Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9.
І.І.Общая характеристика семейства Бобовые 9
1.1.1. Ботаническая характеристика семейства Бобовые Leguminosae Juss. 9
1.1.2. Краткое анатомо-морфологическое описание отдельных представителей рода Pisum (Горох). 12
1.2. Характеристика некоторых белков рода Pisum. 16
1.3. Определение и общие характеристики лектинов гороха. 18
1.3.1. Использование лектинов. 29
1.4. Фармакодинамика лектинов у млекопитающих. 43
1.5. Заключение по литературному обзору. 45
Глава II. Ботаническое изучение различных сортов гороха посевного . 48
II. 1. Методика проведения полевых работ. 48
11.2. Камеральная обработка материала и методика анатомических исследований. 49
11.3. Изучение ритма сезонного развития различных сортов гороха посевного . 50
11.4. Морфологическая характеристика вегетативных органов различных сортов гороха. 59
11.5. Анатомо-диагностические признаки эпидермы листьев гороха. 63
Выводы 69
Глава III. Изучение химического состава различных сортов гороха посевного . 70
III.I. Материалы и методы. 70
III.2. Содержание флавоноидов в семенах и траве различных сортов гороха. 79
III.3.Содержание белка в семенах различных сортов гороха. 83
III.4.Аминокислотный состав белков семян различных сортов гороха. 84
III.5. Изучение химического состава семян и травы различных сортов гороха с использованием ГЖХ хроматографии масс-спектрометрии . 86
III.6. Изучение качественного и количественного состава лектинов семян различных сортов гороха. 92
III.7. Электрофорез лектина гороха. 95
III.8. Определение специфичности связывания лектина по сахарам методом проточной цитофлуорометрии. 97
Выводы 100
Глава IV. Изучение биологической активности лектинов гороха 101
IV. 1. Препараты и реактивы. Методы исследования. 101
IV.2. Изучение фармакологической активности лектина гороха. 106
IV.3. Изучение хронической токсичности лектина гороха при его введении per os. 108
IV.4. Влияние лектинов растительного происхождения на пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров. 110
IV.5. Влияние лектинов растительного происхождения на противоопухолевую цитотоксическую активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров. 113
IV.6. Влияние лектинов на спонтанную цитотоксичность МНПК по отношению к линии опухолевых клеток К562 и Colo. 114
IV.7. Особенности связывания лектинов с лейкоцитами мышей на фоне роста опухоли . 116
Выводы 124
- Краткое анатомо-морфологическое описание отдельных представителей рода Pisum (Горох).
- Изучение ритма сезонного развития различных сортов гороха посевного
- Изучение химического состава семян и травы различных сортов гороха с использованием ГЖХ хроматографии масс-спектрометрии
- Особенности связывания лектинов с лейкоцитами мышей на фоне роста опухоли
Введение к работе
Актуальность темы: Настоящий период развития отечественной медицины и фармации характеризуется отчетливой тенденцией к более интенсивному использованию лекарственных средств растительного происхождения. В связи с этим одной из важных проблем фармации является изыскание новых растительных источников биологически активных веществ и создание на их основе эффективных лекарственных препаратов.
Горох посевной широко известен как ценный пищевой продукт. Он нашел
применение в народной медицине как мочегонное, гипогликемическое
средство, как источник витаминов, каротина, белка, минеральных веществ
(калия, фосфора, магния, кальция, йода, натрия, железа). Наружное
использование измельченных семян гороха рекомендовано для лечения
воспалений кожи, экземы, гнойных ран. Комплекс незаменимых аминокислот,
протеинов, фитоэстрогенов обусловливают его широкую
фармакотерапевтическую активность. В научной медицине горох посевной до настоящего времени не применялся. В настоящее время несомненный интерес могут представлять также высокомолекулярные белковые компоненты из растений рода Pisum - лектины. Так, например, из фасоли выделены лектины (фитогемагглютинины - ФГА), обладающие гемагглютинирующей способностью и имеющие применение в медицинской практике.
Отсюда очевидно, что научное обоснование применения представителей рода Pisum в медицине и фармации в качестве источника сырья богатого белками растительного происхождения, фитоэстрогенами и лектинами, обладающими выраженным иммуномодулирующим действием является, несомненно, актуальным в настоящее время.
Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы является ботанико-фармакогностическое изучение представителей рода Pisum и экспериментальное обоснование возможности их использования в медицине.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить особенности ритма сезонного развития представителей рода
Pisum с установлением морфолого-анатомических характеристик различных
сортов гороха посевного;
изучить химический состав сырья некоторых сортов гороха для выявления комплекса биологически активных веществ (флавоноидов, аминокислот, фитоэстрогенов, белков и лектинов);
провести исследования по стандартизации сырья представителей рода Pisum;
- провести фармакогностическое исследование по разработке оптимальных
условий сбора, сушки и хранения сырья гороха посевного;
- разработать способ выделения лектинов и провести исследования по
изучению их биологической активности;
- изучить фармакологическую активность лектинов гороха посевного
(цитотоксичность, противоопухолевое, фитогемагглютинирующее,
иммуномодулирующее) и провести исследование по определению острой
токсичности;
- разработать технические условия на семена гороха посевного.
Основные положения, выносимые на защиту:
результаты химического изучения (состав протеинов в семенах гороха, состав флавоноидов, аминокислот и фитоэстрогенов в траве и семенах гороха);
результаты выделения лектинов из семян гороха посевного;
результаты фармакогностического изучения гороха посевного с выявлением анатомо-диагностических признаков сырья;
результаты исследований по стандартизации сырья гороха;
- результаты исследования фармакологического действия лектинов гороха посевного (цитотоксичность, противоопухолевую, фитогемагглютинирующую и иммуномоделирующее действие).
Научная новизна: Впервые проведена анатомо-морфологическая характеристика сортов гороха посевного. Произведена съемка микропрепаратов листа и стебля различных сортов гороха посевного и выявлены их анатомо-диагностические особенности. Полученные данные позволяют оценить анатомо-морфологические особенности рассматриваемых сортов гороха и могут быть использованы для составления научно-технической документации.
Проведен в сравнительном аспекте химический анализ сырья сортов
гороха: состав аминокислот, флавоноидов, протеинов, лектинов,
фитоэстрогенов в траве и семенах некоторых сортов гороха. В работе использованы современные физико-химические методы газовой хроматографии с масс-спекрометрией, а также способы выделения лектинов с использованием колоночной хроматографии (гель-фильтрации и аффинной). Степень очистки лектинов подтверждалась посредством электрофореза.
Разработаны характеристики подлинности, показатели качества, их нормы для изучаемого сырья. Изучена стабильность сырья семян гороха посевного в процессе хранения.
Впервые разработан метод выделения лектинов из семян гороха посевного, и выявлены особенности биологического действия лектинов (цитотоксичность, противоопухолевое, фитогемагтлютинирующее и иммуномодулирующее действие). По результатам определения токсичности лектины гороха отнесены к четвертому классу малотоксичных веществ.
Учитывая высокое содержание лектинов в семенах гороха, был исследован
спектр фармакологической активности этих природных соединений. В
экспериментальных условиях было установлено, что лектины гороха
стимулируют продукцию основных регуляторных пептидов
(противовоспалительных и регуляторных цитокинов), следствием, которого является усиление противоопухолевой активности лимфоцитов крови.
Полученные нами данные могут быть в дальнейшем использованы при разработке препаратов содержащих лектины, так как к настоящему времени, несмотря на имеющийся обширный экспериментальный материал по лектинам, препараты на их основе отсутствуют.
Практическая значимость: Проведенные исследования показали возможность использования в медицинской практике нового лекарственного растительного средства - лектинов гороха. Разработаны технические условия на семена гороха и поданы материалы на патент: «Способ диагностики онкологического заболевания путем анализа лимфоцитов крови» (приоритетная справка №2004121099 от 12.07.2004г.).
Личное участие автора в получении научных результатов: все экспериментальные исследования выполнены автором лично. Изучены анатомо-морфологические особенности представителей рода гороха, проведено изучение химического состава различных сортов гороха, выделены и охарактеризованы лектины из семян гороха. Исследован спектр биологической активности лектинов гороха, установлено, что лектины гороха обладают выраженным иммуномодулирующим действием.
Внедрение в практику. Разработана методика выделения лектинов из семян гороха. На основании проведенных исследований разработаны технические условия на семена гороха.
Апробация диссертации состоялась 30 июня 2004 г. на совместной научной конференции кафедр ботаники, фармакогнозии, общей химии с курсом стоматологического материаловедения ММА им. И.М.Сеченова; лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах с приложением, содержит 20 таблиц и 35 фотографий и рисунков. Диссертация содержит введение, обзор литературы, экспериментальную часть, состоящую из
Краткое анатомо-морфологическое описание отдельных представителей рода Pisum (Горох).
Представители этого рода — однолетние, зимующие в условиях субтропиков травянистые растения, многие из которых широко культивируются в умеренной полосе. Естественное место обитания -умеренные широты, северная часть субтропических районов, совпадающая с черноземными областями (26).
Стебель Зеленый травянистый побег имеет приподнимающийся стебель, по способу роста стебель лазящий, при помощи усиков растение прикрепляется к вспомогательным сооружениям, тем самым, облегчая рост гороха в высоту. Усики представляют видоизмененные листочки. В основном стебли гороха посевного слабые, часто простертые. Все зеленые части гороха покрыты восковым налетом, что имеет значение защиты, с одной стороны, от чрезмерного испарения, с другой - от смачивания дождем (26,27).
Стебель гороха имеет угловатую форму, его длина в зависимости от сорта достигает от 20 до 250 см (21).
Листья
Листья у гороха сложные, характеризуются четко обособленными листовыми пластинками (листочками), каждый из которых имеет сочленение черешка листочка с общим черешком (рахисом). Между рахисом и стеблем есть еще одно сочленение. Лист гороха относится к подгруппе перистосложных, является парноперистым (верхушка рахиса заканчивается усиком), листья состоят из 1-3 пар яйцевидных листочков (21,26).
Происшедшая вследствие замены части листочков усиками убыль листовой поверхности компенсируется тем, что у основания листьев горох имеет крупные полусердцевидные прилистники.
Жилкование листа гороха перистое с острым углом отхождения жилок второго порядка (21).
Корень
Корневая система гороха стержневого типа, корень проникает глубоко в почву. Кроме того, имеется большое количество боковых корней и корешков, которые расположены в верхнем слое почвы. На корнях гороха образуются маленькие клубеньки, в которых поселяются клубеньковые бактерии, усваивающие азот из воздуха, благодаря чему горох обогащает почву азотистыми соединениями. Таким образом, горох, благодаря симбиозу с клубеньковыми бактериями, накапливает в 2-3 раза больше белков, чем злаки (21,26,27).
Цветок
Белые или красновато-фиолетовые цветки гороха сидят обыкновенно по два на длинных цветоносах.
Чашечка. Бокаловидная чашечка оканчивается пятью зубчиками, представляющими следы 5 слившихся чашелистиков; она является опорой для трубочки венчика. Подчашие отсутствует. Венчик типичный для подсемейства мотыльковых - мотылькового типа. Лепестки имеют целую систему мелких жилок. Для них свойственен дихотомический способ ветвления.
Андроцей. Тычинок 10, изогнутых кверху, 9 из них срослись в трубку, которая подобно чехлу окружает завязь. Щель между свободными краями трубки закрыта сверху нитью свободной, десятой тычинки. Андроцей двубратственный. На дне трубочки выделяется нектар.
Форма пыльника тычинки стреловидная. Пыльник состоит из двух «половинок» (тек или сумок). Они расположены по обе стороны связника. Степень развития связника определяет общую форму пыльника. Каждая из них в свою очередь состоит из двух гнезд - пыльцевых мешков, где развиваются микроспоры, а затем пыльца. Важное филогенетическое значение имеет способ раскрывания пыльников: экстрорзный (раскрывается в абаксиальном направлении) - пыльца высыпается наружу.
Гинецей. Образован одной карпелью (плодолистиком). Такой гинецей называют апокарпным. Гинецей простой или одночленный, так как образован одним пестиком. Пестик с длинной завязью и длинным столбиком. Завязь верхняя, располагается свободно на плоском цветоложе и образуется только плодолистиками (21).
Плод гороха - боб, неправильно называемый стручком. Боб состоит из одного плодолистика, содержащего много семян бурого или темного цвета. Форма семян шаровидная, но чаще семена неправильной угловатой формы. Перикарпий, высыхая, скручивается, так как его наружные и внутренние волокнистые слои сокращаются в разных косых направлениях; в результате создается напряжение. И боб может внезапно раскрыться по двум боковым швам. С силой выталкивая наружу несколько семян. Другие семена- выбрасываются менее энергично по мере дальнейшего скручивания.
Околоплодник плода гороха состоит из следующих тканей:
1) наружный эпидермис
2) гиподерма
3) тонкостенная паренхима
4) склеренхимная ткань, образующая пергаментный слой
5) внутренний эпидермис
6) проводящие пучки (один с вентральной стороны боба, и другой - с дорзальной) (26).
Механизм раскрывания плода зависит от степени развития пергаментного слоя, который» является основной движущей силой в этом процессе. Под степенью развития пергаментного слоя следует понимать не абсолютную толщину его, а отношение толщины пергаментного слоя к толщине всей створки боба (26).
Пергаментный слой возникает из ткани, образующейся в результате деления клеток внутреннего эпидермиса, которое происходит еще до раскрывания цветка. Пергаментный слой состоит из двух типов клеток, различающихся по расположению элементарных частиц клеточных оболочек - мицелл, в силу чего сокращение этих клеток при изменении условий влажности происходит в двух взаимно перпендикулярных направлениях (26).
Наиболее важные представители рода
Единственный вид широко используемый в сельскохозяйственной практике — горох посевной Pisum sativum. Вид Pisum sativum L. включает З подвида: Азиатский (ssp.Asiaticum). Закавказский (ssp.Transcaucasicum).
Обыкновенный (ssp.Commune). Азиатский горох характеризуется мелкими зубчатыми листочками и желтоватыми цветками. Закавказский отличается узкими викоподобными листиками и мелкими семенами. Обыкновенный -наиболее распространенный вид гороха.
Горох это род однолетних и многолетних растений семейства бобовых. Известно порядка 7 видов. Горох посевной (Pisum sativum) известный только в культуре, широко распространен как пищевая и кормовая культура. Родина - Средиземноморье. Одно из древнейших культурных растений (ископаемые остатки известны с неолита). Именно этому виду человечество обязано рождением науке - генетике, так как именно горох использовал Г. Мендель для изучения закономерностей наследственности.
Изучение ритма сезонного развития различных сортов гороха посевного
Горох относится к однолетним растениям. Поэтому из периодов развития растений по Работнову Т.А. присутствуют прегенеративный (виргинильный), генеративный и отсутствует постгенеративный (сенильный период) (22). Поэтому в настоящей работе будут использованы и другие системы описания жизненных циклов растений, о чем будет сказано ниже. К прегенеративному периоду относятся особи, не достигшие половозрелового состояния: всходы (проростки), ювенильные растения, имматурные растения и взрослые вегетативные растения. Ювенильные растения от проростков отличаются по их способности к самостоятельному питанию, т.е. растение не связанное с материнским семенем и потерявшее семядоли или с момента отмирания семядольных листьев. Имматурные растения - это растение, сформировавшее первичный куст. Для растений генеративного периода характерна способность цвести и плодоносить.
Вегетационный период гороха посевного зависит от сроков его посева. Так при высевании семян гороха в начале мая (2-4.05) первые всходы наблюдали 19-21.05. При высевании 15.05 всходы появлялись через 8-10 дней. Наилучшей глубиной заделки семян составляет 6-8 см.
В процессе развития растений выделяют 12 этапов (24). 1 этап это формирование конуса нарастания и зародышевых органов семени, начиная с развития эмбриональной почечки семени и до его полного прорастания. Установили, что прорастание семян подземное. В проростке первым трогается в рост зачаточный корешок зародыша, дающий начало главному корню. На момент начала развития стебелька длина корня достигала до 1,3 см. Семядоли на поверхность не выносятся, подсемядольное колено не выражено. Эпикотиль - 0,5 - 0,8 см, первый лист чешуевидный. Второй этап характеризуется формированием настоящих листьев и ростом междоузлий стебля. Растения гороха после появления всходов растут достаточно медленно (Рис.П.1). Так, длина стержневого корня через 5 дней после прорастания составляла 1,5-2 см. Первый настоящий лист также появляется в это же время. В конце мая развертывается около трети всех листьев. Как видно из таблицы 1 к 20 дню вес растения приближается к 1 грамму. Во второй период темпы роста растения резко ускоряются, и за следующие 5 дней вес растения практически удваивается. А к 35 дню появляется до 90% всех листьев. Затем происходит постепенное затухание ростовых процессов и листообразования. В этот период у гороха отмечается ярусная изменчивость листьев в онтогенезе, выражающаяся в изменении числа листочков в пластинке сложного перистого листа (Рис.П.2). В вегетативной сфере большая часть листьев имеет пластинку, состоящую из двух листочков. Первые цветки у изучаемых сортов практически всегда закладывались в пазухе листа имеющего четыре листочка. Ярусные различия боковых побегов и почек выражались для всех сортов еще и в том, что чем выше закладывался боковой побег или почка, тем меньше листьев было в их вегетативной сфере. Вегетационный период выращиваемых сортов длится 50-70,8 дней (табл. П. 1).
Другая особенность изученных сортов гороха проявлялась в ранней дифференциации конусов нарастания пазушных почек и боковых побегов, а в связи с этим и быстрым их переходом к генеративному развитию. Переход к генеративному развитию (третий и четвертый этапы органогенеза) у боковых побегов начинается после того, как в пазухе первого листа генеративной сферы главного побега появляется цветок. Однако, несмотря на довольно раннюю дифференцировку конусов нарастания боковых побегов и почек не все они успевают закончить полный цикл и принести созревшие плоды.
Заложение и формирование органов цветка, у гороха происходит последовательно с пятого по восьмой этап органогенеза. Первые бутоны начинали формироваться 25.06 (табл.П.З). Темпы прироста стебля от бутонизации до цветения возрастают до 1,8-2,4 см в сутки.
Средняя длина бутона у разных сортов гороха изменялась на пятом этапе развития в пределах: от 2,1 до 2,5 мм, на шестом этапе - от 4,4 до 7,1 мм. На седьмом этапе развития длина бутона достигала 14 мм, а на восьмом - 20 мм. Различия по средней длине бутонов у растений исследуемых сортов в течение этих этапов органогенеза были недостоверны. Сортовые различия в формировании цветка начинали сказываться, после того как лепестки приобретут типичную для сорта окраску. Общие закономерности в росте и во внешних морфологических закономерностях при формировании цветка показаны (в таблице II.2).
На шестом этапе органогенеза происходит формирование из элементов венчика паруса, весел и лодочки и срастание краев плодолистика и лепестков лодочки. Известно, что в пыльниках в это время протекает процесс микроспорогенеза. На седьмом этапе в пыльниках образуется мужской гаметофит. После чего процессы, подготавливающие опыление и оплодотворение, закончены. На десятом, одиннадцатом и двенадцатом этапах происходит формирование плодов и семян. На десятом этапе плоды быстро растут в ширину и длину и медленно в толщину. Для одиннадцатого этапа органогенеза характерно интенсивный рост плода в толщину до достижения своего максимального значения, некоторое уменьшение длины и ширины плода из-за быстрого роста семян и связанного с этим раздвижением створок околоплодника.
Средняя высота растения к созреванию составляла 46,2 - 70,5 см. В таблице 3 показана календарная периодичность описанных ранее этапов органогенеза различных сортов гороха в зависимости от конкретных климатических условий года наблюдения. Видно, что в 2003 году наблюдалась некоторая задержка в развитии всех изучаемых сортов гороха.
С 25.06-30.06 наступала фаза цветения (Рис. П. 3). Цветение начиналось с нижних ветвей и постепенно переходило к верхним. Продолжительность цветения может варьировать у разных сортов от 15 до 25 дней. К периоду образования соцветий, т.е. перед вступлением в фазу цветения, у гороха отмечали наибольшую биомассу, т.е. максимальное количество ветвей и листьев.
Изучение химического состава семян и травы различных сортов гороха с использованием ГЖХ хроматографии масс-спектрометрии
Газохромато-массспектрометрия - это метод, который позволяет идентифицировать практически все известные вещества. Достаточно сказать, что в настоящее время разработаны подходы (например, MALDI-анализ), когда возможна идентификация даже белков.
Поэтому нами был проведен анализ ГЖХ на присутствие в семенах гороха других биологически активных соединений, в частности, фитоэстрогенов. С нашей точки зрения, эти соединения несправедливо «умалчиваются», тогда, как их гормональное действие на организм нуждается в детальном исследовании. Данный раздел диссертационной работы является пионерским исследованием, цель которого выявить новые биологически активные соединения, идентифицировать их, чтобы в дальнейшем провести более детальное фармакологическое исследование.
Особый интерес представляют вещества-антиоксиданты, высокомолекулярные спирты и органические кислоты, а также витамин Е. Представители всех этих соединений были обнаружены в составе зерен гороха. К веществам-антиоксидантам относится 4Н-1-бензопиран-4он 5гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-7-метокси. К ненасыщенным жирным высокоатомным спиртам относится фитол, а к жирным кислотам гексадекановая кислота. Но особое внимание заслуживает факт наличия в семенах гороха веществ стероидов: холест-5-ен-3-ол(3 бета) и эргоста-5,7,22-триен-3-ол(Збета-22Ь). Многие стероиды, как известно, являются предшественниками гормонов, а многие стероиды растительного происхождения, являются фитоэстрогенами. Фитоэстрогены, как известно, сейчас переживают бум в исследовании. Этот бум связан с тем, что на территориях, где бобовые преобладают в пище человека, частота онкологических заболеваний ниже на 15-20%. А репродуктивный возраст человека выше на 10-15 лет. О причине соль разительных отличий этой популяции людей высказываются различные предположения. Некоторые исследователи пытаются объяснить этот факт влиянием биофлованоидов на иммунную систему человека. Однако вещества-иммуномодуляторы присутствуют во многих пищевых продуктах и в большей или меньшей степени их употребляют в пищу люди, проживающие во всех уголках Земли, тогда как фитоэстрогены содержатся в немногих пищевых продуктах. Только гормоны могут реально перестраивать метаболизм животных и человека. Что же касается эстрогенов, то их защитное действие на женский организм в настоящее время не подвергается сомненью. Поэтому только фитоэстрогены могут создать уникальную ситуацию, оказывая постоянное гормональное (защитное) воздействие на организм человека, которое по силе в десятки или сотни раз слабее фармакологического. Это воздействие слабое, но необычайно продолжительное (практически всю жизнь!) на людей, проживающих на определенной территории. К сожалению, более подробное исследование о влиянии фитоэстрогенов гороха на организм человека выходит за рамки данного исследования. Но обнаруженный нами факт без сомнения заслуживает дальнейшего изучения.
В результате проведенных ГЖХ исследований в образцах идентифицированы (Рис.Ш.2,3) насыщенные и ненасыщенные углеводороды, предельные и непредельные жирные кислоты, стероиды растительного происхождения, флавоноиды. Кроме того, в экстрактах обнаружены фталаты, остатки пестицидов (DDE) (Рис.Ш.4 a,b,c,d,e,i,f).
Особенности связывания лектинов с лейкоцитами мышей на фоне роста опухоли
В настоящее время используются методы диагностики онкологических заболеваний по поиску и определению опухоль ассоциированных антигенов. То есть антигенов, которые у здоровых людей в крови не встречаются или встречаются в очень маленьких количествах, а на фоне развития онкологического заболевания попадают с опухоли в кровь. При этом не существует подходов к диагностике опухоли по изменению в организме опухоленосителе. В месте с тем на существование таких изменений указывают работы 60-80-х годов прошлого столетия, в которых показано, что сыворотка и лейкоциты животных-опухоленосителей обладает специфическими биологическими действием, которое специфически защищает опухолевые клетки в организме. Однако природа этих изменений остается неизвестной, так как не удается выявить какой-либо опухоль-специфический фактор.. Нами было высказано предположение, что за изменениями биологических свойств сыворотки крови стоит изменение гликозилирования ее белков. В этом случае действительно не удастся обнаружить никакого нового фактора в сыворотке крови, но будет наблюдаться изменение ее биологических свойств. Для проверки этого предположения нами было изучено изменение связывания лектинов с лейкоцитами крови на фоне роста карциномы яичников CaOl и асцитной карциномы Эрлиха.
На следующем этапе исследования нами было изучено связывание лектинов с поверхностью лимфоцитов периферической крови интактных мышей и мышей на 20 день после перевивки опухоли CaOl и карциномы Эрлиха.
На рисунке IY.2. показан дотплот клеток лимфоцитов крови здоровых мышей, которые были выбраны для анализа популяций лимфоцитов на фоне роста опухоли. Видно, что лимфоциты формируют плотное облако однородных клеток.
На рисунке IY.3. показана гистограмма распределения нормальных лейкоцитов крови до их окраски лектином гороха (гистограмма 1) и после окраски ФИЦ-меченным лектином гороха (гистограмма 2). Видно, что после инкубации с лектином происходит сдвиг гистограммы вправо, что свидетельствует об увеличении флуоресценции клеток вследствие связывания с ними меченного лектина. Процент связанных клеток - 91,2. Средняя геометрическая флуоресценции клеток составила 58.04 у.е.
На рисунке IY.4. приведены гистограммы лимфоцитов периферической крови животных с карциномой Эрлиха до их окраски лектином гороха, и после окраски. Видно. Что так же как в случае с нормальными лимфоцитами, окраска лектином гороха вызывает сдвиг гистограммы вправо. При этом только 21,3% клеток находятся в тех же пределах окраски, тогда как в контроле таких клеток 91,2%. Средняя геометрическая интенсивности окраски также значительно ниже - 21.4 у.е.
На рисунке IY.5. показана гистограмма (5) лимфоцитов периферической крови мышей после их окраски лектином фасоли. Видно, что с помощью лектина удается выделить 2 популяции лимфоцитов с относительно низким (1 пик) и высоким (2 пик) содержанием Сахаров на своей поверхности. Процент клеток во 2 пике составляет 56,2%, тогда как в 1 - 43,7%. В то же время на фоне роста опухоли происходит уменьшение количества доступных для лектинов Сахаров, что свидетельствует об уменьшении их на поверхности лимфоцитов. Средняя геометрическая флуоресценции клеток составила 72.37 у.е.
На рисунке IY.6. представлена гистограмма окраски лимфоцитов периферической крови мышей с опухолью лектином фасоли. Видно, что в этом случае прослеживается та же закономерность, что и в случае окраски лектином гороха. Интенсивность 2-го пика до 31%, а средняя геометрическая свечения клеток так же уменьшилась до 61.35 у.е..
На рисунке IY.7. показана гистограмма клеток лимфоцитов периферической крови мышей с карциномой яичника CaOl после их окраски лектином фасоли. Видно, что данная гистограмма отличается от гистограммы клеток интактных мышей или с карциномой Эрлиха. Так, у гистограммы 7 практически не выражен второй пик, в отличие от гистограмм 5 и 6. Хотя общая тенденция по снижению доступности Сахаров для лектинов на фоне роста опухоли сохраняется. И процент окрашенных клеток с определенной интенсивностью в каналах от 384 до 600 снижается от 56.4% в контроле на рисунке D до 14,1% на рисунке F. Средняя геометрическая флуоресценции клеток составила 45.27 у.е. Аналогичные результаты были получены и для других штаммов перевиваемых опухолей мышей.
Таким образом, окраска лектинами лимфоцитов периферической крови мышей показало, что на фоне роста опухолей наблюдается уменьшение доступности для лектинов на поверхности клеток. Кроме этого, характер гистограммы, который получается после окраски клеток лектинами, отличается для опухолей различного происхождения. Этот факт дает возможность предположить, что изменение гликозилирования на фоне роста опухоли носит специфический характер. Специфический характер гликозилирования белков клеточной мембраны можно объяснить следующим образом. На поверхности опухолевых клеток содержатся различные антигенные детерминанты, которые представляют собой определенные атомы, имеющие свой заряд и пространственную структуру с которыми взаимодействуют другие заряженные структуры молекул организма. Соотношение этих структур, их взаимодействие необходимы для функционирования организма. Рост опухоли будет приводить к тому, что концентрация структур, расположенных на ее поверхности, в организме возрастает, что будет способствовать агрегации молекул на их поверхности. Простейший пример этого явления - это агрегация эритроцитов при обезвоживании организма (сладж синдром). Эритроциты начинают слипаться между собой на фоне обезвоживания, так как их концентрация в сыворотке крови возрастает. Гликозилирование белков может быть тем механизмом, который «маскирует» те поверхностные структуры, по которым может идти патологическая агрегация. Блокирование же такой агрегации между лимфоцитами и поверхностью опухолевых клеток может приводить к иммунологическому параличу и открывать путь для роста опухоли в организме. Такой иммунологический паралич многократно описан в литературе.
