Введение к работе
Актуальность темы. Одним из важных направлений медицинской и фармацевтической науки является поиск новых источников биологически активных соединений (БАС) с целью дальнейшего расширения производства фитопрепаратов различного спектра действия, которые характеризуются эффективностью и малой токсичностью, что позволяет использовать их длительное время для профилактики и лечения многих заболеваний без риска возникновения побочных явлений. Не менее важно и то, что некоторые природные БАС пока не могут найти синтетических аналогов. Однако потребность населения в препаратах природного происхождения удовлетворяется не полностью, в частности, это происходит из-за дефицита лекарственного растительного сырья (ЛРС) [Каухова И.Е., 2006].
Многие лекарственные растения (ЛР), применяемые отечественной традиционной медициной, уже давно не образуют промышленных зарослей, а некоторые являются редкими или исчезающими. Динамика ухудшения экологической обстановки, антропогенное воздействие на природные фитоценозы дикорастущих лекарственных видов также катастрофически сокращают их природные запасы. Рассматриваемая проблема актуальна и с позиций фармакоэкономики, т.к. для современного производства фитопрепаратов необходима гарантированная сырьевая база, которую в настоящее время, могут обеспечить растения, культура выращивания которых хорошо развита, так как они имеют определенное значение в качестве сырья для пищевой промышленности.
Новый подход к использованию в фармации некоторых культивируемых пищевых растений имеет ряд неоспоримых преимуществ: во-первых, это достаточная сырьевая база (опыт культуры выращивания, селекция, сортовой отбор с повышенным содержанием действующих веществ, высокий уровень агротехники, возможность размещения посадочных площадей в наиболее благоприятных почвенно-климатических и экологических зонах и т.д.). Во-вторых – исследуемые растения являются пищевыми, а, следовательно, безвредными для организма человека.
Анализ литературных данных показал, что многие пряно-ароматические растения содержат ряд ценнейших веществ и обладают различной фармакологической активностью. Следует отметить, что многие из них, такие, как куркума, имбирь, артишок, кунжут, момордика, пажитник и др., уже давно применяются в научной медицине многих стран и входят в их Фармакопеи (Европейская, США, Британская Травяная, Китайская и др.), что делает их приоритетными для включения в отечественную фармакопею [Смирнова Ю.А., Киселева Т.Л., 2009]. На основе их сырья создан целый ряд эффективных препаратов, однако в нашей стране из-за отсутствия соответствующих нормативных документов многие из них не используются в достаточной мере.
Литературные сведения о химическом составе изучаемого сырья нельзя считать полными, т.к. исследователей, как правило, интересовала та или иная группа химических соединений, имеющих пищевое значение, а не весь комплекс БАС, для некоторых видов сырья информация отсутствует, не указаны соединения, по которым следует проводить химическую стандартизацию сырья. За счет выявления новых групп БАС, более полной утилизации комплекса веществ из растительного сырья, можно расширить рамки использования не только новых видов сырья, но и уже официнального (плоды моркови дикой, семена кунжута восточного и пажитника сенного).
Актуальным является и совершенствование норм и контроля качества как исходного ЛРС, так и препаратов из него по основным группам БАС [Маркарян А.А., 2004] с привлечением наиболее современных и перспективных физико-химических методов. Проблема морфолого-анатомической диагностики растительного сырья для объективной оценки его подлинности, отличия от примесей и фальсификации также актуальна.
Фармакологические исследования по рассматриваемым видам сырья носят фрагментарный характер, так как проводились в отношении только некоторых групп БАС, большая часть данных имеет предварительное значение.
В настоящее время, в современной фармацевтической науке создалась противоречивая ситуация между необходимостью поиска новых источников природных БАС, существующими возможностями культивирования растений и отсутствием исследований, позволяющих внедрить в медицинскую практику новые растительные источники сырья. Все это приводит к выводу об актуальности полного фармакогностического изучения исследуемых видов растительного сырья как новых источников природных БАС.
Таким образом, изучение, освоение и использование культивируемых пищевых лекарственных растений открывает отчетливые перспективы для создания экономически выгодных, доступных, безопасных и терапевтически эффективных отечественных лекарственных препаратов, что, несомненно, совпадает с задачами, поставленными Российским правительством по развитию отечественной фармацевтической промышленности.
Цель работы. По итогам комплексного фитохимического изучения сырья культивируемых пищевых растений разработать научно-методическое обоснование их использования в качестве лекарственного растительного сырья и создания фитопрепаратов на их основе.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Проанализировать современное состояние исследований по химическим, биологическим и фармакологическим свойствам культивируемых ЛР, выделить и дать теоретическое обоснование необходимости и возможности их применения в медицинской практике.
Провести фитохимические исследования по группам биологически активных соединений: липиды, эфирные масла, углеводы, пептиды, фенольные соединения, а также макро- и микроэлементы.
Установить диагностические признаки ЛРС, разработать методики качественного и количественного определения основных БАС.
Обосновать показатели норм качества ЛРС и разработать нормативную документацию на лекарственное сырье наиболее перспективных растений и фитосубстанций на их основе.
Провести фармакологический скрининг некоторых фракций из растительного сырья.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность использования сырья культивируемых растений, имеющих пищевое значение: куркумы длинной, имбиря аптечного, моркови дикой, клоповника посевного, артишока колючего, пажитника сенного, момордики харантия, чернушки посевной, кунжута восточного, кмина тминового, перца однолетнего, полыни эстрагон в качестве источников ценных БАС, что доказывает перспективу расширения их использования в медицинской практике.
Впервые с помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ-МС, электрофореза и др.) проведено систематическое фитохимическое изучение основных групп БАС (углеводов, липидов, пептидов, эфирных масел, фенольных соединений, сапонинов и др.). Данные исследования показали значение различных классов соединений, что определяет развитие новых ресурсосберегающих технологий комплексного использования сырья при его промышленной переработке.
Определен качественный и количественный состав углеводов. Проведен анализ некоторых физико-химических характеристик пектинов. В результате проведенных исследований, впервые в качестве источников полисахаридов предложены новые виды сырья: околоплодник момордики харантия, корневища имбиря аптечного, корневища куркумы длинной, семена клоповника посевного, семена пажитника сенного, листья артишока колючего (технологический выход в пересчете на абсолютно сухое сырье данных видов составлял от 20 до 30 %).
Впервые изучен липидный комплекс семян пажитника сенного, момордики харантия, чернушки посевной, клоповника посевного, плодов моркови дикой, кмина тминового, корневищ имбиря аптечного и куркумы длинной с определением физико-химических показателей жирного масла, компонентного состава методом ГЖХ, ТСХ и ГХ-МС. В качестве потенциальных промышленных источников жирного масла могут быть использованы семена чернушки посевной (содержание липидного комплекса составляет до 35 %), семена клоповника посевного (до 20 %) и плоды артишока колючего (до 20 %). Наиболее ценными по составу являются жирные масла семян пажитника сенного и момордики харантия, что предопределяет перспективу изучения их фармакологических свойств, как ранозаживляющих, гепатопротекторных и гиполипидемических средств.
Разработана методика экстракции пептидов из семян кунжута восточного, момордики харантия, клоповника посевного, чернушки посевной, пажитника сенного, полыни эстрагон, перца однолетнего, плодов кмина тминового, моркови дикой и артишока колючего, на основе которой получены пептидные экстракты и установлен их аминокислотный состав. В результате анализа пептидных фракций методом ВЭЖХ определено количественное содержание каждого пептида и его молекулярная масса, что позволяет решать вопросы, связанные с идентификацией, контролем чистоты и количественным определением. Впервые из плодов кмина тминового, семян перца однолетнего, кунжута восточного получены биоактивные пептиды, установлена их фунгицидная и цитотоксическая активность.
Впервые проведено изучение с использованием метода ВЭЖХ фенольных соединений в образцах сырья: плоды моркови дикой, листья и плоды артишока колючего, семена пажитника сенного, корневища куркумы длинной и имбиря аптечного, семена и околоплодник момордики харантия, семена клоповника посевного. Всего в исследуемых объектах идентифицировали 30 соединений фенольной природы, относящихся к коричным кислотам, флавоноидам, простым фенолам, фенолокислотам, кумаринам и дубильным веществам.
Установлено, что такие растительные объекты, как листья и плоды артишока колючего, семена пажитника сенного, корневища куркумы длинной, околоплодник момордики харантия и семена клоповника посевного нужно рассматривать как ЛРС, в котором гидроксикоричные кислоты могут выступать в роли индикаторных компонентов, что предопределяет перспективу их медицинского использования и вопросы стандартизации сырья. В свою очередь, как источник флавоноидов можно рассматривать такие растительные объекты как: семена клоповника посевного, пажитника сенного, плоды моркови дикой и листья артишока колючего, как источники кумаринов – плоды моркови дикой, семена пажитника сенного, околоплодник момордики харантия, фенолокислот – плоды моркови дикой и артишока колючего, семена клоповника посевного и пажитника сенного, корневища куркумы длинной и имбиря аптечного.
Определен химический состав изучаемых образцов эфирного масла методом ГХ-МС: в эфирном масле корневищ имбиря аптечного идентифицированы 29 веществ; корневищ куркумы длинной идентифицировано 25 веществ; плодов моркови дикой – 18; семян чернушки посевной – 7; плодов кмина тминового из Узбекистана – 15, а из Марокко – 16 компонентов. Общее количество идентифицированных веществ составляло от 93 до 100 % всех компонентов масла. Изученные образцы эфирного масла отличались от литературных данных, как по составу, так и по количеству идентифицированных компонентов, в связи с чем показано, что проводить стандартизацию сырья, особенно имбиря аптечного, куркумы длинной и моркови дикой только по показателю «Эфирное масло» недостаточно.
Впервые проведены систематические исследования содержания куркуминоидов в корневищах куркумы длинной и кумаринов в плодах моркови дикой, выделенных из различных образцов сырья, которые послужили основой для разработки единых подходов к обнаружению данных соединений в ЛРС и решению проблемы стандартизации по группам БАС, привносящих наибольший вклад в биологическую активность суммарных препаратов.
Впервые предложены методика оценки качества корневищ куркумы длинной, достоверно устанавливающая содержание куркуминоидов с использованием метода ВЭЖХ и методика оценки качества плодов моркови дикой по содержанию кумаринов спектрофотометрическим методом.
На основании морфолого-анатомического исследования уточнены морфологические и выявлены диагностически значимые анатомические признаки, позволяющие проводить диагностику ЛРС: корневищ куркумы длинной (цельное сырье, измельченное, порошок), корневищ имбиря аптечного (цельное сырье, измельченное, порошок), плодов моркови дикой (цельное сырье и порошок), плодов кмина тминового (цельное сырье), семян пажитника сенного (цельное сырье), семян клоповника посевного (цельное сырье), плодов момордики харантия (цельное сырье), плодов артишока колючего (цельное сырье). Микродиагностические признаки плодов кмина тминового, момордики харантия, артишока колючего и семян клоповника посевного ранее не были описаны.
Впервые проведены фармакологические скрининговые исследования стандартизированных фитосубстанций на основе исследуемых видов сырья, что может являться рекомендацией для получения на их основе новых фитопрепаратов, обладающих отхаркивающим, гепатопротекторным, гипохолестеринемическим, антиоксидантным, антибактериальным и гипогликемическим действием.
На основании изучения данных литературы, химического состава и фармакологической активности исследуемых видов растительного сырья предложены научно-методические подходы к обоснованию использования сырья пищевых растений как источников новых лекарственных средств.
Практическая значимость работы. В результате фитохимического и фармакологического исследования доказана возможность и перспективность использования ряда пищевых растений в качестве новых источников биологически активных соединений, создания фитопрепаратов на основе различных групп БАС изученных растений.
Предложены новые виды ЛРС для включения в Государственную фармакопею России XII издания корневища куркумы длинной, корневища имбиря аптечного, семена пажитника сенного, плоды моркови дикой, листья артишока колючего.
Впервые установлены нормы качества сырья корневищ куркумы длинной, корневищ имбиря аптечного, плодов моркови дикой, листьев артишока колючего, семян пажитника сенного, которые легли в основу нормативной документации (ФС и ФСП).
Разработан унифицированный подход к стандартизации корневищ куркумы длинной, корневищ имбиря аптечного, плодов моркови дикой, листьев артишока колючего свежих, семян пажитника сенного в соответствии с современными требованиями и группой действующих БАС, которые включены в разработанную нормативную документацию (НД).
Для НД и оценки качества сырья, на основании проведенных фитохимических исследований разработаны и предложены методики ТСХ-анализа для корневищ куркумы длинной (куркуминоиды); семян клоповника посевного (кумарины); семян пажитника сенного (диосцин, диосгенин).
Разработаны методики количественного определения: куркуминоидов в корневищах куркумы длинной (спектрофотометрия и ВЭЖХ); кумаринов в плодах моркови дикой (спектрофотометрия); суммы гидроксикоричных кислот (в пересчете на кофейную кислоту) в листьях артишока колючего (спектрофотометрия) и в семенах клоповника посевного (в пересчете на хлорогеновую кислоту, спектрофотометрия); суммы фенольных соединений (в пересчете на 6-гингерол) в корневищах имбиря аптечного (спектрофотометрия); определения диосгенина и суммы фурастаноловых гликозидов в семенах пажитника сенного (спектрофотометрия).
Для определения куркуминоидов в корневищах куркумы длинной и кумаринов в плодах моркови дикой установлены валидационные характеристики (по параметрам специфичность, линейность, предел количественного определения, правильность, прецизионность), для других методов метрологические показатели.
Теоретически и экспериментально доказана целесообразность использования новых видов ЛРС: плоды момордики харантия, семена клоповника посевного, семена полыни эстрагон, семена перца однолетнего, семена чернушки посевной, плоды артишока колючего, плоды кмина тминового и семена перца однолетнего для применения в фармацевтической практике.
Показана возможность использования исследуемых видов растительного сырья в комплексных малоотходных технологиях получения современных лекарственных фитопрепаратов.
Материалы внедрения. На основании проведенных исследований разработаны НД для включения в Государственную фармакопею России XII изд.:
Фармакопейные статьи (ФС) «Куркумы длинной корневища» и «Моркови дикой плоды» (находятся на экспертизе в ФГУ «НЦ ЭСМП»);
Фармакопейная статья предприятия (ФСП) «Моркови дикой плодов экстракт жидкий» (Регистрационное удостоверение ЛРС – 005939/09-210709);
Фармакопейная статья (ФС) «Имбиря аптечного корневища» (подготовлена к рассмотрению);
Проекты ФСП «Артишока колючего листья» и «Пажитника сенного семена».
Результаты диссертационной работы включены в монографию Т.В. Орловской, М.В. Гаврилина, В.А. Челомбитько «Новый взгляд на пищевые растения, как перспективные источники лекарственных средств».
Получен патент РФ на изобретение (№ 2403566) «Способ количественного определения восстанавливающих сахаров».
Положения, выдвигаемые на защиту:
Теоретическое обоснование необходимости и возможности применения новых сырьевых источников в научной медицине на основании изучения их химического состава и фармакологической активности.
Результаты изучения химического состава 14 видов растительного сырья.
Обоснование норм качества некоторых исследованных видов ЛРС.
Результаты скрининговых фармакологических исследований.
Научно-методическое обоснование использования сырья пищевых растений, как источников новых лекарственных средств.
Апробация работы. Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на различных Международных, Всероссийских и региональных конференциях, в том числе на Международной научно-практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001), на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), на VII Интернациональном симпозиуме по химии природных соединений (Республика Узбекистан, г. Ташкент, 2007), на I Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии в пищевой промышленности» (Пятигорск, 2008), на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2010, 2011).
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава» по комплексной теме: «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (№ Гос. регистрации 01200906461).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 40 научных работах, в том числе в 1 патенте РФ на изобретение, 18 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 372 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», трех глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 71 таблица, 155 рисунков. Список цитируемой литературы включает 510 источников, из них – 212 на иностранных языках.
