Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Эпидемиологические особенности гепатита А в современный период 11
Глава 2. Лабораторные методы определения вируса гепатита А и их применение в эпиднадзоре за инфекцией 25
2.1. Характеристика вируса гепатита А 25
2.2. Характеристика лабораторных методов определения вируса гепатита А 31
2.3. Применение методов обнаружения вируса гепатита А в эпиднадзоре за инфекцией 37
Глава 3. Материалы и методы исследования 47
Глава 4. Характеристика эпидемического процесса гепатита А на отдельных территориях г. Н. Новгорода в современный период 57
Глава 5. Эпидемиологическая оценка обнаружения РНК ВГА методом ОТ-ПЦР в эпиднадзоре за гепатитом А 78
5.1. Сравнительная оценка эффективности методов ИФА и ОТ-ПЦР при детекции вируса гепатита А 78
5.2. Информативность определения РНК ВГА методом ОТ-ПЦР в клинических субстратах 81
5.3. Оценка эпидемической опасности РНК ВГА - позитивных лиц 87
Глава 6. Использование метода ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ВГА в воде при мониторинге водных объектов и расшифровке вспышек гепатита А 90
6.1. Закономерности распространения вируса гепатита А в водных объектах 90
6.2. Эпидемиологическая значимость определения РНК ВГА в воде 99
6.3. Водная вспышка гепатита А на территории г. Н. Новгорода в 2005 г 102
Заключение 117
Выводы 133
Практические рекомендации 135
Указатель литературы 136
- Характеристика лабораторных методов определения вируса гепатита А
- Характеристика эпидемического процесса гепатита А на отдельных территориях г. Н. Новгорода в современный период
- Информативность определения РНК ВГА методом ОТ-ПЦР в клинических субстратах
- Закономерности распространения вируса гепатита А в водных объектах
Введение к работе
Актуальность. В начале XXI века гепатит А по-прежнему представляет собой серьезную проблему для здравоохранения почти всех стран мира, поражая ежегодно до 1,5 млн. человек [15, 47].
По объему экономического ущерба в нашей стране ГА в 90-е годы занимал третье место после гриппа и острых респираторных заболеваний [ПО]. По данным И.Л. Шаханиной и соавт. (2001) потери от одного случая этой инфекции составляют 14,2 тыс. рублей [107].
В последнее десятилетие как зарубежные, так и отечественные исследователи отмечают процесс формирования принципиально новой эпидемиологической ситуации по гепатиту А [15, 48, 53, 58, 65, 80, 92, 112, 114, 117, 120, 172, 173, 181, 182, 200, 202, 220, 223, 236, 247]. В современный период Россия из группы стран с высокой активностью эпидемического процесса ГА перешла в группу с его средней активностью. Несмотря на общую тенденцию к снижению, уровень заболеваемости ГА на территории России остается высоким и превосходит показатели многих стран Европы [23]. За последние 10 лет показатели заболеваемости колебались от 28,3 о/оооо в 2003 г. до 123,5 в 1995 г. Как и в предыдущие годы ГА характеризуется повсеместным, но неравномерным распространением. Поэтому общероссийские показатели не отражают особенности эпидемического процесса инфекции в отдельных регионах, среди которых остаются территории с очень высокой (500 о/оооо и более) и высокой (200-500 о/оооо) заболеваемостью [23, 68]. До сих пор мало изученным остается вопрос о причинах столь контрастного распределения гепатита А.
В настоящее время гепатит А наряду с высокой эпидемиологической приобретает особую медико-социальную значимость. «Повзросление», тенденция к росту доли сочетанных форм ГА (в среднем 14,1%), преимущественно среди лиц с хроническими ГВ и ГС, число которых в России уже составляет около 5 млн. человек, привело к утяжелению
клинического течения инфекции, особенно выраженное в годы периодических подъемов заболеваемости ГА [21, 23, 58, 66]. Некоторые исследователи не исключают при этом ведущую роль изменения свойств самого возбудителя [38, 58, 111].
Несмотря на значительные успехи в разработке вакцин против ГА, масштабы их применения в нашей стране очень малы и не позволяют рассчитывать в ближайшем будущем на улучшение эпидситуации по гепатиту А на территории России в целом.
В последние годы отмечается увеличение числа вспышек ГА [23, 26, 27, 52, 60]. Причем на ряде территорий водный путь передачи инфекции признан ведущим, обусловливая 62,6% случаев ГА [46, 80, 82, 84, 93, 97, 101, 117]. В связи с этим, актуальным является совершенствование методических подходов при проведении мониторинга за контаминацией водных объектов вирусом гепатита А.
Широкое применение в нашей стране для определения специфических маркеров гепатита А получил метод ИФА. На современном этапе одним из наиболее перспективных направлений в детекции ВГА является использование молекулярно-генетических методов, в основе которых лежит ОТ-ПЦР. Это позволит на качественно новом методическом уровне рассмотреть эпидемиологические аспекты проблемы гепатита А.
К началу нашей работы опыт использования метода ОТ-ПЦР, по материалам зарубежных и единичным публикациям отечественных исследователей, показал принципиальную возможность его применения для определения РНК вируса гепатита А в сыворотке крови, объектах внешней среды (питьевая вода, сточные воды, пищевые продукты) [6, 51, 83, 88, 89, 126, 131, 143, 144, 147, 155, 164]. Установлена строгая специфичность и высокая чувствительность метода ОТ-ПЦР. Однако в доступной литературе сведения о возможности использования метода ОТ-ПЦР для исследования фекалий больных ГА ограничиваются материалами единичных зарубежных публикаций [168]. В то время как определение РНК ВГА в фекалиях -
7 субстрате, наиболее адекватно отражающем фекально-оральный механизм передачи гепатита А, представляется важным с эпидемиологической точки зрения. Сообщение V. Mackiewicz et al. (2004) открывает возможности выявления РНК ВГА в слюне [161].
Наряду с этим, до сих пор не проводилась эпидемиологическая оценка находок РНК ВГА в различных субстратах. Остается неясным вопрос об эпидемической опасности РНК ВГА - позитивных лиц и эпидемиологической значимости обнаружения РНК ВГА в объектах внешней среды, в частности в воде.
К тому же в некоторых работах отмечены трудности, связанные с ингибированием реакции компонентами исследуемых образцов, что значительно снижает чувствительность метода, нередко обусловливая ложноотрицательные результаты. Эта проблема также остается малоизученной и требует своего решения [17, 143, 146, 166, 183, 221, 250].
Вышеперечисленное свидетельствует о необходимости выполнения работы по адаптации метода ОТ-ПЦР при определении РНК ВГА к проведению эпидемиологических исследований. Иначе не представляется возможным рекомендовать его для применения в эпиднадзоре за инфекцией.
Цель исследования: оценка эпидемиологической значимости определения РНК вируса гепатита А методом обратной транскрипции -полимеразной цепной реакции для совершенствования методической базы эпиднадзора за инфекцией.
В соответствии с целью работы решались следующие задачи:
На основе многолетних наблюдений дать сравнительную оценку проявлений эпидемического процесса и охарактеризовать роль водного фактора передачи гепатита А на отдельных территориях г. Н. Новгорода.
Провести сравнительную оценку частоты обнаружения Аг ВГА и РНК ВГА методами ИФА и ОТ-ПЦР в фекалиях, сыворотке крови и слюне больных гепатитом А и контактных из очагов инфекции. Определить эпидемическую опасность РНК ВГА-позитивных лиц.
Дать оценку информативности определения РНК вируса гепатита А в воде при проведении вирусологического мониторинга за объектами хозяйственно-питьевого водоснабжения.
Оценить эффективность метода ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ВГА в различных клинических субстратах и воде при проведении эпиднадзора за гепатитом А.
Научная новизна работы
Впервые метод ОТ-ПЦР для определения РНК вируса гепатита А применен при проведении эпидемиологических исследований.
Расширены представления о сроках эпидемической опасности больных гепатитом А. Установлено, что при появлении желтухи РНК ВГА в фекалиях обнаруживается у всех больных гепатитом А, при этом 90,6% представляют эпидемическую опасность не менее 25 дней (срок наблюдения).
Впервые с использованием метода ОТ-ПЦР установлена связь между обнаружением РНК ВГА в водных объектах и развитием эпидемического процесса гепатита А на конкретной территории в условиях спорадической и вспышечной заболеваемости. Определены условия, влияющие на интенсивность циркуляции ВГА в водных объектах: частота обнаружения ВГА увеличивается в годы периодических подъемов, ежегодно в весенние месяцы, а в зимнее время - вслед за годом с высоким уровнем заболеваемости ГА и в случае оттепелей, сопровождающихся таянием снега.
Доказано, что обнаружение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР в фекалиях больных гепатитом А и контактных, а также в воде является маркером их эпидемической опасности.
На основе модельных опытов и эпидемиологических исследований обоснована возможность и целесообразность применения метода ОТ-ПЦР в эпиднадзоре за гепатитом А.
Практическая значимость работы
Полученные результаты об увеличении периода эпидемической опасности больных гепатитом А указывают на необходимость пересмотра
9 временных параметров их изоляции и критериев допуска в коллективы декретированных групп населения.
Метод ОТ-ПЦР для определения РНК ВГА в фекалиях, сыворотке крови контактных из очагов гепатита А может использоваться при проведении эпидемиологического расследования в них.
В ходе выполнения работы метод ОТ-ПЦР был адаптирован к проведению исследований по детекции вируса гепатита А в воде различной степени загрязнения. Устранение ингибирования реакции за счет предварительной обработки проб позволило повысить эффективность использования метода в эпиднадзоре за инфекцией для планового мониторинга водных объектов и расшифровки вспышечной заболеваемости гепатитом А.
Внедрение результатов исследования в практику
Материалы диссертации использованы при составлении пособия для врачей «Стратегия и тактика вакцинопрофилактики гепатита А», утвержденного Председателем секции Ученого Совета МЗ РФ по эпидемиологии, инфекционным заболеваниям и вирусологии акад. РАМН В.И. Покровским от 02.12.2005 г., протокол № 5. - Н. Новгород, 2005.
С участием автора составлены Методические указания «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов» (МУК 4.2.2029-05), утвержденные Руководителем Роспотребнадзора, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко от 18.11.2005 г. - М., 2006.
Разработан способ предварительной обработки проб слюны и концентратов воды для устранения ингибирования ОТ-ПЦР. Подана заявка на изобретение (Приоритетная справка№ 2005135515/17 от 15.11.2005 г.).
На защиту выносятся следующие основные положения: 1. Метод ОТ-ПЦР позволяет расширить представления о частоте обнаружения ВГА в фекалиях и продолжительности периода эпидемической опасности лиц, инфицированных гепатитом А.
10 2. Метод ОТ-ПЦР имеет преимущества сравнительно с ИФА при определении ВГА в клинических субстратах и воде, повышая эффективность эпиднадзора за гепатитом А.
Апробация работы
Материалы работы представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004) научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной «Новые технологии в диагностике, эпиднадзоре и профилактике» (Н.Новгород, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); «11-ой Нижегородской сессии молодых ученых (физика, химия, медицина, биология)» (Н. Новгород, 2006); научной конференции, посвященной 85-летию академика РАМН И.Н. Блохиной (Н. Новгород, 2006); Всероссийском научно-промышленном форуме «Великие реки - 2006» (Н. Новгород, 2006).
В завершенном виде диссертационная работа доложена и обсуждена на научном межлабораторном семинаре ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора и расширенном заседании проблемной комиссии по эпидемиологии, микробиологии и инфекционным болезням ГОУ ВПО «НижГМА Росздрава» (Н. Новгород, 2006).
По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Характеристика лабораторных методов определения вируса гепатита А
Установлено, что в фекалиях больных и в препаратах из зараженных тканевых культур могут наряду со зрелыми вирионами встречаться и так называемые дефектные, отличающиеся тем, что не содержат РНК или содержат только ее фрагменты, или же имеют повышенную проницаемость белковой оболочки [12, 72]. Полноразмерная РНК вируса методом молекулярной гибридизации определялась только в составе зрелых вирионов, но антигенная активность характерна и для субвирусных частиц, отличающихся по биофизическим свойствам. Кроме того, субвирусные частицы содержат протеин VP0, который представляет собой нерасщепленный предшественник белков VP4 и VP2.
В последнее десятилетие, благодаря развитию молекулярно-биологических методов исследования, в частности генотипирования на основе ПЦР, и их применения в вирусологии и молекулярной эпидемиологии, была выявлена гетерогенность популяции вируса гепатита А. В настоящее время идентифицировано более 30 штаммов ВГА, выделенных в различных географических регионах мира. Изоляты ВГА подразделяют на семь генотипов, обозначаемых римскими цифрами: I, II, III и VII изолированы от больных людей, IV, V и VI - от обезьян Старого света (они не инфекционны для человека) [12, 71, 119, 154, 177, 178, 199, 211]. Разные изоляты вируса гепатита А могут различаться на 15-25% нуклеотидных последовательностей на уровне генотипов и 7,5% на уровне субтипов. При этом, как уже указывалось выше, все изоляты имеют высокую степень антигенного родства [71].
За последние годы накоплено достаточно много данных о циркуляции генетических вариантов ВГА на территории различных регионов мира. Установлено, что повсеместно превалирует I генотип ВГА. Наиболее часто от больных гепатитом А выделяли субтип IA по сравнению с IB (67% и 33% соответственно) [71]. Подтип IA распространен в Северной и Южной Америке, Европе, Китае, Южной Азии, Японии, Индии, Кубе. Подтип IB выявляли в Иордании, Северной Африке, Австралии и большинстве территорий, принадлежащих Средиземноморью. Значительно реже обнаруживается циркуляция ВГА генотипа III, который также имеет два подтипа: IIIА и IIIB. Данный генотип преобладает в Индии, Шри-Ланке, Непале, Малайзии, Швеции и США, встречается в отдельных регионах Швеции. Циркуляция ВГА субтипа ШВ обнаружена в Дании, а также в одном из районов Японии. Генотипы II и VII встречаются редко. Генотип II был изолирован во Франции в 1979 г., а VII - в Сьерра-Леоне в 1988 г. С 2001 г. появились сведения о ко-циркуляции различных генотипов или подтипов одного генотипа ВГА на отдельной территории [71, 119, 199].
В России первые исследования по определению генотипов ВГА проводились М.С. Балаяном [12]. Он выявил, что на территории Восточной Сибири и в Нижнем Новгороде циркулирует ВГА, принадлежащий подтипу IA [12]. В настоящее время эти сведения пополняются работами ряда исследователей. Так, по данным Е.В. Эсауленко (2002), С.Л. Мукомолова и соавт. (2003), I. Davidkin et al. (2003) IА субтип вируса гепатита А является высокоэндемичным для Северо-Западного региона России как при моно-, так и микст-инфекции [71, 119, 155]. Распространенность ША и ШВ субтипов ВГА на отдельных территориях страны оценили А.Т. Подколзин и соавт. (2002) [83].
До сих пор не установлена связь между циркулирующим генотипом (субтипом) ВГА и степенью тяжести заболевания, пораженностью отдельных возрастных групп населения, интенсивностью эпидемического процесса гепатита А на отдельных территориях, поскольку для этого необходимо не только заключение о происхождении ВГА на основе филогенетического анализа отдельных спорадически выделенных изолятов, но и обоснование в результате детального эпидемиологического расследования и динамического слежения за эпидпроцессом гепатита А в каждой конкретной ситуации на определенной территории. Возможно, гипотезу о формировании эпидемических штаммов ВГА, которые могут распространяться более интенсивно, вызывая рост заболеваемости, поддерживают данные многолетних наблюдений С.Л. Мукомолова и соавт. (2003), которые выявили различия изолятов ВГА, выделенных в Санкт-Петербурге в годы высокой заболеваемости ГА и межэпидемический период [71].
В целом, говоря о формировании эпидемических штаммов ВГА, подразумевается изменение меры его патогенности, т.е. вирулентности [20]. Такую задачу в определенной мере можно было бы решить, если установить ген патогенности (вирулентности) ВГА, как это уже расшифровано для ряда бактерий и вирусов. Однозначного мнения по данному вопросу пока нет. М.И. Михайлов (2002) считает, что по-новому взглянуть на проблему вирулентности ВГА позволяют результаты исследований, полученные S.U. Emerson et al. (2002), которые выявили два участка РНК ВГА, расположенные в генах VP1/2A и 2С, ответственных за вирулентные свойства вируса [65]. В свою очередь R. Fujiwara et al. (2002) указывают на то, что незначительные различия нуклеотидных последовательностей в центральной части б НТР генома ВГА могут влиять на тяжесть течения гепатита А [140, 174]. О возможной связи инфекционности ВГА с 5;-НТР генома косвенно свидетельствуют результаты экспериментальных исследований J.W. Li et al. (2002) [204].
В настоящее время известно, что вирус гепатита А среди бактерий и других энтеровирусов отличается наибольшей устойчивостью к действию различных факторов [12, 66]. По мнению М.С. Балаяна (1983), поддержание ВГА в природе, очевидно, полностью обеспечивается циркуляцией вируса в человеческой популяции и его высокой стабильностью во внешней среде [11]. К настоящему времени не так много работ посвящено изучению устойчивости ВГА к действию различных физико-химических факторов. По данным ВОЗ вирус гепатита А сохраняется при -20С годами, при +4 С -несколько месяцев, при +60С - в течение 60 мин, после высушивания на твердой поверхности при +25С и 42%-ной влажности до 1 мес. ВГА устойчив в диапазоне рН 3,0-11,0, к кислотам (рН 3,0) в течение 3-х часов при 25 С; к 20% эфиру 24 ч при +4 С [11, 12, 99, 237]. При экспериментальном загрязнении ВГА овощей L. Croci et al. (2002) обнаруживали РНК ВГА до 7 дней, при этом вымытые овощи не гарантировали освобождение от вируса [243].
Характеристика эпидемического процесса гепатита А на отдельных территориях г. Н. Новгорода в современный период
Известно, что изучение закономерностей и особенностей эпидпроцесса ГА на конкретной территории является важным звеном эпидемиологического надзора за данной инфекцией и научной основой для совершенствования существующей системы профилактических и противоэпидемических мероприятий.
Изучением эпидемиологических аспектов проблемы ГА в г. Н.Новгороде (г. Горьком) занимались М.Д. Алейник (1968), Т.Н. Быстрова (1984, 1999), Т.Г.Макарова (2004). Были выявлены основные закономерности развития эпидпроцесса ГА на территории города за весь период официальной регистрации как самостоятельной нозологической формы (с 1968 г.), а также особенности его проявлений в последнее десятилетие. Работа Т.Г. Макаровой была закончена в 2002 г. На основании различий в уровне регистрируемой заболеваемости установлена неравномерность распределения ГА по отдельным административным районам Н. Новгорода, подтвержденная также результатами сероэпидемиологических исследований [58]. Данный раздел настоящего исследования является логическим продолжением проведенных исследований, целью его явилась оценка проявлений эпидпроцесса ГА на отдельных территориях города для изучения роли водного фактора передачи в условиях спорадической заболеваемости.
Вначале представляло интерес уточнить этиологическую структуру ОВГ в г. Н. Новгороде в целом и его отдельных территориях, поскольку определение долевого участия той или иной нозологической формы позволяет целенаправленно планировать профилактические и противоэпидемические мероприятия. Результаты изучения этиологической структуры ОВГ в г. Н. Новгороде за период 1994-2005 гг. по средним величинам свидетельствуют о преобладании доли ГА по отношению к парентеральным гепатитам В и С (52,5±1,2% против 46,2±1,2%, р 0,001). Вместе с тем, выявлены колебания по годам удельного веса ГА, ГВ и ГС. Доля ГА варьировала в значительных пределах - от 16,6±1,4% в 1999 г. до 95,5±0,4% в 2005 г. (рис. 3).
При этом сохраняется закономерное повышение удельного веса ГА и снижение доли ГВ и ГС в годы периодических подъемов заболеваемости, характерных для ГА. Очевидно, что, как и в предыдущие десятилетия, характер многолетней динамики заболеваемости ОВГ определяется ГА. Установлено, что в прошедшем 2005 г. на фоне начавшегося периодического подъема заболеваемости ГА по сравнению с предыдущим 1994 г. доля его в структуре ОВГ увеличилась с 65,5±0,9% до 95,5±0,4%, а удельный вес гепатитов с парентеральным механизмом передачи снизился в 7,6 раза.
Доля ГА среди детей по-прежнему преобладает, составляя 72,9-91,1% всех случаев вирусных гепатитов. За анализируемый период обращает на себя внимание низкая выявляемость безжелтушных форм ГА. Так, в годы с высокими показателями заболеваемости в 1994, 2001 гг. их доля не превышала 5,0±0,5%, 3,8±0,5%, соответственно. В 2005 г. в условиях вспышечной заболеваемости ГА на территории г. Н.Новгорода безжелтушные формы инфекции были выявлены лишь в 14,5±0,2% случаев. Данное обстоятельство, возможно, обусловлено неполной диагностикой безжелтушных форм ГА, в частности низкой их регистрацией за счет снижения объема проводимых лабораторных исследований в очагах инфекции. В то время как активное выявление таких форм, особенно среди детского населения, имеет эпидемиологическую значимость не только в плане выявления и изоляции больных, но и прогнозирования ситуации по гепатиту А.
С 1997 г. на территории Н.Новгорода началась официальная регистрация гепатитов сочетанной этиологии. За анализируемый период выявлена тенденция к снижению их доли в структуре ОВГ, в последние годы величина стабилизировалась на уровне 5,6±0,9%. Доля ГА в составе микст-гепатитов снизилась с 20,7±1,0% в 2002 г. до 9,3±0,6% в 2003 г., а в 2004 г. они вовсе не регистрировались. Вероятнее всего, отмеченная динамика связана с уровнем заболеваемости ГА в эти годы. 1 ак, показатель заболеваемости ГА в 2002 г. составил 82,6 о/оооо и доля ГА-микст была максимальной, напротив, в межэпидемические годы - она была минимальной. С другой стороны, в указанный период происходило и постепенное снижение уровня заболеваемости острыми формами ГВ и ГС (в 7,4 и 4,9 раза, соответственно). Этиологически нерасшифрованными остаются 0,08-0,3% вирусных гепатитов, в связи с чем, возникает вопрос о природе этой части заболеваний.
При сравнительной оценке территорий заречной и нагорной части выяснилось, что характеристика этиологической структуры ОВГ в них не отличалась от города в целом (рис. 4). Установлено, что средняя величина удельного веса ГА в заречной части города была незначительно выше по сравнению с нагорной (53,0±1,9% и 42,7±3,8%, соответственно). При этом более контрастные различия в доле ГА были отмечены в последние 4 года (р 0,05). Несмотря на статистически недостоверные различия, по среднемноголетним данным, доли ГА на территории отдельных районов, можно говорить о тенденции ее преобладания в Автозаводском (53,6±3,6%) и Сормовском (49,5±4,0%) районах по отношению с Приокскому (40,9±8,0%).
Информативность определения РНК ВГА методом ОТ-ПЦР в клинических субстратах
На современном уровне знаний для решения вопроса о разработке рациональной тактики профилактических и противоэпидемических мероприятий в системе эпиднадзора за гепатитом А целесообразно использовать комплекс методов, включая не только эпидемиологический анализ заболеваемости, но и клинико-лабораторное обследование больных ГА и контактных из очагов с применением современных специфических и высокочувствительных методов диагностики инфекции. Проведенная нами апробация тест-системы для определения РНК ВГА демонстрирует существенные преимущества, основанные на высокой чувствительности и специфичности, метода ОТ-ПЦР по сравнению с традиционно используемым в практике ИФА.
Однако важным с эпидемиологической точки зрения является не только возможность обнаружения ВГА в различных субстратах, но и оценка частоты и длительности выявления его специфических маркеров.
В связи с этим, нами проанализированы результаты обследования 54 больных гепатитом А при поступлении в стационар. Материалы исследования представлены в таблице 4. Полученные данные свидетельствуют о том, что при поступлении в стационар (в первые 3 дня желтушного периода) РНК ВГА была обнаружена в образцах фекалий и сыворотке крови всех больных. При этом в слюне РНК ВГА была выявлена у каждого третьего больного (32,1 ±6,4%). Напротив, экскреция Аг ВГА с фекалиями установлена у 12,9±4,6% обследованных, а использование ИФА для определения Аг ВГА в сыворотке крови и слюне оказалось неинформативным. Что касается исследования сыворотки крови и слюны, то по данным литературы с появлением желтухи Аг ВГА в этих субстратах, как правило, не обнаруживали [11, 104, 108]. В отличие от существующих представлений о частичном или полном прекращении выделения ВГА с фекалиями при появлении желтухи, основанных на использовании РИА и ИФА, результаты наших исследований, полученные с применением метода ОТ-ПЦР, указывают на содержание вируса в фекалиях у 100% больных. К тому же выявлен высокий процент обнаружения РНК ВГА в сыворотке крови и в слюне. Для оценки длительности обнаружения РІЖ ВГА в изучаемых субстратах было проведено динамическое наблюдение за больными ГА (рис. 16). субстратах больных гепатитом А в динамике Исследование позволило установить, что на 25-й день с момента появления желтухи при выписке из стационара в слюне РНК ВГА уже не обнаруживалась, но положительными оставались фекалии 90,6±5,2% реконвалесцентов, в сыворотке крови число находок сократилось в 1,7 раза (р 0,05). При этом частота выявления РНК ВГА в сыворотке крови (56,3±8,8%) была достоверно ниже, чем в фекалиях (р 0,05). Обращает на себя внимание тот факт, что у двух человек при выписке из стационара продолжали выявлять и Аг ВГА в фекалиях.
Таким образом, получены новые данные, основанные на применении метода ОТ-ПЦР, о частоте и длительности обнаружения ВГА в различных клинических субстратах больных ГА. Что касается обнаружения РНК ВГА в сыворотке крови, наши результаты согласуются с данными, имеющимися в литературе. Так, в исследованиях N. Zheleznova et al. (2003) частота выявления РНК ВГА в сыворотке крови составила 75,2% и длилась до 34 дня у 42,9% больных [215]. Причем авторы применяли праймеры, направленные на вариабельный участок генома ВГА VP1/2A. В противоположность этому праймеры, представленные в использованной нами тест-системе, фланкируют высококонсервативный участок генома, гомологичный у всех штаммов вируса, чем, возможно, и обусловлен тот факт, что РНК ВГА в сыворотке крови обнаруживалась чаще.
Нами проведены первые в России исследования по определению РНК ВГА в фекалиях и слюне больных гепатитом А методом ОТ-ПЦР. В связи с тем, что в доступной литературе отсутствуют сведения о частоте обнаружения РНК ВГА в указанных субстратах у больных ГА людей, сопоставить полученные нами данные не представляется возможным. В то время как результаты продолжительного выявления РНК ВГА в фекалиях согласуются с единичными данными зарубежных авторов [168].
Находки РНК вируса гепатита А в сыворотке крови и слюне больных обусловливают необходимость изучения вопроса о значимости этих субстратов при распространении инфекции и о возможности реализации, кроме традиционных, иных путей передачи ГА, например, парентерального.
Продолжительное, не менее 25 дней от начала заболевания, обнаружение РНК ВГА практически у всех реконвалесцентов в фекалиях свидетельствует об удлинении срока эпидемической опасности больных гепатитом А и необходимости пересмотра временных параметров их изоляции и критериев допуска в коллективы декретированных контингентов населения.
Следующим направлением исследования явилось использование метода ОТ-ПЦР при расследовании групповой и вспышечной заболеваемости ГА. С этой целью были обследованы контактные из очагов, сформировавшихся в детских организованных коллективах. Все больные желтушной формой ГА были госпитализированы. Среди контактных в рамках регламентированных противоэпидемических мероприятий в очагах инфекции совместно со специалистами территориальных центров санэпиднадзора проведено клинико-эпидемиологическое обследование.
Выявлено, что частота обнаружения анти-ВГА IgM среди детей варьировала от 0% в очагах с одним манифестным случаем ГА до 15,6±4,5% со множественными случаями заболевания (в среднем составила 12,2±3,6%). При этом у детей отсутствовали какие-либо клинические проявления болезни и биохимические изменения в крови. Среди контактных доля иммунных по результатам определения анти-ВГА IgG составила 25,6±4,8%, что превышало величину иммунной прослойки среди детей 1-14 лет г. Н. Новгорода в 2003-2004 гг. (7,5±0,8%, р 0,001) и также свидетельствовало об эпидемическом неблагополучии по ГА в представленных коллективах.
Закономерности распространения вируса гепатита А в водных объектах
Несмотря на общую тенденцию к снижению заболеваемости гепатитом А, в России отмечается увеличение числа вспышек этой инфекции [23, 26, 27, 52, 60]. Причем некоторые специалисты считают, что водный путь передачи имеет ведущее значение в эпидемическом процессе гепатита А. В литературе представлены эпидемиологические критерии роли водного фактора распространения инфекции при возникновении подъемов (вспышек) заболеваемости гепатитом А.
По-прежнему в России, как и в других странах, рутинный контроль вирусного загрязнения воды в практике санэпидслужбы осуществляется на основе косвенных показателей. Эпидемическая безопасность воды различного вида водопользования по вирусологическим показателям регламентируется документами водно-санитарного законодательства, которые включают как перечень нормируемых показателей, так и методы их контроля. С 18.11.2005 г. вступили в действие новые Методические указания «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов» (МУК 4.2.2029-05), которые предусматривают определение маркеров ВГА методами ИФА и ОТ-ПЦР в водоисточниках и питьевой воде в том случае, если при их исследовании на колифаги и другие косвенные показатели вирусного загрязнения будут получены результаты, не соответствующие требуемым нормативам.
Однако обнаружение, например колифагов, не всегда является достоверным критерием наличия в ней ВГА, и, наоборот, Аг ВГА может быть обнаружен в воде, стандартной по микробиологическим показателям [32, 73, 96, 116]. Поэтому в настоящее время наиболее адекватным представляется непосредственное определение в водных объектах вируса гепатита А, его антигена и/или рибонуклеиновой кислоты.
Исходя из этого, актуальным является совершенствование методической базы эпиднадзора при проведении мониторинга водных объектов за контаминацией вирусом гепатита А с применением специфических методов детекции, в частности ОТ-ПЦР.
Многолетний опыт использования ИФА для детекции Аг ВГА в воде позволил охарактеризовать роль водного фактора передачи инфекции на ряде территорий [18, 23, 46, 84, 86, 93, 97, 101]. Однако работы были выполнены в основном на водопроводной воде, носили фрагментарный характер, период наблюдения ограничен 3-6 годами. До сих пор мало изученным остается вопрос о закономерностях распространения ВГА во внешней среде, в частности в водных объектах.
Нами проведены исследования, направленные на изучение некоторых закономерностей распространения вируса гепатита А в объектах внешней среды на основе определения его специфических маркеров в воде и установление их связи с заболеваемостью гепатитом А на территории города в условиях как спорадической, так и вспышечной заболеваемости.
С 2003 г. параллельно с традиционно использовавшимся ИФА для детекции ВГА в воде нами стал применяться метод ОТ-ПЦР. Результаты, полученные в 2003-2004 гг., сопоставляли с материалами за предыдущие годы (с 1995 г.), когда для детекции ВГА в воде использовался только ИФА.
Были проанализированы результаты обнаружения вируса гепатита А в воде открытых водоисточников и резервуаров чистой воды фильтростанций города. Выбор объектов определяло то обстоятельство, что в РЧВ вирус мог проникнуть только с водозабором. Другие реальные причины присутствия ВГА в РЧВ ряд ли возможны.
По результатам многолетних наблюдений (с 1995 по 2004 гг.) частота находок вируса в водных объектах колебалась от 0% (1996-1999, 2003 гг.) до 15,0±3,3% (2002 г.). Как показано на рис. 17, ВГА определяли с большей частотой на подъеме и пике заболеваемости ГА. При этом использование метода ОТ-ПЦР в годы спада эпидпроцесса гепатита А значительно повысило выявляемость ВГА в воде (11,6±2,9% и 6,6±2,2% в 2003 и 2004 гг., соответственно). В то время как ИФА оказался практически неэффективным в межэпидемический период, в том числе 1996-1999 гг. Последний факт, по нашему мнению, свидетельствует о том, что в годы с низким уровнем заболеваемости ГА концентрация возбудителя в водных объектах находится ниже «фонового» уровня, обеспеченного пределом эффективности способов концентрирования вируса из воды и чувствительности метода его детекции, в частности ИФА.
Статистическая обработка данных позволила выявить прямую связь уровней заболеваемости ГА и частоты обнаружения ВГА в воде. Коэффициент корреляции равен г=+0,64±0,19, что соответствует прямой связи средней степени корреляции (р 0,001). Такая закономерность указывает на существование внутренней зависимости между процессами увеличения массы выделяемого возбудителя больными ГА и учащения находок ВГА во внешней среде или, наоборот, при значительной обсемененности вирусом внешней среды увеличивается уровень заболеваемости этой инфекцией. Следует учитывать, что гепатит А относится к антропонозным инфекциям. Единственным источником и естественным резервуаром инфекции считается человек, больной одной из форм ГА. Вирус гепатита А выделяется с фекалиями и через сточные воды попадает во внешнюю среду, в том числе в открытые водоемы.
Как представлено на рис. 15, ВГА достоверно чаще выявляли в речной воде по сравнению с очищенной из резервуаров чистой воды и водораспределительной сети (р 0,05). При этом, несмотря на отсутствие статистически достоверных различий (р 0,05), можно говорить о тенденции к большему распространению ВГА в русле реки Волга (19,2±7,7%) по сравнению с рекой Ока (11,4±4,6%). Частота его обнаружения в точках водозабора, расположенных по правому и левому берегам Оки, была одинаковой.
Находки вируса в РЧВ фильтростанций за анализируемый период в ряде случаев свидетельствуют о недостаточно эффективной работе очистных сооружений. Это может быть связано как с неэффективностью методов водоподготовки, включающей систему очистки и обеззараживания, так и с нарушением технологического режима, что диктует необходимость проведения специальных исследований по совершенствованию способов освобождения воды от ВГА.
