Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 5
1.1. Морфология хеморецепторных сенсилл 5
1.2. Классификация хеморецепторных сенсилл 7
1.3. Ультраструктура и расположение хеморецепторных сенсилл 11
1.4. Функциональные основы контактной хеморецепции гусениц чешуекрылых 17
1.5. Поведенческие основы хемокоммуникации гусениц чешуекрылых 28
2. Общие вопросы методики 38
2.1. Материал 38
2.2. Техника электронной микроскопии 38
2.3. Регистрация электрофизиологической активности хеморецепторных клеток сенсилл 39
2.4. Изучение влияния метаболитов гусениц на поисковое поведение гусениц и яйцекладное поведение самок мельничной огневки 44
2.5. Статистический анализ полученных результатов 55
3. Характер действия суммарного секрета и экскрементов гусениц на поисковое поведение гусениц разных возрастов 56
3.1. Характер действия чистого пищевого субстрата и субстрата, содержащего различные количества метаболитов на поисковое поведение гусениц 56
3.2. Изучение характера действия экскрементов и суммарного секрета на поисковое поведение гусениц 72
3.3. Обсуждение результатов 109
4. Морфология и ультраструктура сенсилл антенн, максилл и максиллярных щупиков гусениц мельничной огневки 121
4.1. Морфология и ультраструктура сенсилл антенн 121
4.2. Морфология и ультраструктура сенсилл максилл 128
4.3. Обсуждение результатов 134
5. Электрофизиологическое изучение хеморецепторных клеток стилоконических сенсилл максилл гусениц мельничной огневки 140
5.1. Электрофизиологическая характеристика ответов солевых рецепторов 140
5.2. Электрофизиологическая характеристика ответов сахарных рецепторов 147
5.3. Реакция хеморецепторных клеток стилоконических сенсилл на раздражение экстрактами секрета слюнных желез и экскрементов 153
5.4. Обсуждение результатов 157
6. Влияние метаболитов гусениц на яйцекладное поведение самок мельничной огневки 168
6.1. Характер действия субстрата, содержащего различные количества метаболитов гусениц на яйцекладное и поисковое поведение самок 169
6.2. Роль различных видов рецепции самок в восприятии метаболитов гусениц 183
6.3. Роль экскрементов и суммарного секрета гусениц в формировании яйцекладного поведения самок 189
6.4. Обсуждение результатов 200
Заключение 211
Выводы 214
- Классификация хеморецепторных сенсилл
- Техника электронной микроскопии
- Изучение характера действия экскрементов и суммарного секрета на поисковое поведение гусениц
- Морфология и ультраструктура сенсилл максилл
Введение к работе
Актуальность исследования: Химическая коммуникация является одним из древнейших видов коммуникации (Наумов и др., 1967). Химические стимулы для передачи информации внутри вида или между видами использовались еще предками насекомых при обитании в водной среде.
С выходом на сушу и освоением воздушной среды химическая коммуникация получила свое новое развитие. В наибольшей степени этот тип коммуникации развит в отрядах Lepidoptera, Hymenoptera и Trichoptera, хотя в различной степени присущ и другим отрядам насекомых (Елизаров, 1978).
В настоящее время специфические химические стимулы, обеспечивающие перенос информации на имагинальной стадии от одной особи к другой наиболее детально изучены в отряде Lepidoptera. При этом роль химических стимулов в передаче информации на других стадиях жизненного цикла и, в частности, на личиночной стадии известна гораздо меньше. Считается, что на личиночной стадии химические стимулы определяют, главным образом, взаимоотношения между личиночной гемипопуляцией насекомых и кормовым растением (Ма, 1972; Dethier, 1973).
Еще меньше известно о роли химических стимулов, участвующих в обмене поведенческой информацией между личиночной и имагинальной стадиями жизненного цикла, обеспечивающей успешное развитие популяции. Для видов отряда Diptera показано, что регулирование плотности личиночной популяции обеспечивается имагинальной стадией за счет использования самками феромонов, регулирующих яйцекладное поведение других самок (Katsoyannos, 1975). У имаго отряда Lepidoptera не выявлены химические стимулы, участвующие в регулировании плотности личиночной гемипопуляции.
В то же время известно, что на яйцекладное поведение самок чешуекрылых могут влиять другие стадии жизненного цикла (HUker, 1989), в том числе и личиночная стадия развития (Corbet, 1973). Изучение взаимоотношений между личиночной и имагинальной стадией жизненного цикла с использованием специфических химических стимулов находится еще на начальном этапе развития и в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем хемокоммуникации чешуекрылых.
Объектом нашего исследования были гусеницы различных возрастов и самки мельничной огневки Ephestia kuehniella Zell. (Phycitidae, Lepidoptera). Этот вид является одним из самых распространенных и экономически значимых насекомых - вредителей зерна и зернопродуктов. По данным организации по продовольствию и сельскому хозяйству ФАО ООН, потери хранящегося зерна от насекомых-вредителей составляют в разных странах от 5 до 10 %. Большинство популяций мельничной огневки тесно связано с местами хранения запасов зерна, для которых они являются не только кормовым субстратом, но и средой обитания. Вред, причиняемый гусеницами мельничной огневки, заключается не только в повреждении непосредственно зерна и зернопродуктов, но и в загрязнении их гусеничной паутиной, линочными шкурками и экскрементами, что нарушает производственный цикл хранения и переработки зерна и делает непригодными продукты его переработки для дальнейшего использования (Загуляев, 1965).
С учетом экономического значения этого вида большое количество работ было посвящено изучению половой хемокоммуникации, а также прикладных аспектов, связанных с эффективностью использования различных классов инсектицидов для борьбы с этим видом. Высокая токсичность инсектицидов и возникновение к ним резистентности вызвали необходимость поиска альтернативных методов снижения численности этого вида, с использованием естественных механизмов регулирования численности, и в частности, с применением специфических химических
стимулов. Данное направление требует тщательного изучения внутривидовых взаимоотношений и роли в них специфических химических стимулов. Однако до настоящего времени отсутствуют работы, посвященные изучению роли химических стимулов на личиночной стадии этого вида, учитывающие морфологические особенности хеморецепторного аппарата, а также физиологические особенности чувствительности гусениц к химическим стимулам.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выяснение роли метаболитов гусениц в хемокоммуникации мельничной огневки Ephestia kuehniella Zell. (Phycitidae, Lepidoptera).
Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние разных факторов (временной, пространственный, кормовой субстрат) на способность гусениц к формированию скоплений.
Изучить влияние кормового субстрата и метаболитов гусениц на поисковое поведение гусениц мельничной огневки разных возрастов. Выяснить роль компонентов метаболитов гусениц в формировании суммарного влияния метаболитов.
Изучить морфологию и ультраструктуру рецепторного аппарата антенн и ротовых частей гусениц, определить модальность отдельных сенсилл.
Изучить электрофизиологические характеристики хеморецепторных клеток вкусовых сенсилл гусениц и выявить среди них хеморецепторные клетки, чувствительные к компонентам метаболитов гусениц.
Выяснить влияние метаболитов гусениц на яйцекладное поведение самок мельничной огневки и роль в этом процессе отдельных компонентов метаболитов гусениц.
Данная работа проводилась на кафедре энтомологии биологического факультета МГУ в период с 2000-го по 2004 год.
За создание благоприятной обстановки в ходе выполнения настоящей работы хочется выразить искреннюю признательность всему коллективу кафедры энтомологии во главе с доктором биологических наук, профессором Р.Д. Жантиевым и, особенно, сотрудникам кафедры - Е.Е. Синициной, О.С. Корсуновской и Д.П. Жужикову.
За помощь в создании установки для регистрации электрофизиологической активности рецепторных клеток сенсилл хочется выразить большую благодарность доктору биологических наук Д.Н. Лапшину.
Особенно приятно выразить глубокую благодарность и уважение доктору биологических наук, профессору СЮ. Чайке за заботу, внимание и научное руководство данной работой.
Классификация хеморецепторных сенсилл
Сенсиллы отличаются большим разнообразием строения, особенно их кутикулярного отдела. В настоящее время существует два подхода к классификации сенсилл. Первый подход, предложенный Слайфер (S lifer, 1970) основан на функциональных особенностях проницаемости кутикулы сенсилл к различным красителям. По этой классификации всё разнообразие хеморецепторных сенсилл можно свести к двум типам. К первому типу относятся толстостенные контактные хеморецепторы, а ко второму типу - тонкостенные обонятельные хеморецепторы. Основным недостатком этой классификации является сложность охвата всего многообразия морфологических черт сенсилл. Более совершенная классификация, основанная на особенностях ультраструктуры их кутикулярного отдела, была предложена Алтнер (Altner et al., 1970; Altner, 1977). Согласно ей все сенсиллы разделяются на три основных типа: NP, ТР и WP. Сенсиллы NP (no pore-sensilla) не имеют пор в кутикулярном отделе и содержат механо-, гигро- или терморецепторные клетки. Сенсиллы ТР (tip pore-sensilla) имеют одну пору на вершине волоска и включают вкусовые и механорецепторные клетки. Сенсиллы WP (wall pore-sensilla) имеют многочисленные поры в стенке волоска. По особенностям строения стенки кутикулярного отдела последний тип подразделяется на два подтипа. Первый подтип - SW имеет гладкую одинарную кутикулярную стенку, пронизанную порами с поровыми трубками, а сенсиллы подтипа DW имеют двойную кутикулярную стенку, пронизанную радиальными каналами. В состав таких сенсилл входят обонятельные, термо- и гигрорецепторные клетки. Основным недостатком этой классификации является сложность и длительность методики приготовления препаратов, в результате чего идентификация сенсилл возможна только после их электронно-микроскопического изучения.
Однако данное направление в классификации сенсилл, по нашему мнению, является наиболее прогрессивным, поскольку оно дает возможность во многих случаях достаточно точно определить функциональную модальность сенсилл конкретного типа. Другой подход к классификации сенсилл основан на особенностях внешней морфологии их кутикулярного отдела (Schenk, 1903; Snodgrass, 1926, 1935; Bullock et at., 1965). В соответствии с этой классификацией, которая в настоящее время опирается преимущественно на данные сканирующей электронной микроскопии (Елизаров, 1978), принято считать, что все морфологическое разнообразие сенсилл насекомых сформировалось в результате эволюционной модификации трихоидных сенсилл, у которых кутикулярный отдел имеет вид волоска. В результате преобразования формы и размеров трихоидной сенсиллы образовались различные типы сенсилл; трихоидные сенсиллы с тонкостенными и толстостенными волосками; хетоидные сенсиллы, обладающие игловидным волоском; базиконические сенсиллы с закругленной вершиной; булавовидные сенсиллы с утолщенным апикальным отделом волоска и другие, менее распространенные типы. Формирование чешуевидных сенсилл было результатом постепенного преобразования волоска в чешуйку. Изменение формы волоска привело к развитию целосферических сенсилл, у которых кутикулярный отдел имеет форму шаровидного выроста. Различные морфологические типы плакоидных сенсилл появились в результате превращения волоска в пластинчатую морфологическую структуру. В настоящее время данная классификация остается наиболее популярной среди исследователей, поскольку она отражает и историческую преемственность, согласуясь с классификацией сенсилл, разработанной в эпоху исключительно светооптических исследований. Однако если исследователя интересует не только морфологические, но и функциональные особенности сенсилл, данная классификация малопригодна, так как сенсиллы, имеющие схожие внешние черты строения кутикулярного отдела, могут иметь разные модальности. В настоящее время сделана попытка совместить классическую классификацию сенсилл Снодграсса с функциональной классификацией Алтнер (КеІІ, 1999). По этой классификации выделяются следующие типы сенсилл: Трихоидная сенсилла (WP): обычно длинная (30-600 нм) и тонкая с заостренной вершиной. Долгое время все трихоидные сенсиллы относили исключительно к механорецепторам. Их ольфакторная функция была неизвестна до 1964 г., когда были впервые опубликованы данные по электрофизиологической регистрации биопотенциалов от отдельной трихоидной сенсиллы, и по обнаружению нескольких дендритов внутри кутикулярного отдела (Schneider et al., 1964). Различия в модальности этих сенсилл отражаются на строении кутикулярного отдела. Кутикулярный отдел ольфакторной трихоидной сенсиллы имеет неэластичное основание и пористую стенку с многочисленными внутренними поровыми трубками. Иннервация, обычно, осуществляется 1 - 3 ольфакторными рецепторними нейронами, каждый из которых дает неветвящийся дендрит. Трихоидная сенсилла с гибкой сочленовной мембраной (NP и ТР): эти сенсиллы имеют обычно механорецепторную и вкусовую модальность.
Однако на антеннах муравьев была обнаружена изогнутая трихоидная сенсилла с большим количеством пор в кутикулярном отделе, что свидетельствует о ее возможной ольфакторной модальности. Базиконические сенсиллы обычно имеют ольфакторную модальность. Это довольно короткие (10-80 нм) сенсиллы с закругленной вершиной. Они имеют неэластичное основание, кутикулярный отдел пронизан многочисленными порами (WP) с поровыми трубочками. Обычно они иннервируются несколькими (одна или две у жуков), или многочисленными (до 50 у саранчевых) нейронами с ветвящимися дендритами (Ernst, 1969). В некоторых случаях базиконическая сенсилла описывается как трихоидная сенсилла с тупым концом, как на антеннах комаров (Mclver, 1982). Базиконические сенсиллы со складчатой поверхностью кутикулярного отдела имеются на лабиальных пальпах у бабочек и на максиллярных пальпах комаров. Они содержат единственную рецепторную клетку, чувствительную к СО2 (Bogner, 1986; Grant et al., 1995). Антенны отдельных видов ос (Psenulus concolor, Sphecoidea) несут большие, похожие на базиконические, сенсиллы с порами в дистальной части кутикулярного отдела, иннервируемые большим количеством рецепторных клеток. Плакоидные сенсиллы в большей степени характерны для Hymenoptera и Coleoptera. Они состоят из овальной тарелкообразной кутикулярной части, пронизанной многочисленными порами. Диаметр сенсилл варьируют от 9 до 16 нм. Внутри кутикулярного отдела располагаются дендриты многочисленных нейронов. Булавовидные сенсиллы встречаются на максиллярных пальпах длинноусых двукрылых, имеют тонкую кутикулярную стенку и иннервируются тремя рецепторными клетками.
Их изучение позволило определить, что ольфакторные рецепторные клетки способны воспринимать запаховые раздражители и СОг. Стенки кутикулярного отдела сенсилл данного типа пронизаны порами с поровыми трубками. Хетоидные сенсиллы представляют собой длинные толстостенные волоски с острой вершиной. Поверхность кутикулярного отдела несет продольные борозды и мельчайшие ответвления. Обычно хетоидные сенсиллы имеют либо механорецепторную, либо вкусовую модальность. Стилоконические сенсиллы имаго отличаются наличием двойной стенки кутикулярного отдела и отсутствием пор. Они обычно иннервируются тремя рецепторними клетками, имеющими неветвящиеся дендриты. Две из них чувствительны к изменению влажности, а одна к изменению температуры. 1.3. Ультраструктура и расположение хеморецепторных сенсилл Формирование хеморецепторных сенсилл насекомых осуществляется в результате серии последовательных митотических делений одной клетки, дающей начало волоскообразующим, обкладочным и рецепторным клеткам. К настоящему времени достаточно детально выяснены ультраструктурные особенности онтогенеза вкусовых (Kramer, Molen, 1980; Hansen, Hansen-Delkesramp, 1983) и обонятельных (Schmidt, Kuhbandner, 1983; Kuhbandner 1985; Martini, 1986) сенсилл. Несмотря на наличие многих общих признаков в организации сенсилл насекомых, сенсиллам разной модальности свойствен свой комплекс признаков (Altner, Prillinger, 1980; Zacharuk, 1980, 1985; Keil, Steinbrecht, 1984). Так, в частности, для обонятельных сенсилл такими признаками являются ветвление периферических отростков рецепторных клеток и наличие многих пор в кутикулярном отделе.
Техника электронной микроскопии
Для сканирующей электронной микроскопии отделенные головы гусениц обезвоживали в 75%, 90%, 100% этиловом спирте с последующим помещением их в ацетон на 1,5 часа. После этого в течение 1 часа обезвоженные препараты высушивали. После высушивания препараты закрепляли на столике микроскопа, напыляли в течение 5 минут платино-палладиевой смесью и изучали при помощи сканирующего электронного микроскопа Hitachi S-405A. Полученное изображение оцифровывали с помощью АЦП и анализировали на компьютере. Для изучения ультраструктуры в трансмиссионном электронном микроскопе головы гусениц отделяли от тела и фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида на ОД М фосфатном буфере при рН 7,3. Время фиксации составляло 2,5 часа при температуре 4 С. Затем материал промывали в буферном растворе и дофиксировали в 2 %-ном растворе четырехокиси осмия в течение 1-1,5 часов. Обезвоженный в серии спиртов материал контрастировали в насыщенном растворе уранилацетата в 70 -ном этиловом спирте в течение 14 часов. После окончательного обезвоживания материал заливали в эпоксидную смолу эпон. Срезы готовили с использованием ультрамикротома LKB-3, с использованием алмазных ножей в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета МГУ. Окрашивание готовых срезов производили с использованием лимоннокислого свинца по методу Рейнольдса (Reynolds, 1963) с последующим исследованием на электронном микроскопе JEM-100В при ускоряющем напряжении 75 кВ. 2.3.
Регистрация электрофизиологической активности хеморецепторных клеток сенсилл Изучение общей электрофизиологической активности хеморецепторных клеток стилоконических сенсилл проводили с использованием водных растворов неорганической соли КС1 и водных растворов сахарозы, 0(+)-глюкозы и 0(-)-фруктозы фирмы Merck. Водные растворы Сахаров состояли из смеси Сахаров, различной концентрации и 0,03 М водного раствора КО, использованного в качестве электролита. Изучение чувствительности хеморецепторных клеток стилоконических сенсилл к суммарному гусеничному секрету и гусеничным экскрементам проводили с использованием водноспиртового раствора электролита (0,03 М водного раствора КС1 / 5 % этилового спирта), в котором было растворено различное количество составных частей метаболитов гусениц. Перед началом проведения электрофизиологических экспериментов гусениц извлекали из маточной лабораторной культуры и содержали в пустых чашках Петри. В основе регистрации биоэлектрической активности контактных сенсилл ротовых частей насекомых лежит методика раздражающей и отводящей пипетки (Hodgson et al., 1955). Регистрация микропипеткой потенциалов действия чувствительной клетки возможна благодаря формированию возвратных потенциалов действия. У насекомых, возбуждение чувствительной клетки, возникающее в дендритном холмике, распространяется не только центростремительно по аксону, но и центробежно, по дендриту чувствительной клетки, входящему в кутикулярную часть сенсиллы (Morita, Takeda, 1959). Основной принцип работы этого метода состоял в том, что с апикальной порой контактной сенсиллы контактирует стеклянная микропипетка с активным серебряным электродом внутри, заполненная раствором, содержащим раздражитель (рис. 2.1). Однако этот метод в наших исследованиях оказался неэффективным.
Недостатком этого метода, является то, что в качестве препарата использовалась изолированная головная капсула насекомого. Однако длительность жизни изолированного препарата обычно невелика, при этом было невозможно точно вычислить временные рамки, при которых изолированный препарат давал адекватные ответы. Поэтому в экспериментах мы использовали усовершенствованную методику отведения биопотенциалов от живого насекомого (Gothilf, Hanson, 1994). Основным достоинством этой методики было то, что регистрация биопотенциалов велась на живом обездвиженном насекомом, при этом адекватность ответа на раздражитель сохранялась у препарата более 12 часов. Для механического фиксирования гусеницы использовали круглый латексный воротничок, толщиной 0,5 мм, диаметр которого совпадал с диаметром пробирки. В центре воротничка проделывали отверстие, диаметром 1 мм. Гусеницу продевали через центральное отверстие латексного воротничка таким образом, что головная капсула и первая пара ног оставалась с одной стороны, а оставшаяся часть тела с другой, при этом латексный воротничок защищал ротовые части гусеницы от проникновения проводящего раствора соли из пробирки. Перед помещением гусеницы в пробирку с раствором соли ее обездвиживали, используя методику, разработанную на тефретидах (Tanaka et al., 1970). Живую гусеницу в течение 3 минут выдерживали в дистиллированной воде, при этом следили за тем, чтобы ни одна из частей тела не контактировала с атмосферным воздухом и на теле гусеницы, особенно в районе дыхалец, не скапливались пузырьки воздуха. После этого обездвиженную гусеницу с латексным воротничком помещали в пробирку диаметром 5 мм, заполненную раствором 0,1 М КО. Солевой раствор, в данном случае, выполнял функции электролита, связывая поверхность тела гусеницы с индифферентным серебряным электродом, впаянным в пробирку. При этом гусеница располагалась таким образом, что индифферентный электрод не касался поверхности тела гусеницы.
В результате готовый препарат представлял собой пробирку с индифферентным электродом, заполненную электролитом, в которую была погружена живая гусеница, таким образом, что голова и ротовые части были расположены снаружи, доступные для стимулирования пипеткой с раствором раздражителя и активным электродом внутри (рис. 2,2). Отличие нашей методики от методики, предложенной Хансоном, состоит в том, что мы оставляли в контакте с атмосферным воздухом помимо головной капсулы еще и часть туловища, благодаря чему, в ходе эксперимента не наступала асфиксия, и готовый препарат стабильно работал более шести часов. Для электрофизиологической регистрации импульсной активности стилоконических сенсилл максилл, препарат располагали на пластиковой подставке горизонтально под микроскопом таким образом, чтобы в зоне видимости микроскопа были видны ротовые части гусеницы. Регистрацию импульсной активности вели в экранированной металлической камере и производили с помощью усилителя электрических потенциалов биологических объектов УБП1-02 (рис. 2.3). Верхняя граница полосы пропускания усилителя была равна 1кГц, нижняя граница составляла 10 Гц. Во всех экспериментах использовали катодный предусилитель, крепившийся на микроманипуляторе ММ-1. Входное сопротивление катодного предусилителя составляло 80 мОм. Запись производилась от латеральной и медиальной стилоконических сенсилл, на одной из билатерально расположенных максилл. Время контакта микропипетки с активным электродом и стилоконической сенсиллы составляло 1 сек. Период между двумя контактами составлял 3 минуты. От каждой стилоконической сенсиллы на одном препарате производили 4-5 регистрации. Оцифровка зарегистрированной импульсной активности производили с использованием компьютера (Pentium IV, Intel 2600) со встроенной аудиоплатой Creative Audigy 2 и анализировали при помощи программы Cool Edit 2. 2.4. Изучение влияния метаболитов гусениц на поведение гусениц и яйцекладное поведение самок мельничной огневки Приготовление экспериментальных субстратов В качестве контрольного субстрата в большинстве поведенческих экспериментов по изучению влияния метаболитов гусениц, как на
Изучение характера действия экскрементов и суммарного секрета на поисковое поведение гусениц
Определив, что при наличии в пищевом субстрате метаболитов гусениц и росте их количества привлекательность такого субстрата для гусениц резко снижается, в последующих экспериментах изучались свойства отдельных компонентов метаболитов гусениц и их роль в изменении характера действия чистого субстрата на поисковое поведение гусениц. Вследствие того, что нет точных данных по химически идентифицированным компонентам метаболитов гусениц мельничной огневки, а также по их количественному соотношению, мы разделили метаболиты гусениц на две составляющие: суммарный гусеничный секрет и экскременты, и в дальнейшем исследовали свойства этих двух метаболитов гусениц по отдельности. Характер действия метаболитов в последующих экспериментах рассматривался исходя из терминологии, предложенной Детье (Dethier et al., 1937; Browne, Smith, 1960), согласно которой из всего многообразия химических стимулов выделяют аттрактанты, репелленты, аррестанты и стимулянты. На практике такое жесткое деление химических стимулов по характеру их действия на поведение насекомого не всегда удается сделать, так как многие вещества имеют многокомпонентный состав и действие каждого компонента необходимо характеризовать в отдельности. Поскольку в предыдущих экспериментах было показано, что гусеницы V возраста за одинаковое время выделяют большее количество метаболитов, в дальнейших экспериментах использовались метаболиты, полученные от гусениц V возраста. Для изучения свойств выбранных метаболитов гусениц нами использовались две методики. Первая методика - создание репеллентного барьера - которая с успехом использовалась для тестирования репеллентных свойств веществ, направленных против клещей.
Эта методика позволяет выявить наличие или отсутствие у изучаемого вещества репеллентных свойств, когда членистоногое ползет по градиенту возрастания концентрации исследуемого компонента и при проявлении его репеллентного действия реагирует в виде характерной поведенческой реакции бегства. Вторая использованная методика - испытание экспериментальной смеси в воздушном Y-образном ольфактометре. Данная методика позволяет получить дополнительные доказательства репеллентности изучаемого вещества, и в то же время, способна выявить присутствие аттрактивных компонентов, если вещество или субстрат имеют многокомпонентный состав. Кроме того, выбранные нами методики позволяют оценить роль контактной и ольфакторной рецепции в восприятии активных компонентов метаболитов. Таким образом, одновременное использование этих двух методик дает исчерпывающую информацию о характере действия вещества и наличии в его составе компонентов, по-разному влияющих на поведение. Обе методики в той или иной степени предполагают наличие фактора, определяющего движение гусениц в определенном направлении, в зависимости от методики - либо по градиенту концентрации, либо в сторону источника воздушной струи. Для использования этих методик в качестве определяющего движение фактора было решено использовать свет. Предварительно, для выявления влияния освещения на поведение гусениц I, III и V возрастов был поставлен соответствующий эксперимент. В начале проведения эксперимента по изучению влияния освещения на исследуемые гусеничные возрасты, гусениц, как в контроле, так и в опыте помещали по одной особи в широкие чашки Петри и накрывали прозрачной стеклянной крышкой. Далее контрольную и опытную чашки Петри помещали под источник рассеянного освещения (15 лк) на 5 минут. По истечении 5 минут прозрачную стеклянную крышку на опытной чашке Петри меняли на крышку, половина поверхности которой была заклеена плотной бумагой, таким образом, чтобы над ползающей гусеницей оставалась прозрачная часть поверхности крышки. Затем, по прошествии 5 минут, смотрели на какой из сторон - освещенной или затемненной оказывается гусеница. Эксперимент проводился в летнее время, при температуре окружающей среды 22 - 24 С.
Результаты проведенного эксперимента показали, что гусеницы I возраста толерантно относились к рассеянному освещению, проявляя одинаковую двигательную активность как на освещенной, так и на затененной половине поверхности чашки. В то время как гусеницы III и V возрастов, попав на освещенную поверхность, активно двигались в поисках укрытия (рис. 3.6). Иная картина складывается, если повторить ту же методику эксперимента при направленном освещении. Источник света располагали на такой высоте над чашкой Петри, чтобы при наличии воздействия света исключить дополнительное воздействие тепла, возникающего за счет теплоотдачи лампы накаливания источника освещения (320 лк). Для подбора необходимой высоты использовали термометр, располагавшийся на одном уровне с контрольной и опытной чашками Петри. Полученный результат показывает, что все выбранные возрасты гусениц мельничной огневки в одинаковой степени избегали направленного освещения. Гусеницы, активно двигаясь по поверхности чашки Петри, стремились укрыться от сильных прямых световых лучей в тени, и при нахождении затененного участка оставались там до момента фиксации результата. Ослабленное действие рассеянного света на гусениц I возраста при рассеянном освещении также может косвенно свидетельствовать о разных задачах гусеничных возрастов. Так как основной задачей I возраста является поиск подходящего пищевого субстрата, то этот поиск должен вестись одинаково эффективно при различном освещении. Ситуация меняется при действии интенсивного освещения. В природе такая ситуация происходит при попадании гусеницы на открытое пространство, что увеличивает риск быть съеденной хищником.
Кроме того, избегание интенсивного освещения гусеницами V возраста косвенно подтверждает и поведенческую задачу гусениц этого возраста. По данным Загуляева (Загуляев, 1965), гусеницы V возраста после прекращения питания занимаются поиском места для окукливания. Для этой цели они уходят с пищевого субстрата и забираются в затененные места: щели стен, перегородок и других укрытий. Исходя из проведенного исследования, в качестве фактора, определяющего направление движения гусениц, в последующих экспериментах нами был использован направленный свет. 3.2.2. Характер действия экскрементов гусениц на поисковое поведение гусениц Характер действия экскрементов изучался в серии экспериментов с применением воздушного ольфактометра и методики создания репеллентного барьера. Для эксперимента с применением методики создания репеллентного барьера была использована бумажная площадка, где на равном расстоянии друг от друга располагались дугообразные отрезки одинаковой длины с нанесенным на них экстрактом экскрементов возрастающей концентрации (рис. 3.7). Исходный экстракт экскрементов был получен от 50 гусениц V возраста, концентрация которого была принята за 1. Последующие концентрации получались путем разведения исходной концентрации экстракта экскрементов. Выбор исходной концентрации экстракта экскрементов был обусловлен тем, что в предыдущих экспериментах по изучению суммарного действия метаболитов гусениц, при количестве экскрементов, полученных от 50 гусениц V возраста, пищевой субстрат проявлял ярко выраженные репеллентные свойства в отношении гусениц всех возрастов. Результаты эксперимента представлены на рисунке 3. 8. Все гусеницы I возраста, принимавшие участие в эксперименте, участки с начальными концентрациями экскрементов от 0,1 до 0,3 преодолевали без замедления движения или остановки, поступательно двигаясь дальше, что свидетельствует о том, что в данном диапазоне концентраций гусеницы не реагируют на экстракт. Отрезок с концентрацией 0,4 все гусеницы также преодолевали, однако по характеру воздействия на поведение гусениц эта концентрация принципиально отличалась от предыдущих. При приближении к участку с концентрацией 0,4 отдельные гусеницы замедляли движение, кратковременно останавливались, совершая маятникообразные движения в плоскости поверхности, обследуя окружающее пространство, а затем снова двигались дальше.
Морфология и ультраструктура сенсилл максилл
Наружная жевательная пластинка (galea) представлена одним массивным цилиндрическим члеником, высотой 27 мкм и диаметром 51 мкм. Членик имеет гладкую боковую поверхность, однако в дистальной его части, с внутренней стороны, имеется небольшой ряд мелких зубчиков высотой 3 мкм, ограничивающих апикальную площадку. На противоположных сторонах апикальной площадки располагаются равновеликие латеральная и медиальная стилоконические сенсиллы со средней длиной 25,5 мкм и сечением в средней части 6,5 мкм, слегка изогнутые относительно друг друга к центру вертикальной оси членика (рис. 4.3). Диаметр кутикулярного отдела срединной части сенсилл составляет 0,66 мкм, а средняя толщина стенок - 0,07 мкм. Каждая из сенсилл иннервируется пятью рецепторными клетками (рис. 4.3.2, рис, 4.3.3), при чем периферические отростки четырех из них, средним диаметром 0,02-0,04 мкм, окруженные общей сколопоидной оболочкой толщиной 0,01 мкм, простираются в кутикулярный отдел сенсилл, тогда как периферический отросток пятой клетки заканчивается трубчатым телом в области сочленовной мембраны. Между двумя стилоконическими сенсиллами располагается небольшая остроконечная трихоидная сенсилла, длиной 5,1 мкм, диаметром в средней части 0,3 мкм и толщиной стенки кутикулярного отдела 0,05 мкм. Данная сенсилла иннервируется тремя рецепторными клетками. Три неветвящихся периферических отростка этих клеток, диаметром 0,02 - 0,03 мкм обнаруживаются в кутикулярном отделе этой сенсиллы. Результаты исследования внешней морфологии и ультраструктуры сенсилл максилл показали, что основное количество сенсилл сконцентрировано в области максиллярных щупиков. Последние состоят из трех члеников различной величины. Базальный членик, самый крупный и массивный, имеет форму усеченного конуса высотой приблизительно 33,6 мкм и сечением в средней части 74,6 мкм, с относительно гладкой боковой поверхностью. Второй членик имеет цилиндрическую форму высотой 36,5 мкм и диаметром 32,1 мкм, третий членик также цилиндрический, слегка изогнут в сторону продольной оси тела гусеницы, его высота составляет в среднем 44 мкм, а диаметр 19 мкм.
Оба этих членика имеют гладкие боковые поверхности и не несут на своей поверхности рецепторного аппарата. Весь рецепторный аппарат максиллярных щупиков расположен на апикальной площадке третьего членика и состоит из восьми разновеликих базиконических сенсилл, с закругленными вершинами и гладкими боковыми поверхностями (рис. 4.3.4). По размерам, среди этих сенсилл можно выделить три основные группы. Первая группа включает в себя две длинные центральные базиконические сенсиллы (№ 1 и № 2), вторая группа - три базиконические сенсиллы среднего размера (№ 3, № 4, № 5), расположенные с противоположной стороны, третья группа - три самые маленькие базиконические сенсиллы (№ 6, № 7, № 8), расположенные в ряд у латерального края апикальной площадки. Все сенсиллы апикальной площадки третьего членика расположены на эластичной мембранозной кутикуле, образующей подобие валика вокруг каждой сенсиллы. Эластичность кутикулы обеспечивает сенсиллам некоторую подвижность по вертикали и препятствует повреждению сенсилл при контакте с твердым субстратом. Некоторые морфологические характеристики сенсилл максиллярных щупиков представлены в таблице 4.1. Следует отметить, что у большинства сенсилл, кроме сенсиллы № 7, периферические отростки, расположенные в полости сенсиллы, лежат компактно и окружены общей сколопоидной оболочкой. Лишь в сенсилле №7 дендриты располагаются обособленно и окружены собственной сколопоидной оболочкой. В области апикального членика щупика диаметром 11,9 мкм, имеющего овальную форму, располагаются 8 групп периферических отростков, каждая, из которой окружена своей собственной тонкой сколопоидной оболочкой. При этом можно выделить три группы, содержащие от 3 до 5 периферических отростков и 5 групп, содержащих 1 -2 отростка.
Диаметр ветвей периферических отростков варьирует от 0,18-0,35 мкм. На внутренней боковой поверхности третьего членика максиллярных щупиков расположена пальцевидная сенсилла длиной 28.2 мкм, плотно прилегающая к стенке членика, благодаря особому углублению в виде борозды, которое точно соответствует размерам самой сенсиллы (рис. 4.3.5). Эта сенсилла, так же как и сенсиллы на апикальной площадке последнего членика имеются уже у гусениц первого возраста. Пальцевидная сенсилла имеет уплощенную треугольную форму со слабовыраженной гофрированной поверхностью и сравнительно небольшой полостью диаметром 0,06 мкм. Внутри этой полости проходят два неветвящихся периферических отростка диаметром 0,03 мкм (рис. 4.3.6). Использование трансмиссионного электронного микроскопа позволило выявить рецепторную структуру, существование которой не обнаруживается при изучении внешней морфологии максиллярного щупика сканирующим электронным микроскопом. На одной из сторон апикального членика щупика, внутри его стенки, имеется обособленная полость вытянутой овальной формы размером 0,016-0,04 мкм, В этой полости располагаются многочисленные ветви периферических отростков, числом более 40 и диаметром до 0,036 мкм (рис. 4.3.7). При тщательном исследовании наружной поверхности стенки щупика в области расположения этой полости прослеживается лишь слабая шероховатость кутикулы, никаким образом не указывающая о наличии внутри отростков рецепторных клеток. 4.3. Обсуждение результатов
В ходе изучения морфологических особенностей сенсорного аппарата гусениц мельничной огневки одной из наиболее важных проблем бьша проблема типизации сенсилл, расположенных на антеннах и частях ротового аппарата. Ранее большинство исследований по изучению морфологии сенсилл было связано с изучением особенностей строения кутикулярного отдела сенсилл. В первую очередь такой подход был вызван развитием техники исследований и, прежде всего, использованием в исследованиях только светового или сканирующего электронного микроскопа. В ходе накопления данных по различным параметрам внешней морфологии сенсилл насекомых были разработаны несколько классификаций, косвенно указывающих на вероятную модальность сенсилл. Классической классификацией считается классификация внешних морфологических типов сенсилл, разработанная Снодграссом в 1935 году (Snodrgass, 1935) и, впоследствии развитая Шнайдером (Schneider, 1964). Однако с накоплением электрофизиологических данных оказалось, что данная классификация не идеальна, и один и тот же тип сенсилл может обладать разными модальностями, либо в некоторых случаях быть мультимодальным. Основной задачей, поставленной нами при изучении морфологии сенсилл гусениц мельничной огневки, было не только классифицировать отдельные типы сенсилл, используя особенности их внешнего строения, но также определить их модальность. Для выполнения этой задачи, помимо использования данных, полученных при применении сканирующего электронного микроскопа, мы использовали данные, полученные в ходе изучения поперечных срезов отдельных сенсилл в трансмиссионном электронном микроскопе. Сопоставление данных, полученных двумя этими методиками, позволило нам с большой точностью говорить о возможной модальности каждой из исследованных сенсилл. Такой подход при изучении рецепторного аппарата насекомых был использован Альтнер, при составлении собственной классификации сенсилл насекомых (Altner, 1977). По нашему мнению классификация Алтнер в настоящее время является наиболее приемлимой из всех современных классификаций, в которой с наибольшей объективностью производится типизация сенсилл с различной внешней морфологией кутикулярного отдела. Вследствие того, что в настоящее время эта классификация еще широко не используется при проведении морфологических исследований сенсилл и, во избежании путаницы при характеристике отдельных типов сенсилл в нашем исследовании, мы пользовались классификацией Снодграсса, однако, при этом учитывали особенности внутренней ультраструктуры отдельных сенсилл. Особенности ультраструктурной организации сенсилл гусениц мельничной огневки, и главным образом наличие многочисленных пор в кутикулярном отделе, доказывают, что обонятельную функцию выполняют только две тонкостенные базиконические сенсиллы, расположенные на втором членике антенны (Ахаев, Чайка, 2004).
