Введение к работе
1.1. Актуальность темы.
Одной из важных задач здравоохранения является полное и всестороннее удовлетворение потребностей населения в лекарственных средствах. В Государственном реестре лекарственных средств и изделий медицинского назначения лекарственное растительное сырье, продукты его переработки и препараты растительного происхождения занимают 35%.
Высокая потребность в лекарственном растительном сырье требует увеличения объема заготовки и сбора его от дикорастущих и культивируемых растений. По ряду причин заготовка дикорастущих лекарственных растений является экономически невыгодным. Расширение сырьевой базы возможно за счет введения в культуру дикорастущих лекарственных растений.
Лапчатка прямостоячая (л.прямостоячая), широко используемое в медицине как вяжущее, противовоспалительное, кровоостанавливающее средство для наружного и внутреннего применения. В других областях народного хозяйства корневища лапчатки используют как краситель для тканей, пряность в пищевой, рыбной и ликероводочной промышленности, а также являются предметом экспорта. Ежегодная потребность медицины в сырье лапчатки составляет 35 тонн. Удовлетворяется она менее чем на 30%. Заготовку сырье данного вида проводят в природных популяциях. В природе л. прямостоячая встречается рессеяно. не образует плотных зарослей. В качестве сырья используют подземные органы, что отрицательно сказывается на воспроизводстве этого вида, для него реальна угроза истощения природных запасов.
1.2. Цели и задачи исследования.
Основная цель исследования - изучить изменчивость содержания биологически активных веществ (БАВ) лапчатки в природных образцах и в условиях интродукции для получения доброкачественного лекарственного растительного сырья в соответствии с требованиями ГОСТ 6716-71 "Корневища лапчатки".
Для достижения намеченной цели поставлены следующие задачи: - выбрать хозяйственно-ценные популяции, изучить накопление дубильных веществ в л.прямостоячей, произрастающей в пределах ареала на Среднем и Южном Урале.
установить зависимость между морфометрическими показателями растения и накоплением дубильных веществ в корневищах лапчатки;
выбрать метод количественного определения дубильных веществ, флавоноидов и кумаринов для серийного анализа сырья;
сравнить накопление БАВ в природных и интродуцируемых растениях;
определить содержание БАВ по вегетативным органам растения;
установить влияние сроков и способа посадки, способа размножения, площади питания, внесения минеральных удобрений, способа сушки на накопление БАВ в инродуцируемых растениях;
- определить оптимальные условий накопления БАВ в сырье в
соответствии с требованиями ГОСТ 6716-71 в условиях интродукции.
І-.3^Научная новизна результатов.
Впервые; - изучено накопление дубильных веществ в л. прямостоячей, произрастающей в переделах ареала на Среднем и Южном Урале с учетом влияния географического фактора и условий произрастания;
установлена связь между морфометрическими показателями растения и накоплением дубильных веществ в корневищах лапчатки;
определено накопление БАБ по вегетативным органам растения;
изучена изменчивость накопления БАБ лапчатки в условиях интродукции под влиянием факторов: сроки и способы посадки, способы размножения, площадь питания, внесение минеральных удобрений, продолжительности нахождения в интродукции.
1.4.Практическая значимость работы.
На территории Среднего и Южного Урала выявлены экосистемы, в которых л. прямостоячая образует хозяйственно-ценные популяции.
Установлена возможность использования морфомерических показателей - количество стеблей, для заготовки доброкачественного сырья корневищ лапчатки с сохранением структуры заросли.
Выявлены оптимальные условия возделывания л. прямостоячей на Среднем и Южном Урале для получения доброкачественного лекарственного сырья.
На основе этих данных составлены рекомендации по возделыванию л.прямостоячей на Среднем и Южном Урале и рекомендации для заготовителей.
1.5.Публикация материалов исследования и апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 7 работ. Материалы диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Пермской Государственной Фармацевтической Академии.
1.6. Структура ..работы^
Диссертация состоит из введения, четырех глав, общих выводов, списка литературы и приложения. Материал изложен на 159 страницах, список литературы включает 152 литературных источников, из них 5 на иностранном языке; иллюстрирован 2 картосхемами, 12 рисунками, 30 таблицами, которые объединяют данные метрологических характеристик методов количественного определения, результатов фитохимического анализа сырья л. прямостоячей, произрастающей в естественных условиях и интродукции.
2.1. Объект исследования - л.прямостоячая, произрастающая в
природных популяциях различных экосистем в пределах ареала на
Среднем и Южном Урале и в интродукции.
Опыты по интродукции заложены в Свердловской области в Ботаническом саду Института леса Уральского отделения Академии Наук России с 1985 года. Химическая характеристика л. прямостоячей в интродукции изучена в Пермской фармацевтической академии. Биологические исследования проводил научный сотрудник Ботанического сада, кандидат биологических наук Е. С. Васфилова.
Для исследования было заготовлено сырье: корневища, как офи-цинальный вид и трава, как перспективный вид сырья л. прямостоячей, произрастающей в естественных природных популяциях и интродукции.
Сырье собирали и сушили в соответствии с инструкцией по заготовке, так и в соответствии с поставленными задачами.
Исследования проводили с 1985 года по 1991 год включительно. Всего проанализировано 2100 образцов сырья.
2.2. Методы исследования.
Количественный содержание дубильных веществ в сырье из природных популяций определяли методом Левєнталя в модификации Кур-санова по методике ГОСТ 6716-71 и ГФ XI. Количественный анализ
сырья интродуцируемых растений проводили фотоколориметрическим методом, основанном на определении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в результате реакции полифенольных соединений с реактивом Фолина-Дениса до и после осаждения дубильных веществ кожным порошком. Содержание дубильных веществ расчитывали с учетом разности концентраций суммы полифенольных соединений и простых полифенольн ых соединений в пересчете на катехин. Здесь же определяли содержание суммы водорастворимых полифенольных соединений. Количественное содержание дубильных веществ конденсированной группы определяли гравиметрическим методом после пробы Стиасни в извлечении, полученном для фотоколориметрического определения. Для определения количественного содержания флавоноидов использовали метод дифференциальной спектрофотометрии. Содержание кумаринов в сырье определяли гравиметрическим методом. Для качественного анализа сырья использовали метод бумажной и тонкослойной хроматографии и специфические реакции на флавоноиды и ку-марины. Все результаты исследования обработаны статистически, общепринятыми методами. Влияние факторов устанавливали методом од-нофакторного дисперсионного анализа. Обработка выполнена на ДВК-3.1.
3.1.Методы определения полифенольных соединений в сырье.
Для оценки качества сырья л.прямостоячей в интродукции необходим точный, универсальный, быстрый и экономичный метод. Существует около 100 методов количественного определения дубильных веществ. ГОСТ 6716-71 "Корневища лапчатки" регламентируют перманганатометрический метод анализа. Для сравнительной оценки методов ипользовали три: перманганатометрический, комплексонометрический и фотоколориметрический. Сравнивали экономические показатели, результаты хронометричёких исследований и количественного определения. Более дорогостоящий, длительный и трудоемкий в исполнении комплексонометрический метод. Самый простой, дешевый и быстрый в исполнении перманганатометрический метод. Промежуточное положение по этим показателям занимает фотоколориметрический метод. Сравнение полученных результатов количественного определения показало, что перманганатометрический метод дает наиболее завышенные ре-
зультаты по сравнению с другими методами. Данные, полученные этим методом совпадают в пределах отклонения с таковыми, полученными фотоколориметрическим методом для суммы полифенольных соединений. Однако, они резко отличаются от результатов количественного определения дубильных вещетв, полученных комплексонометрическим и фотоколориметрическим методами как для корневищ, так и для травы. Отличия этих результатов между собой в пределах допустимых отклонений (Табл. 1). Фотоколориметрический метод даст возможность определить количественное содержание суммы водорастворимых полифенольных соединений, дубильных веществ, в том числе конденсированных группы. Для сырья л.прямостоячей установлено оптимальное время экстракции - в сумме 35 минут (20+5+5+5), время устойчивости реакции с реактивом Фолина-Дениса - 10 минут.
Разработана методика количественного определения суммы фла-воноидов в траве и корневищах л.прямостоячей. Спектрофотометри-ческий метод, предложенный В.В.Беликовым, Т. В. Точковой и Н.Т.Колесник для сложных растительных объектов, позволяющий устранить влияние сопутствующих полифенольных растительных веществ проведением реакции комплексообразования с хлоридом алюминия в слабокислой среде при рН 3 в 50-95% растворе этилового спирта был адаптирован применительно к сырью л. прямостоячей. Экспериментально установлено: - оптимальный экстрагент 70Ж этиловый спирт. Для этого извлечение из сырья в соотношении 1:10 этиловым спиртом разной концентрации хроматографировали восходящим способом на бумаге в системе растворителей бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 4:1:5. Выводы о полноте экстракции делали по количеству пятен флавоноидной природы и интенсивности их флюоресценции в УФ-лучах до и после проявления парами аммиака; - максимум поглощения - 400 нм; - измельчение сырья до частиц в 1 мм; - полнота извлечения при трехкратной экстракции.
Установлена идентичность кумаринов травы и корневищ л. прямостоячей методом тонкослойной хроматографии. По значению Rf в трех системах растворителей, флюоресценции в УФ-лучах пятен кума-риновой природы до и после проявления специфическими реактивами установлено содержание кумарина, умбеллиферона и скополетина как в траве, так и в корневищах.
3.2. Химическая характеристика л. прямостоячей из природных популяций
У л. прямостоячей, произрастающей в Европейской части ареала максимальный прирост биомассы и накопление дубильных веществ приходится на 4-5 годы жизни. При заготовке сырья не учитывается возраст растения, что приводит к нарушению структуры заросли и истощению запасов сырья. Исследования зависимость морфометричес-кого показателя - количество стеблей от возраста растения, накопления дубильных веществ и биомассы корневищ проводили в ценопопу-ляции на белоусовом лугу. Раъчитан эксплуатационный запас сырья с заросли, собраны модельные экземпляры. Для каждой особи определили количество стеблей, возраст и массу корневища. Для особей каждого возраста и с конкретным количеством стеблей определили содержание дубильных веществ.
Установлено, что в заросли преобладают особи одно-, дву-, и пятилетнего возраста. Особи более старшего возраста не обнаружены. Количество стеблей на модельных экземплярах от 1 до 14. Причем у одно- и двулетних особей от 1 до 7 стеблей, а у пяти летних - от 6 до 14. Содержание дубильных веществ в корневищах особей одного возраста изменяется незначительно. При этом на второй и последующие годы жизни растения это значение более 20%, что удовлетворяет требованиям ГОСТ на корневища лапчатки (не менее 20%). Зависимость количества стеблей от массы растения не установлено. Но на массу сырья существенное влияние оказывает возраст растения. Особи с 7 стеблями и содержанием дубильных веществ более 20 составляют 32% заросли. Эксплуатационный запас сырья этой категории растений равен 9 кг, что соответствует примерно 2/3 эксплуатационного запаса с заросли. Таким образом заготовка сырья от растений не менее чем с 7 стеблями способствует сохранению молодых особей, структуры заросли и возобновлению запасов.
Для интродукции растений необходимо выбрать хозяйствен-цен-ные популяций. Для этого исследовали накопление дубильных веществ в корневищах л. прямостоячей из различных экосистем на территории Среднего и Южного Урала (в пределах ареала) по обоим макросклонам Уральских гор. Вся исследуемая территория условно разделена на Европескую и Азиатскую части по Уральскому хребту. Обе части разделены с севера на юг на три равные (по географической широте) зоны (I, II, III). Условно принято, что зона II - центр ареала. Запад-
ная и восточная границы района исследования проходят по 56 и 65 в.д. Сырье л.прямостоячей собирали в районах естественного произрастания. В соответствий ' с данными И.Л.Крыловой и В.И.Капоровой выделили пять экосистем, к которых л. прямостоячая образует продуктивные заросли: 1 - осинники и березняки злаково-разнотравные, 2 - сосняки зеленомошные и долгомошные, 3 - белоусовые луга. 4 -злаково-разнотравные луга, 5 - заболоченные луга (Табл.2). В северных (I) и южных (III) зонах собирали сырье в ценопопуляциях, максимально приближенных к границам ареала.
Установлено, что в пределах девяти градусов геграфической широты в Европейской части ареала содержание дубильных веществ в корневищах лапчатки колеблется от 24, 0% на северной границе до 21,4% на южной границе и 20,3% в центре ареала (средние значения) . В Азиатской части ареала в пределах четырех градусов географической широты это колебание от 25, 57 на северной границе до 24,0% на южной границе и 23,2% в центре ареала (Табл.2). В целом влияние географической широты на накопление дубильных веществ в корневищах лапчатки на Европейской и Азиатской части исследуемой территории статистически недостоверно. Влияние экспозиции на накопление дубильных веществ в корневищах лапчатки выявлено на южной границе (тіЕ =50,1%, ) и не выявлено на северной границе (if =20,4%, F=2,05) и в центре ареала (if =34.3%, F=4,18). В целом влияние экспозиции на накопление дубильных веществ в корневищах л. прямостоячей, произрастщей на Среднем и Южном Урале но установлено (т|2=45.9%, F=3,4).
Условия произрастания существенно влияют на накопление дубильных веществ в корневищах л. прямостоячей в Европейской части и не выявлено влияние этого фактора на Азиатской части исследуемой территории. Содержание дубильных веществ здесь колеблется в пределах допустимых отклонений.
Почти во всех исследуемых ценопопуляциях сырье соответствует требованиям нормативного документа по содержанию дубильных веществ
Исследования накопления полифенольных соединений в траве, корнях и корневищах л.прямостоячей из пяти природных популяций (см. выше) показали неравномерное распределение их по органам растения. В корневищах и корнях в больших количествах, по сравнению с травой, накапливаются водорастворимые полифенольные соединения (ВРПФС), дубильные вещества, с преобладанием конденсирован-
Таблица 1. Содержание дубильных веществ (56) в сырье л.прямостоячей, установленное различными методами количественного определения
перманга-натомет-рический ТГФ XI)
Таблица 2. Накопление дубильных веществ в корневищах л.прямостоячей, произрастающей на Среднем и Южном Урале в пределах ареала.
%
Таблица 3. Накопление полифенольных соединений по органам растения
- и -
ной группы и в меньших количествах флавоноиды и кумарины. Корни л.прямостоячей отвечают требованиям ГОСТ 6716-71 "Корневища лапчатки" по содержанию дубильных веществ (см. сравнительную характеристику методов количественного определения). Близок по значению этот показатель и у корней. Высокое содержание всех групп полифенольных соединений в траве лапчатки (Табл. 3).
3.3. Химическая характеристика л. прямостоячей в интродукции.
Установлено, что корневища л.прямостоячей в интродукции накапливают больше полифенольных соединений, чем в естественных условиях произрастания. Содержание водорастворимых полифенольных соединений увеличивается с 23,4'/ в природе до 34,1% в интродукции, дубильных веществ с 17,3% до 26,8 и конденсированных дубильных веществ с 13,1% до 19,5% соответственно. При этом доля дубильных веществ в водорастворимом полифенольном комплексе и конденсированной группы в сумме дубильных веществ не изменяется. Содержание флавоноидов и кумаринов также увеличивается в интродукции с 1,08? до 1,82% и с 0,76* до 1,16? соответственно.
При семенном размножении в корневищах и траве наблюдается положительная динамика накопления всех групп полифенольных соединений с возрастом растения. Резко увеличивается их содержание ко второму году и мало изменяется к четвертому году жизни. Поскольку на второй год сильно увеличивается масса корневищ и травы, то увеличивается и абсолютное содержание полифенольных соединений в сырье: в корневищах и траве соответственно - водорастворимых полифенольных соединений с 2, 2 г до 8,2 г и с 1,1 г до 1,5 г; дубильных веществ с 1,3 г до 5,1 г и с 0,3 г до 0, 4 г; флавоноидов с 0.08 г до 0.3 г и 0,47 г до 0,67 г; кумаринов с 0.06 г до 0.24 г и сО, 28 г до 0,35 г.
При вегетативном размножении рассматривали влияние вертикального и горизонтального способа посадки черенков на накопление полифенольных соединений. Максимальное накопление суммы водорастворимых полифенольных соединений и дубильных веществ в корневищах при горизонтальной посадке черенков - 30, 2% и 20,2% соответственно. Минимальное - при горизонтальной посадке, соответственно 21,4% и 17,4%. По содержанию суммы водорастворимых полифенольных соединений корневища первого года жизни растения при всех способах посадки отвечают требованиям нормативного документа на корне-
вища лапчатки. Доля дубильных веществ в полифенольном комплексе во всех случаях более 61,5%.
Аналогична динамика накопления флавоноидов. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается при горизонтальной посадке черенков - от 1,655 на первый год, до 1,9% на третий год жизни. Содержание кумаринов в корневищах мало изменяется и по возрасту, и в зависимости от способа посадки. Способ посадки существенно влияет на накопление водорастворимых полифенольных соединений (/=68,47, F=12,8) и флавоноидов (/=59,4. F=7,12). Нет влияния этого фактора на накопление дубильных веществ (/=21,4. F=l,82) и кумаринов (/ = 11,7%, F=0.83)
Способ размножения не влияет на накопление водорастворимых полифенольных соединений (if=25,2%, F=0,81), дубильных веществ (/=32,7. F-2.51), флавоноидов (/=16,4%, F-1,54) и кумаринов (/=3,5%, F=i,07).
Учитывая трудоемкость семенного воспроизводства л. прямостоячей в интродукции, при равной динамике накопления полифенолиных соединений можно рекомендовать для получения качественного сырья "Корневищ лапчатки" вегетативный способ размножения с горизонтальной посадкой черенков
Сезонную динамику накопления полифенольных соединений изучали на сырье, собранном в интродукции в разные фазы развития растения: 1 - отрастания надземной части, 2 - массовой бутонизации -начала цветения, 3 - массового цветения - начала плодоношения. 4 - отмирания надземной части (Табл. 4). Максимальное накопление водорастворимых полифенольных соединений происходит в период бутонизации - начала цветения и цветения - начало плодоношения, что совпадает с динамикой накопления этих групп БАВ в корневищах л. прямостоячей в естественных условиях произрастания. В период отмирания надземной части растения содержание дубильных веществ несколько меньше, но содержание флавоноидов и кумаринов максимальное. Влияние фактора сезонности на накопление всех изучаемых групп полифенольных соединений существенно и достоверно.
Сроки посадки: весной, летом, ранней осенью (осснь-1) и поздней осенью (осень-2), существенно и достоверно влияют на накопление суммы водорастворимых полифенольных соединений (/=73,5%. F=l_2.74). дубильных веществ (/=71,67, F=H,_13), конденсированных дубильных веществ (/= 59.3%, F=26JJ[), влияет на
Таблица 4. Сезонная изменчивость накопления полифенольных соединений в корневищах л.прямостоячей.
Сумма ВРПФС
%
Флаво-ноиды
Таблица 5. Накопление полифенольных соединений в корневищах л. прямостоячей в зависимости от сроков посадки.
Сумма ВРПФС
Флаво-ноиды
Таблица 6. Абсолютное содержание полифенольных соединений на 1 м* площади.
г/м2 сырья
накопление кумаринов (лс=47,7%, F=6J31) и не влияет на накопление флавоноидов (ііг=18,1%, F-4.47). В корневищах растений, высаженных весной и глубокой осенью наблюдается стабильное увеличение содержания всех групп полифенольных соединений, при этом их накопление максимально. Разница в содержании этих веществ при обоих сроках посадки незначительная, в пределах допустимых отклонений. При летней и осенней-1 посадках стабильности в накоплении полиф->ных соединений не наблюдается (Табл. 5).
Лапчатка прямостоячая конкурентно слабый вид. В условиях питомника растение высаживали на площади 60 смг -Si, 30 смг - S2, 15 см2 - S3. Максимальное содержание полифенольных соединений в корневищах на площади питания в 30 смг и 15 см*\ минимальное - на 60 см2 в течении трех первых лет жизни растения. Так как, на четвертый год жизни у растений появляются признаки возрастной деградации и корневища начинают загнивать, а в первый год масса сырья от растений со всех площадей питания незначительна,то наибольший интерес представляют растения второго и третьего года жизни. Содержание всех групп полифенольныхсоединений резко увеличивается на второй год и незначительно, в пределах допустимых отклонений, уменьшается на третий год жизни, при этом абсолютный выход их с 1 м2 больше на площади питания 30 см2 на второй год (Табл. 6). Установлено существенное и достоверное влияние площади питания на накопление полифенольных соединений в течении трех лет жизни растений.
Внесение минеральных удобрений, содержащих марганец и медь существенно и достоверно влияет на накопление всех групп полифенольных соединений {т)2=69,2%, F13,16 и п2= 54.8%, F»6.17 соответственно). Прирост суммы ВРПФС на первый год составил при внесении MnS04 - 31,6% и CuS04 - 26.0%, дубильных веществ - 26,1% и 18,9% соответственно. На второй и третий годы прирост в содержании ВРПФС снизился до 13,9% и 20,5% соответственно, для дубильных веществ он остался без изменений. Для флавоноидов и кумаринов в течении трех лет прирост составлял около 30%.
ВЫВОДЫ
1. На Среднем и Южном Урале л.прямостоячая образует хозяйственно продуктивные популяции с высоким содержанием дубильных ве-
- IS -
ществ.
-
Содержание БАВ зависит от условий произрастания и максимальное накопление дубильных веществ в растительных сообществах: белоусовые и заболоченные луга.
-
Контрольный показатель для заготовки доброкачественного по содержанию дубильных веществ сырья - количество надземных побегов на одной особи семь и более.
-
Корневища, корни и трава л. прямостоячей естественных мест произрастания на Урале накапливают водорастворимые полифенольные соединения, дубильные вещества, флавоноиды и кумарины. Впервые установлено количественное содержание конденсированных дубильных веществ, флавоноидов и кумаринов в подземных органах и траве л.прямостоячей.
-
Разработана методика количественного определения флавоноидов в корневищах и траве л.прямостоячей.
-
Накопление биологически активных веществ в органах л. прямостоячей неравномерно: корневища содержат больше водорастворимых полифенольных соединений, дубильных веществ , в том числе конденсированной группы, трава содержит больше дубильных веществ гидро-лизуемой группы, флавоноидов и кумаринов. В корнях л.прямостоячей содержание биологически активных веществ близко к таковому в корневищах, но несколько меньше по абсолютному содержанию.
-
Высокое содержание биологически активных веществ в корнях л. прямостоячей, в том числе водорастворимых полифенольных соединений и дубильных веществ позволяет рекомендовать использовать их наряду с корневищами, внести изменения в существующую нормативную документацию, заменим "Корневиша лапчатки" на "Корневища с корнями лапчатки прямостоячей".
Е. Разнообразный химический состав травы предполагает широкий спектр Фармакологического действия и перспективу дальнейшего изучения и использования.
9. Установлены условия интродукции л. прямостоячей, обеспечивающие получение сырья с большим содержанием водорастворимых полифенольных соединений, дубильных веществ, в том числе конденсированной группы, флавоноидов и кумаринов при вегетативном размножении с горизонтальной посадкой черенков, на площади 15 см2 и 30 см', с внесением минеральных удобрений, содержащих марганец и медь, на второй-третий год пребывания в интродукции.
