Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Крифонекроз каштана и возможные пути его преодоления (обзор литературы) 14
1.1 Предыстория проблемы и современное состояние в мире и в России.
1.2 Особенности биологии Cryphonectria parasitica 19
1.3 Cryphonectria hypovirus (CHV) и структура его генома 26
1.4 Молекулярно-биологические механизмы действия CHV 36
1.5 Вегетативная несовместимость 50
1.6 Перспективы преодоления крифонекроза 60
ГЛАВА 2. Материалы и методы 68
2.1. Биологический материал 68
2.1.1 Сбор биологического материала 68
2.1.2. Выделение и культивирование штаммов С. parasitica 69
2.2. Методы 71
2.2.1. Молекулярно-генетическая идентификация С. parasitica и CHV 71
2.2.1.1. Выделение нуклеиновых кислот 72
2.2.1.2. Обратная транскрипция 74
2.2.1.3. Амплификация 75
2.2.1.4. Детекция продуктов амплификации 75
2.2.2. Анализ геномов CHV из гиповирулентных штаммов С. parasitica 2.2.2.1. Получение препарата вирусной дцРНК 76
2.2.2.2. Синтез дц-кДНК-копии генома CHV з
2.2.2.3. Детекция и очистка дц-кДНК 79
2.2.2.4. Синтез рекомбинантной плазмиды 81
2.2.2.5. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli 81
2.2.2.6. Трансформация клеток Escherichia coli 83
2.2.2.1. Выделение плазмидной ДНК и секвенирование генома CHV... 84
2.2.3. Анализ вегетативной совместимости штаммов С. parasitica 86
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 88
3.1. Состояние популяции Castanea sativa на Северо-Западном Кавказе в связи с крифонекрозом 88
3.2. Анализ вирулентных свойств и исследование внутривидового полиморфизма штаммов С. parasitica выявленных на территории РФ... 95
3.3. Выявление генетических особенностей CHV обнаруженных в штаммах С. parasitica на территории Турции и РФ 109
Заключение и выводы 116
Список использованных источников 122
- Cryphonectria hypovirus (CHV) и структура его генома
- Сбор биологического материала
- Амплификация
- Анализ вирулентных свойств и исследование внутривидового полиморфизма штаммов С. parasitica выявленных на территории РФ...
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из важнейших направлений популяционной и прикладной экологии является изучение влияния биологических факторов среды на состояние хозяйственно ценных видов растений. В этой связи, несомненный интерес представляет изучение воздействия фитопатогенных грибов на лесообразующие виды растений. Фитопатогенный гриб Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr, является одним из самых известных представителей аскомицетовых грибов относящихся к классу Sordariomycetes. Он наносит большой вред лесному хозяйству, поражая своих основных хозяев, представителей рода Castanea. Гриб C. parasitica – раневой паразит, его споры инфицируют ветви и стволы через различные повреждения растительных тканей, после чего распространяясь по лубу, камбиальному слою и затем по внешним слоям заболони образует на поверхности повреждения в виде язв. Участки дерева выше точки инвазии погибают, из-за блокирования обмена веществ между органами растения. Вызванная данным паразитом эпидемия крифонекроза, разразившаяся в США и Европе в начале ХХ столетия, по праву считается крупнейшей из наблюдавшихся ботанических катастроф [Придня М.В. 2004].
C. parasitica как инфекционный агент на территории Северной Америки впервые был отмечен в 1904 году, а к 1950-м годам фактически уничтожил зубчатый каштан (Castanea dentata (Marsh.) Borkh.) – лесообразующий вид восточной части США (болезнь уничтожила порядка 3.5 миллиардов деревьев). В Европе, где основным растением-хозяином данного патогена является каштан посевной (C. sativa Mill.), гриб C.parasitica впервые был обнаружен в 1938 году в Италии. В течение нескольких последующих десятилетий он распространился почти на весь ареал произрастания каштана. В настоящий момент не тронутыми заболеванием остаются только рассеянные насаждения в северной Европе и Великобритании. Азиатские виды каштана (C.mollissima Blume., C.crenata Siebold & Zucc.) также подвержены крифонекрозу, однако погибают от него достаточно редко. Полагают, что они эволюционировали вместе с грибом-паразитом и, обладая достаточной толерантностью, являются естественным резервуаром инфекции. В частности, проникновение C.parasitica в США и Европу связывают с интродукцией азиатских каштанов, а последовавшее стремительное вымирание американского каштана – с его недостаточной устойчивостью к данному патогену.
Существенным моментом в истории исследований крифонекроза стало открытие в 1950-х годах явления гиповирулентности у C. parasitica. С этого времени большинство исследований, посвященных крифонекрозу, были связаны с этим явлением. Гиповирулентные штаммы обладают рядом характерных признаков: слабая пигментация (за что они получили название «белые» штаммы), низкий уровень бесполого спороношения, слабый и замедленный рост мицелия; поражение подобным штаммом, как правило, не приводит к гибели дерева. Как впоследствии было выявлено, гиповирулентность C. parasitica обусловлена присутствием вируса, который представляет собой двуцепочечную молекулу РНК, лишенную капсида, что делает невозможным его активное распространение через внешнюю среду. Вирус способен проникнуть в нового хозяина только через гифальные анастомозы образуемые между штаммами гриба. Проникая в конидиоспоры, вирус поражает значительную часть бесполого поколения своего хозяина. Данный вирус получил название Cryphonectria Hypovirus (CHV) и выделен в отдельное семейство Hypoviridae, в котором на сегодняшний день обнаружено четыре вида: CHV1, CHV2, CHV3, CHV4.
На CHV возлагали большие надежды как на естественного агента, способного помочь справиться с агрессивным фитопатогеном, снизив его вирулентность. Однако опыты по искусственному внедрению CHV, за некоторыми исключениями, в большинстве случаев закончились неудачей [Robin et al. 2010]. В США лишь в лесничествах штата Мичиган удалось спасти местную популяцию американского каштана, заражая деревья гиповирулентными штаммами гриба, однако на остальной территории, даже по прошествии нескольких десятилетий, CHV так и не смог распространиться [Milgroom et al. 1999]. Как полагают, преобладание половой стадии в цикле размножения C. parasitica обуславливает высокий уровень его генетической гетерогенности в Северной Америке, что является существенной преградой на пути распространения гиповируса в местной популяции гриба. В Европе популяция C.parasitica характеризуется малым аллельным разнообразием, а также низким уровнем рекомбинации, и несмотря на то, что опыты по искусственному заражению каштана гиповирулентными штаммами были успешными лишь в некоторых лесничествах на территории Италии, гиповирус сумел самостоятельно распространиться практически по всему ареалу европейского каштана. Таким образом, к настоящему моменту, большая часть выявляемых в Европе штаммов C.parasitica являются гиповирулентными [Robin et al. 2010]. Гиповирулентность штаммов C. parasitica, пораженных CHV, по праву считается одним из наиболее изученных, с точки зрения молекулярных основ, модельных объектов взаимодействия вирус-гриб, и по-прежнему представляет интерес для исследователей работающих в области популяционной и прикладной экологии.
Вопрос о состоянии популяции каштана посевного на территории РФ в связи с крифонекрозом требует детального исследования, ввиду практически полного отсутствия работ по данной теме. Оценка влияния сверхпаразита CHV на полиморфизм и вирулентные свойства штаммов C. parasitica, является ключевым факторам при рассмотрении возможных стратегий по борьбе с данным фитопатогеном. Сохранение каштана посевного в причерноморском ареале является актуальной научной и практической задачей защиты леса.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является проведение комплексного обследования распространенности и полиморфизма фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного, что позволит сравнить ситуацию с крифонекрозом на территории Кавказа РФ с общеевропейской и определить степень угрозы патогена для российской популяции каштана.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
-
Провести обследование популяции каштана посевного на территории Северо-западного Кавказа в связи с крифонекрозом.
-
Провести анализ вирулентных свойств штаммов C. parasitica выявленных в причерноморской популяции каштана посевного.
-
Провести тесты на вегетативную совместимость с выявленными на Северо-Западном Кавказе гиповирулентными штаммами C. parasitica и дать оценку возможной роли CHV в качестве агента биологического контроля.
-
Выявить молекулярно-генетические особенности CHV, обнаруженных в штаммах C. parasitica на территории РФ и Турции.
Научная новизна работы. В результате проведенного комплексного обследования распространенности и полиморфизма возбудителя крифонекроза C. parasiticа, впервые установлено, что фитопатоген распространен по всей причерноморской части ареала каштана посевного.
Проведенные тесты на вегетативную совместимость 99 штаммов C. parasitica, позволили выявить высокий уровень генетической гетерогенности C. parasitica на территории РФ, что позволило дать оценку перспективам использования CHV в качестве возможного агента способного ограничить распространите крифонекроза на территории РФ.
Впервые проведен анализ геномов гиповирусов, обнаруженных в выявленных на территории РФ и Турции штаммах C. parasitica, на основе чего определена их видовая принадлежность.
Практическая значимость работы. В рамках диссертационного исследования разработан метод идентификации C. parasitica в пораженной коре каштана с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий быстро и точно идентифицировать патоген в образце коры, не прибегая к фитопатологической экспертизе. Также, разработан метод идентификации CHV в изолированных штаммах C. parasitica, позволяющий оценить вирулентность гриба. В целом, результаты исследования позволяют дать общую оценку состояния популяции каштана посевного на Северо-Западном Кавказе в связи с крифонекрозом.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологи» (Москва, 21-24 октября 2008 г.), VI Международной научной конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности» (6-7 декабря 2007 г., Сумгаит, Азербайджанская Республика), научных семинарах кафедры ботаники и основ сельского хозяйства МГОУ в 2007 – 2010 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, из которых 4 в периодических изданиях рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора современных литературных сведений о крифонекрозе каштана и его возбудителе C. parasitica (глава 1); описания биологических объектов, материалов и методов исследования (глава 2); изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных (глава 3); заключения и выводов; списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 1 таблицу и 10 рисунков, включая фотографии и схемы.
Cryphonectria hypovirus (CHV) и структура его генома
Европейский (посевной, благородный, съедобный) каштан {Castanea sativd) - реликт третичного периода, является одновременно ценной древесной, орехоплодной, декоративной, таннидо-, витамино-, пыльце- и нектароносной лесной породой. По интенсивности роста он является быстрорастущей, а по срокам наступления технической спелости древесины — раннеспелой породой; древесина каштана по физико-механическим свойствам» входит в группу твердолиственных пород. Каштановые леса обычно растут как естественные сообщества и искусственные плантации с циклическим периодом от 15 до 30 лет, образуя насаждения с показателями высокоствольных лесов [Придня М.В., 2004].
Каштан посевной был завезен в Европу из Малой Азии во времена Римской империи. Он составлял значительную часть лесных насаждений Средиземноморья, где играл важную роль в жизни человека, являясь главной экономически ценной породой. С древних времен люди использовали каштан в качестве источника орехов, дубильных и красящих веществ. Древесина каштана отличается прочностью и практически не деформируется со временем, а благодаря танинам устойчива к гниению, что обеспечивало ей широкое применение в быту, строительстве и кораблестроении [Придня М.В., 2004; Пасечник В.В., 2006; Turchetti and Maresi, 2008].
Американский (зубчатый) каштан (С. dentata) появился в Америке, по разным данным, от нескольких тысяч до нескольких миллионов лет назад, а наиболее обилен стал около 2500 лет назад [Придня М.В., 2004]. До начала XX века он являлся главной лесообразующей породой и основным источником древесины и орехов на востоке США. К этому периоду выращивание каштана зубчатого приобрело промышленные масштабы, в общей сложности в США насчитывалось около 4 миллиардов стволов. Среди всех представителей рода Castanea этот вид достигает самых больших размеров, вырастая до 45 метров в высоту, а его древесина является наиболее ценной [Придня М.В., 2004; Anagnostakis and Hillman, 1992].
Азиатские виды каштанов также играли существенную роль в хозяйственной деятельности человека. Каштан китайский (С. mollissima) начали возделывать более 5000 тысяч лет назад, главным образом в горных районах, где он стал важным источником пищи. Каштан японский (С. crenata), обладающий самыми большими по размеру плодами среди всех представителей рода, являлся важной составляющей пищевого рациона жителей Японии, в особенности ее южных областей. При этом японский каштан обладает неровным, сильно ветвящимся стволом, ввиду чего не представляет высокой ценности как источник древесины. Как и в Европе, производство плодов каштана в Японии сильно сократилось в 80-х годах XX столетия и теперь главными их экспортерами являются Корея и Китай [Turchetti and Maresi, 2008].
Возбудителем чрезвычайно опасного заболевания каштанов -крифонекроза (в англоязычной литературе — chestnut blight) - является аскомицетный гриб Cryphonectria parasitica (Murrill) M.E.Barr 1978 (= Endothia parasitica (Murrill) P.J.Anderson et H.W.Anderson), а история его изучения насчитывает уже более ста лет. С. parasitica как инфекционный агент впервые был отмечен в-1904 году на территории Северной Америки, в зоопарке Бронкс в Нью-Йорке, откуда болезнь стремительно распространилась на весь остальной ареал зубчатого каштана и к 1950-м годам привела к фактической деградации американского каштана, уничтожив порядка 3,5 миллиардов деревьев. Быстрому распространению рака каштанов в США способствовало то, что деревья в основном произрастали в виде искусственных насаждений и плантаций, характеризовавшихся монокультурностью и высокой скученностью посадок. Как считается, С. parasitica был занесен в США вместе с саженцами японского и китайского каштанов. Данная гипотеза впоследствии нашла подтверждение при обследовании завезенных ранее в США азиатских каштанов, на которых были обнаружены характерные
Сбор биологического материала
В работе использовали набор pGEM Vector System I («Promega», США). Реакционная смесь содержала: 4 мкл (100 нг) очищенного препарата дц-кДНК, 8 мкл 2Х Rapid Ligation Buffer, 2 мкл pGEM, 2 мкл Т4 DNA Ligase. Реакционную смесь перемешивали пипетированием и инкубировали при 4С в течение ночи, после чего использовали для трансформации компетентных клеток Е. coli.
Приготовление компетентных клеток Е. coli проводили по методикам [13] с модификациями («Fresh Competent Cells» - клетки для непродолжительного хранения и «Frozen Competent Cells» - клетки с возможностью продолжительного хранения). В работе использовали культуру Е. coli (штамм С600), полученную во ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ГосНИИгенетика).
Приготовление компетентных клеток с применением хлористого кальция («Fresh Competent Cells») осуществляли следующим образом:
Выращивали культуру клеток Е. coli в жидкой питательной среде SOB (NaCI - 0,05 г, триптон - 2 г, дрожжевой экстракт - 0,5 г, 250 мМ KCI - 1 мл, ЇМ MgCI2 - 1 мл, H20 - до 100 мл) в течение ночи. На следующий день 100 мкл ночной культуры клеток добавляли в пробирку с 10 мл питательной среды SOB и инкубировали при 37С и постоянном перемешивании на шейкере S-4 («ELMI», Латвия) примерно 1-2 часа, до появления слабой мути. Пробирку охлаждали во льду для остановки размножения Е. coli, суспензию клеток разливали в пробирки типа Эппендорф и центрифугировали 7 мин при 3500 об./мин и 0С на микроцентрифуге 5417R («Eppendorf», Германия). Удаляли надосадочную жидкость и осторожно ресуспендировали осадок пипетированием (предварительно оплавив кончик наконечника) в 100 мкл 50 мМ охлажденного во льду раствора СаС12. В пробирки добавляли еще по 1 мл 50 мМ охлажденного СаС12 и помещали их в лед на 60 мин. Пробы центрифугировали 7 мин при 3500 об./мин и 0С, удаляли супернатант и осторожно ресуспендировали осадок пипетированием (предварительно оплавив кончик наконечника) в 100 мкл 50 мМ СаС12, охлажденного во льду. Прибавляли сверху еще по 100 мкл 50 мМ охлажденного СаС12 и хранили суспензию клеток до трансформации при +4С (в течение ночи).
Приготовление компетентных клеток с применением хлористого магния («Frozen Competent Cells») проводили по следующей методике: 100 мкл ночной культуры клеток Е. coli добавляли в пробирку с 10 мл питательной среды SOB и инкубировали при 37С и постоянном перемешивании на шейкере S-4 («ELMI», Латвия) примерно 1-2 часа, до появления слабой мути. Пробирку охлаждали во льду для остановки размножения Е. coli, суспензию клеток разливали в пробирки типа Эппендорф и центрифугировали 7 мин при 3500 об./мин и 0С на микроцентрифуге 5417R («Eppendorf», Германия). Удаляли надосадочную жидкость и осторожно ресуспендировали осадок пипетированием (предварительно оплавив кончик наконечника) в 100 мкл 10 мМ охлажденного во льду раствора MgC . В пробирки добавляли еще по 1 мл 50 мМ охлажденного MgCl2 и помещали их в лед на 60 мин. Пробы центрифугировали 7 мин при 3500 об./мин и 0С, удаляли супернатант и осторожно ресуспендировали осадок пипетированием (предварительно оплавив кончик наконечника) в 100 мкл 50 мМ охлажденного во льду раствора СаСЬ, содержащего 20% глицерина. Прибавляли сверху еще по 100 мкл 50 мМ охлажденного СаСЬ с 20% глицерина и оставляли пробы на хранение при -20С до проведения трансформации (до месяца).
Амплификация
По результатам ПЦР-анализа CHV был идентифицирован только в штаммах 73.2, А2 и А9, то есть из выделенных нами 97 штаммов С. parasitica только у одного была диагностирована CHV-обусловленная гиповирулентность. Это соотносится с полученными ранее данными Н.Н. Гринько [Гринько, 2008], которая, проанализировав материал из 385 географических точек Кавказа РФ, выделила только единичные гиповирулентные («alb») морфотипы патогена, предположив наличие в них CHV. Это предположение было подтверждено нами в ходе выполнения данной работы: с помощью ПЦР-анализа ряда предоставленных Н.Н. Гринько штаммов С. parasitica гиповирус был идентифицирован именно (и исключительно) в морфотипах характеризовавшихся отсутствием пигментации и спороношения (штаммы А2 и А9). Столь низкая распространенность гиповирулентности в северокавказской популяции С. parasitica коренным образом отличается от ситуации в Европе, для которой характерно доминирование гиповирулентных рас патогена, результатом чего, несмотря на большой процент пораженных крифонекрозом каштанов, является относительно низкий уровень смертности деревьев от этого заболевания.
Открытым пока остается вопрос о причинах гиповирулентности третьей группы российских штаммов С. parasitica. При сборе образцов нами было отмечено, что штаммы 16, 25, 27, 59, 66, 80.2 вызывали у каштанов поверхностные либо локализованные каллусом (заживающие) поражения. Не исключено, что их атипичный морфотип обусловлен инфицированием каким-либо другим вирусным агентом [Hillman & Suzuki, 2004]. Исходя из фенотипических проявлений гиповирулентности указанных штаммов наиболее явным кандидатом на роль агента выступают микореовирусы - относительно недавно обнаруженные патогены С. parasitica, выделенными в отдельный род в составе семейства Reoviridae [Deng et al. 2007; Hillman et al. 2004; Suzuki et al. 2004]. Это предположение нуждается в дальнейшей проверке, однако стоит заметить, что фенотип пораженных микореовирусами штаммов С. parasitica схож с таковым у выделенных нами штаммов третьей группы. Кроме того, зараженность, микореовирусом приводит к снижению вирулентных свойств гриба, но при этом не сопровождается потерей пигментации, женской стерильностью и; угнетением бесполого спороношения. Также было выявлено, что микореовирусы способны передаваться половому поколению гриба проникая в аскоспоры [Hillman et al. 2004]. Это обстоятельство дает им несомненное преимущество перед CHV, поскольку таким образом микореовирус способен преодалеть барьер вегетативной несовместимости. В этой связи стоит отметить, что различные типы гиповирусов в разной степени представлены в различных регионах произрастания представителей рода Castanea. Так, вирусы типа CHV1 широко распространены на территории Европы, тогда как на территории США и Азии обнаруживаются лишь в единичных случаях. Гиповирусы CHV4 были обнаружены в 26% от всех выявленных на территории США штаммов гриба, и интересны в первую очередь тем, что не оказывают ни какого влияния на фенотип С. parasitica. Соответственно, данные вирусы имеют больше шансов на распространение, чем те же CHV1, главным образом благодаря тому, что не ингибируют бесполое спороношение гриба. Однако CHV4 был обнаружен только в США и никогда не встречался в Европе и Азии. Другие гиповирусы, CHV2 и CHV3, всегда обнаруживались лишь в единичных случаях и только на территории США и Азии. Следовательно, распространенность различных вирусов в популяции С. parasitica часто не связана с их влиянием на вирулентность гриба, и как полагают исследователи, более всего зависит от процента, гиповирулентных штаммов при первоначальной интродукции С. parasitica в популяцию каштана [Morozov et al. 2007].
Вегетативная несовместимость изолятов считается природным маркером генетической гетерогенности популяций грибов [Дьяков, Долгова, 1995; Гринько, 2008]. Результаты некоторых из проведенных тестов на вегетативную совместимость (ВС) с гиповирулентными штаммами С. parasitica представлены на рисунке 7. Главной целью проведенных нами тестов являлась оценка возможности распространения
Анализ вирулентных свойств и исследование внутривидового полиморфизма штаммов С. parasitica выявленных на территории РФ...
Как известно, организация генома четырех известных на сегодняшний день гиповирусов С. parasitica (CHV1, CHV2, CHV3, CHV4) имеет ряд характерных особенностей. Так, на рисунке 9 приведена схема генома гиповируса CHV1, который содержит две открытые рамки считывания (open reading frame — ORF) ORF А и ORF В. Средняя длина генома CHV1 составляет 12700 пар оснований, при этом около 75% приходится на ORF В. Каждая ORF кодирует по одному полипептиду, которые в последующем, путем автокаталитического протеолиза, распадаются образуя ряд вирусных '( белков. Для ORF А это протеазыр29 и р40, из которых первая собственно и осуществляет автокатализ. Довольно массивный (300 кДа) белок-предшественник кодируемый ORF В, включает в себя гены, протеазы р48, обладающей автокаталитическими свойствами, и мотивы вирусных РНК-зависимой РНК-полимеразы и хеликазы [Lin et al. 2007].
Для выявления пораженных CHV штаммов С. parasitica нами разработана методика идентификации гиповируса с помощью ОТ-ПЦР. Симптоматика, которую демонстрировали гиповирулентные штаммы из Турции (группа 2) и России (штаммы 73.2, А2 и А9), была наиболее характерной для поражения гиповирусом CHV1, а именно ослабленная пигментация и почти полное отсутствие бесполого спороношения. Исходя из этого, нами были разработаны две пары праймеров, для которых в качестве мишени выступают два участка вирусного генома расположенных на ORF В. Выбранные последовательности располагаются рядом с мотивами вирусной РНК-полимеразы полимеразы [Koonin, et al. 1991, Fahima et al. 1994] и хеликазы [Shapira et al. 1991], особенность которых состоит в том, что они являются консервативными и остаются практически неизменными у всех основных представителей семейства Hypoviridae.
Результаты проведенного нами ГЩР-анализа гиповирулентных штаммов С. parasitica из Турции приведены на рисунке 10. Постановка ПЦР с каждым из исследуемых штаммов С. parasitica проводилась сразу на две пары праймеров (CHV2FR и CHV3FR) в одной реакционной смеси, соответственно при наличии в пробе ДНК генома CHV видны два целевых продукта в 355н.п. и 533н.п. Для штаммов С. parasitica из Турции указанные целевые продукты были получены для штаммов FW3138, FW3139, FW3140, FW3141, FW3143, FW3144, FW3148, FW3149 и FW3150 (рис. 10, 4-12). Постановка ПЦР на. эти же праймеры с вирулентными, турецкими (группа 1) и российскими (группы 1 и 3), штаммами давала одинаково отрицательный результат (рис. 10, 3 и 13). В результате, целевые продукты ПЦР, были получены только для тех штаммов, которые обладали выраженными симптомами CHV-обусловленной гиповирулентности. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что гиповирулентность девяти турецких штаммов, и трех российских, вызывается гиповирусом CHV1, что подтвердилось и при последующем анализе нуклеотидной последовательности полученных ПЦР-продуктов. Полученные данные позволяют заключить, что на территории РФ и Турции, как и в целом по Европе, из всех известных CHV вирусов встречаются только CHV1.
На сегодняшний день на территории Европы выделяют 7 подтипов гиповирусов CHV1. [Allemann, 1999]. В целом в европейской популяции С. parasitica наиболее распространены гиповирусы подтипа I, к которым относятся, в частности, менее агрессивные («слабые») вирусы CHVl-Euro7 и CHV1-EP721, тогда как вызывающий наиболее явные симптомы гиповирулентности («сильный») CHV1-EP713 (подтип F1) встречается эпизодически [Lanz, 2010]. У CHV1-EP713 и CHVl-Euro7 последовательности дцРНК в кодирующей области генома идентичны на 93% [Chen et al. 1999]. Сходство дцРНК вируса CHV1-EP721 с геномами CHVl-Euro7 и CHV1-EP713 составляет соответственно 99% и 90% [Lin et al. 2007].
Нами был проведен анализ нуклеотидной последовательности четырех участков генома гиповирусов (5 -UTR - участок в 448 н.п; р29 - участок в 500 н.п., р48 - участок в 552 н.п.; мотив РНК-полимеразы - участок в 467 н.п.), выделенных из российских и турецких гиповирулентных штаммов (рис. 11). Гиповирусы, выделенные нами из турецких штаммов (FW-3138, FW-3143, FW-3144, FW-3148) продемонстрировали наибольшее сходство (99%) с гиповирусами CHV1-EP721 и CHVl-Euro7 [Chen et al. 1999; Lin et al. 2007], по всем исследованным участкам. Однако у CHV выделенных из российских штаммов С. parasitica наблюдался ряд интересных особенностей. На участке 5 -UTR и р29 гиповирусы из штаммов А9 и 73.2, так же как и турецкие штаммы, обнаружили наибольшее сходство (95% и 93% соответственно) с гиповирусами CHV1-I (рис. 11а,б). Однако на участках расположенных в ORF В наблюдалась кардинально иная картина. На участке р48 российские гиповирусы обнаружили сильное сходство (97%) с гиповирусом CHV1-EP713 (рис. Ив), а на участке мотива РНК-полимеразы показали наименьший процент сходства (87%) со всеми исследованными штаммами гиповирусов (рис. 11 г). Последнее представляет особенный интерес в связи с тем, что как показали исследования [Chen et al. 2000], именно с отличиями в последовательности ORF В связывается разница в проявлении основных симптомов гиповирулентности. В связи с чем можно предполагать, что крайне низкая распространенность гиповирулентных штаммов С. parasitica пораженных CHV на территории РФ, может быть связана с генетическими особенностями которые более свойственны «сильным» подтипам CHV. Тем не менее, у всех исследованных гиповирусов была обнаружена делеция двух и вставка одного нуклеотида на участке 5 -UTR. Сайт автокатализа, разделяющий последовательности р29 и р40 на ORF А, расположен между кодонами RIG/NQL (рис. 116, где G - глицин, N -аспарагин), что характерно для вирусов подтипа I (CHV1-EP721 и CHV1-Euro7), тогда как у гиповируса CHV-EP713 (подтип F1) сайт представлен аминокислотной последовательностью RIG/GRL. Данные признаки являются характерными исключительно для подтипа CHV1-I, что и дает нам основание отнести обнаруженные на территории РФ и Турции штаммы гиповирусов в данную группу, несмотря на высокий процент отличий по нуклеотидной последовательности российских штаммов от европейских и турецких.
