ биологических матриц на результаты анализа методами УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГЖХ с детекторами ПИД, ТИД, МС.
Установлено, что эндогенные вещества используемых нами биологических матриц (кровь, моча, печень) существенно не мешали количественному определению азалептина в модельных смесях.
Разработка методики обнаружения и количественного определения азалептина на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методика разрабатывалась для идентификации и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, в извлечениях при судебно-химических исследованиях.
Для разработки методики анализа азалептина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимо было выбрать неподвижную фазу (сорбент), состав подвижной фазы, рабочую длину волны детектирования, скорость потока элюента, температуру колонки.
Хроматографическое исследование проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02», технические характеристики которого описаны в главе 2.
Установленная в жидкостном хроматографе «Милихром А-02» колонка с обращенно-фазовым сорбентом Силасорб 100-5 С18, который представляет собой силикагель, модифицированный фазой С18. Применение сорбентов с модифицированной поверхностью дает существенные преимущества по сравнению с разделением на не привитом силикагеле: равновесие сорбента с элюентом устанавливается быстро, что обеспечивает воспроизводимость результатов.
Сорбенты типа Силасорб используются в анализе широкого спектра лекарственных веществ, являются доступными и относительно недорогими.
Устройство жидкостного хроматографа «Милихром А-02» предусматривает термостатирование колонок в пределах температур 35-90 С. С повышением температуры ускоряются все диффузные процессы, улучшается растворимость соединений, пики становятся более симметричными, повышается селективность разделения, уменьшается вязкость растворителей, сокращается время анализа. В то же время высокая температура в колонке может способствовать разрушению некоторых термолабильных веществ и, кроме того, ускоряется процесс разрушения фазы, силикатная основа начинает или растворяться, или с неё начинает «сниматься прививка». Температура в колонке должна быть оптимальна и постоянна от анализа к анализу для достижения максимально возможной воспроизводимости удерживания. В экспериментах по выбору оптимальных условий хроматографирования остановились на базовой температуре 35 С, увеличение температуры колонки по отношению к базовой не привело к изменению спектральной кривой.
Для оптимального разделения компонентов и получения пиков симметричной формы необходим правильный выбор состава подвижной фазы. Подвижная фаза в жидкостных хроматографических системах выполняет двоякую функцию. С одной стороны, она обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке. С другой стороны, подвижная фаза играет активную химическую роль. Молекулы подвижной фазы взаимодействуют с другими компонентами: молекулами разделяемых веществ и молекулами неподвижной фазы. Поэтому более важная функция подвижной фазы сводится к регулированию констант равновесия и, соответственно, регулированию объема (времени) удерживания вещества. Замена одного растворителя на другой в составе подвижной фазы может изменить коэффициент ёмкости.
Основным растворителем в обращенно-фазовой хроматографии является вода, широко применяются спирты (метанол, этанол, изопропанол) в различных вариантах ВЭЖХ, метанол в применении более предпочтителен как менее вязкий растворитель, при использовании метанола в смеси вода-ацетонитрил можно работать при длине волны 200 нм.
Ацетонитрил (марки «для хроматографии», особо очищенный) имеет ряд преимуществ перед метанолом: позволяет работать в ближнем ультрафиолетовом диапазоне (190 нм), обладает хорошими растворяющими свойствами для проб, менее вязок в смеси с водой, чем метанол.
Азалептин в своей структуре содержит хромофорные группировки, которые обуславливают его поглощение в УФ-области спектра. Исходя из спектра поглощения азалептина, в качестве рабочей длины волны нами была выбрана — 240 нм, максимум абсорбции спектра, при которой СФ-детектор имеет достаточный отклик при масштабе регистрации 0.4 —1.0 ед. оптической плотности на шкалу самописца.
Использование ИК-спектрофотометрии в исследовании азалептина
Изолирование азалептина при судебно—химическом анализе в биологических объектах (жидкостях, тканях и органах трупов) разработано недостаточно. Нами были выбраны следующие направления проведения исследований: выбор наиболее предпочтительного метода изолирования азалептина из биологического материала для различных объектов исследования; получение максимального выхода вещества при использовании того или иного метода изолирования; выбор массы навески и природы органических растворителей для проведения экстракции азалептина; вида очистки извлечений после изолирования азалептина из биологического материала.
Методы изолирования включают два важных этапа - собственно извлечение и очистка.
Следует отметить, что не всегда при судебно-химических исследованиях есть указание на отравление психотропными препаратами, в том числе азалептином (ненаправленное исследование). А значит, приходится исходить из опыта работы и экспертной практики, т.е. обнаружение азалептина проводится по так называемому «общему ходу» судебно-химического исследования с применением тех методов, которые наиболее часто применяются в анализе.
Нельзя опустить и тот факт, что каждый судебно-медицинский эксперт самостоятельно выбирает тот или иной метод, а может быть, и несколько методов изолирования веществ, послуживших причиной отравления, исходя из представленных ему материалов и объектов исследования. Эти факторы во многом обуславливают выбор метода изолирования и направления поиска.
Перед нами стояла задача тщательного изучения имеющихся в распоряжении экспертов методик изолирования для решения вопросов их усовершенствования и модификации применительно к азалептину.
Мы проводили исследования на модельных смесях и экспертном материале. Работа с модельными смесями показала общие потери в ходе проведения изолирования.
Мы приготовили модельные смеси с «затравкой» азалептином с концентрацией 100 мкг/мл в исследуемой пробе трупного материала (кровь, моча, печень). Количественное определение проводили после изолирования следующими соответствующими методами: подкисленной водой по методу Васильевой; подкисленным спиртом по методу Стаса-Отто; после кислотного гидролиза; жидкость-жидкостной экстракцией. Контроль выхода (определение содержания азалептина в полученных извлечениях) осуществляли следующими методами: УФ-спектрофотометрией; Газо-жидкостной хроматографией с масс-селективным детектором. Метод изолирования азалептина подкисленной водой по методу Васильевой является одним из наиболее часто применяемых при судебно— химических исследованиях.
Нами внесены следующие изменения, которые улучшили основные характеристики метода: уменьшение навески для исследования (25 г биообъекта вместо 100 г), фильтрация вместо процеживания, введение процесса центрифугирования, экстракционная очистка эфиром при рН 2 (вместо применяемого в этом методе хлороформа) от соэстрактивных веществ биоматрицы, последующую трехкратную экстракцию хлороформом при рН=9 порциями 20x15x15 мл (время каждой экстракции 15 мин.).
Эти изменения несколько удлиняют процесс изолирования по времени, но вносят значительное улучшение в его эффективность за счет более тщательной очистки извлечения от балластных веществ, которые в большом количестве присутствуют в водной вытяжке.
Методика изолирования азалептина подкисленной водой по методу Васильевой применима для измельченных тканей и органов, о чем свидетельствуют результаты проведенных исследований азалептина на модельных смесях (табл. 18, 19).
