Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Распространение свинца в природе 11
1.2. Источники антропогенного поступления свинца в окружающую среду 13
1.3. Влияние свинца и других тяжелых металлов на биоту 18
1.3. 1. Изменение структуры микробных комплексов почвы под влиянием тяжелых металлов 20
1.3.2. Механизмы адаптации организмов к тяжелым металлам 28
1.3. 3. Факторы токсичности почвы, загрязненной тяжелыми металлами, для высших растений 35
1.3. 4. Изменение биохимических параметров почвы под действием тяжелых металлов 40
1.4. Приемы уменьшения токсичности почв, загрязненных тяжелыми металлами 44
Глава II. Объекты и методы исследования 47
2.1. Традиционные методы 48
2.1. 1. Методы исследования почвенной биоты 48
2.1. 2. Методы исследования химических характеристик субстратов 49
2.2. Новые разработки 51
Глава III. Особенности развития фототрофных микробных комплексов в почвах, загрязненных свинцом 59
3.1. Изменение структуры альго-микологических комплексов лесных почв под влиянием свинца 62
3.2. Изменение структуры альго-микологических комплексов в луговой почве под влиянием свинца 67
3.3. Сравнительная характеристика фототрофных микробных комплексов в различных типах почв, загрязненных свинцом 70
3.4. Влияние свинца на развитие фототрофных микробных комплексов в пахотной почве 73
3.5. Влияние свинца на сапротрофные микробные комплексы в пахотной почве 78
3.6. Влияние свинца на ферментативную активность субстратов, загрязненных свинцом 82
3.6. 1. Влияние свинца на ферментативную активность дерново- подзолистой супесчаной пахотной почвы 84
3.6. 2. Влияние свинца на ферментативную активность модельного субстрата 88
3.7. Влияние свинца на численность цианобактерий Nostoc paludosum и грибов Fusarium oxysporum в модельном опыте 93
3.8. Влияние свинца на структуру фототрофного микробного комплекса биопленки Nostoc commune 97
Глава IV. Исследование функциональных возможностей почвенных микроорганизмов в условиях загрязнения природных объектов свинцом 101
4.1. Определение устойчивости и сорбционной способности цианобактерий по отношению к свинцу 102
4.1. 1. Определение устойчивости цианобактерий Nostoc paludosum 18, N. muscorum 15, N. commune, N. linckia 273, Microchaete tenera и гриба Fusarium oxysporum по отношению к
свинцу 102
4.1. 2. Определение сорбционной способности цианобактерий Nostoc paludosum 18, Nostoc muscorum 15 и гриба Fusarium oxysporum по отношению к свинцу 106
4.2. Изучение антагонизма между грибами рода Fusarium, цианобактериями и актиномицетами 107
4.3. Роль цианобактерий и актиномицетов в уменьшении фитотоксичности почвы, вызванной свинцом и грибами рода Fusarium 117
4.3. 1. Изучение влияния цианобактериальной инокуляции на развитие пелюшки, выращенной при поливе культуральным фильтратом гриба Fusarium oxysporum 117
4.3. 2. Изучение действия цианобактерий и актиномицетов на рост и развитие агрокультур в условиях, моделирующих заражение семян грибами рода Fusarium перед посевом и через почву 119
Глава V. Отработка метода биотестирования 124
5.1. Определение возможности применения трифенил-тетразолий хлоридного метода в биотестировании субстратов, загрязненных свинцом, с использованием высших растений 125
5.2. Определение возможности применения трифенил-тетразолий хлоридного метода в биотестировании субстратов, загрязненных свинцом, с использованием цианобактерий 127
ВЫВОДЫ 131
ЛИТЕРАТУРА 134
- Распространение свинца в природе
- Методы исследования химических характеристик субстратов
- Изменение структуры альго-микологических комплексов лесных почв под влиянием свинца
Введение к работе
Одной из основных задач современной экологии является разработка стратегии реабилитации почв, загрязненных различными токсическими веществами. Разработка таких стратегий должна основываться на глубоком знании химических, физико-химических и биологических процессов, протекающих в почвах (Глазовская, 1988, 1994).
Тяжелые металлы (ТМ) являются приоритетными загрязнителями, а один из самых опасных - свинец (РЬ). Свинец преобладает по абсолютным величинам в техногенных выбросах (Алексахин и др., 2001). Он способен нарушать многие физиологические и метаболические процессы путем прямого ингибирования или активации, а также непрямым воздействием на регуляторные механизмы, образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими HS- и RS-группы, заменяя металлы в металлсодержащих ферментах (БСЭ, 1970; Диксон и Уэбб, 1982; Можайский и др., 2005а; Шнюкова, 2005). Наиболее изучены химические и физические способы детоксикации свинца в окружающей среде. Менее изучен вопрос применения биологических методов с использованием микроорганизмов различных систематических групп и микробных комплексов в целом.
Необходимость изучения воздействия ТМ на почвенные микроорганизмы определяется тем, что именно в почве сосредоточена большая часть всех процессов минерализации органического вещества, обеспечивающих сопряжение биологических и геологических круговоротов (Добровольский, Никитин, 1984). Загрязнение почв ТМ вызывает определенные изменения в видовом составе комплекса почвенных микроорганизмов (Левин и др., 1989; Бутовский, 2005).
В микробном сообществе загрязненной почвы появляются необычные для нормальных условий, устойчивые к ТМ виды микроорганизмов, которые могут быть весьма небезопасны для растений и
животных. В частности, накопление тяжелых металлов в почве приводит к распространению в индустриальных районах микроорганизмов, устойчивых к поллютантам и губительных для растений (Марфенина, 2005; Терехова, 2007). Так, повышение в почве концентрации мышьяка и свинца приводит к интенсивному развитию фузариозно-нематодных комплексов, представляющих двойную опасность для высших растений (Domracheva et al., 2006). Поэтому важно разработать биологический метод, который позволит решить несколько задач: во-первых - уменьшить токсичность почвы, связанную с повышенной концентрацией свинца, во-вторых - уменьшить токсичность почвы, связанную с жизнедеятельностью патогенных видов, в-третьих - оптимизировать развитие растений в условиях возникшей под действием металла-токсиканта деградации почвы.
Цель работы - изучить влияние свинца на фототрофные микробные комплексы почвы и выявить группы почвенных микроорганизмов, способных уменьшать токсичность почв, загрязненных свинцом, для высших растений.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
Изучить влияние различных концентраций свинца на структуру, количественные характеристики фототрофных микробных комплексов и ферментативную активность почвы, выявить наиболее устойчивые группы микроорганизмов к поллютанту.
Исследовать устойчивость и сорбционную способность отдельных видов почвенных микроорганизмов по отношению к свинцу.
Исследовать способность отдельных штаммов цианобактерий и актиномицетов снижать фитотоксичность почв, загрязненных свинцом и грибами рода Fusarium.
Отработать оптимальный метод для биотестирования сред, загрязненных свинцом.
Научная новизна
Впервые было проведено комплексное изучение влияния свинца на развитие фототрофной и сапротрофной составляющей почвенной микробиоты. Показано, что свинец вызывает резкое снижение численности микрофототрофов в почве, при этом повышенная чувствительность к поллютанту водорослей и цианобактерии характерна для почв луговых и лесных фитоценозов по сравнению с пахотными. Установлено, что под влиянием свинца в структуре альго-цианобактериальных сообществ доминирующие позиции (до 85 %) занимают цианобактерии из родов Phormidium, Plectonema, Trichromus, Nostoc.
Впервые показано, что по мере возрастания концентраций РЬ в почве увеличивается вклад микромицетов в суммарную микробную биомассу и снижается доля фототрофных микроорганизмов.
Выявлены особенности популяционной динамики микромицетов под влиянием возрастающих концентраций поллютанта, которые проявляются в снижении длины грибного мицелия, уменьшении численности грибных пропагул, повышении доли форм, содержащих меланин, возникновении фузариозно-нематодных комплексов.
Впервые выявлена способность снижать концентрацию подвижных форм свинца в окружающей среде у Nostoc paludosum 18, N. muscorum 15, Fusarium oxysporum.
Показано усиление фитотоксичности субстратов при действии РЬ и фитопатогенных грибов и возрастании супрессивности почвы при инокуляции семян различных сельскохозяйственных растений чистыми культурами цианобактерии, актиномицетов и их смесью.
Впервые показана возможность использования трифенил-тетразолий хлоридного метода для проведения биотестирования субстратов, загрязненных свинцом, на основе определения жизнеспособности клеток Nostoc paludosum 18; жизнеспособности, энергии прорастания, силы роста и гибели проростков у пшеницы сорта Иргина и горчицы белой.
Выявлена прямая зависимость между титром цианобактерий Nostoc paludosum 18 и степенью токсичности для них свинца: чем выше титр, тем менее токсичным оказывается действие свинца. В случае невысоко титра N. paludosum 18 можно использовать в качестве чувствительного тест-организма, при высоком титре - в качестве антистрессорной защиты (инокуляция семян) при выращивании растений на загрязненной почве.
Практическая значимость
Полученные результаты дополняют представления о влиянии свинца на видовой состав и численность микроорганизмов в почве. Данные исследований показывают, что для биоиндикации состояния сред, загрязненных свинцом перспективно применять такие показатели, как увеличение численности меланинсодержащих грибов, количественного соотношения видов гетероцистных и безгетероцистных цианобактерий. Для проведения биотестирования, возможно применять тетразольно-топографический метод с использованием как высших растений, так и цианобактерий.
На основании полученных данных возможно создание надежного и эффективного биопрепарата, который получил бы применение в сельском хозяйстве для уменьшения фитотоксичности почвы, загрязненной свинцом и грибами рода Fusarium. Основой этого биопрепарата могут служить культуры цианобактерий и актиномицетов. Данные организмы могут одновременно сорбировать свинец, стимулировать рост растений и подавлять развитие фитопатогенных грибов рода Fusarium.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 35
таблиц. Список литературы включает 286 наименований, в том числе 43 зарубежных издания.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на научных конференциях:
XII и XIII молодежная конференция Института биологии
«Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2005, 2006)
5-я городская научная конференция аспирантов и соискателей, посвященная 75-летию основания Вятской государственной сельскохозяйственной академии (Киров, 2005)
Международная конференция «Algae in terrestrial ecosystems» (Киев, 2005)
XIII и XV Всероссийские школы «Экология и почвы» (Пущино, 2005 и 2007)
Всероссийский симпозиум «Автотрофные микроорганизмы»
(Москва, 2005)
Всероссийская научная школа «Актуальные проблемы
регионального экологического мониторинга: научный и образовательный
аспекты» (Киров, 2005, 2006)
Первая и вторая областные молодежные научно-практические
конференции «Экология родного края: проблемы и пути их решения»
(Киров, 2006, 2007)
9-ая научно-практическая конференция «Региональные и
муниципальные проблемы природопользования» (Кирово-Чепецк, 2006)
Российская школа-конференция молодых ученых
«Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и
технологии» (Пущино, 2006)
Международная конференция «Грибы и водоросли в биоценозах» (Москва, 2006)
Международная научная конференция «Экология и биология почв: проблемы диагностики и индикации» (Ростов-на-Дону, 2006)
Межрегиональный семинар «Методические основы проведения
биологического мониторинга в зоне влияния ОХУХО» (Киров, 2006)
II Международная научная конференция «Современные проблемы
загрязнения почв» (Москва, 2007)
Публикации
По результатам исследований опубликовано 28 работ.
Автор выражает благодарность своему научному руководителю Домрачевой Л. И., а также Кондаковой Л. В, Семиной Т. И., Широких И. Г., Огородниковой С. Ю., Ашихминой Т. Я., Дабах Е. В., Слободчикову А. М., Кардаковой Е. М., Широких И. Г., Товстик Е. В., Узваровой Н. А., Желниной О. В., Милютиной Е. А., сотрудникам кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии Вятской ГСХА, а также своим родным за оказанную помощь, внимание и поддержку при проведении исследовательской работы.
Распространение свинца в природе
До 1 июля 2003 года основным источником поступления свинца в окружающую среду было сжигание бензина. В целях предотвращения вредного воздействия свинца на здоровье человека и окружающую среду был разработан и принят Федеральный Закон «О запрете производства и оборота этилированного автомобильного бензина в Российской Федерации» № 34 - ФЗ (Федеральный..., 2003). После принятия закона ситуация изменилась. По данным Министерства природных ресурсов Российской Федерации выброс свинца в атмосферный воздух от передвижных источников (автотранспорта) сократился и составил в 2003 г. 0,101 тыс. тонн (в 2002 г. - 1,02 тыс. тонн). В настоящее время на первом месте по вкладу в загрязнение окружающей среды находится производство аккумуляторов.
Производство аккумуляторов. В России в 2006 году лидерами по объемам производства аккумуляторов были ОАО «Тюменский A3» (1,7 млн. штук), «АкТех» (0,5 млн. штук), «Подольский A3» (0,67 млн. штук), «Курский A3» (0,6 млн. штук), на остальные предприятия пришлось чуть более 1 млн. штук. Всего российские заводы произвели за 2006 год около трех миллионов штук свинцовых аккумуляторов. Производство свинцовых аккумуляторов ежегодно растет во всем мире на 2-3 %. В машиностроении используется половина потребляемого в стране свинца. Суммарные выбросы в атмосферу 7 аккумуляторных заводов России, объединенных в АО «Электроразряд», составили в 1995 г. ориентировочно 38,2 т в пересчете на свинец; суммарные выбросы в водные объекты (через канализацию) - 35,3 т (Отчет..., 2006).
Загрязнения от выплавки свинца. В последние годы появляются надежные данные о результатах действия на окружающую систему выплавки свинца.
Плавильный процесс представляет источник весьма серьезного загрязнения, которое может проявляться в радиусе 20 км. Однако, плавильных печей немного и загрязнение, возникающее при их работе, более локализовано, чем при загрязнении от выхлопных газов. Загрязнение окружающей среды свинцом и его соединениями предприятиями металлургической промышленности определяется спецификой производственной деятельности: непосредственное производство свинца и его соединений; попутное извлечение свинца из других видов сырья, содержащих свинец в виде примеси; очистка получаемой продукции от примеси свинца и т. д. 99,86 % выбрасываемого в атмосферу свинца приходится на долю 11 из 39 предприятий цветной металлургии, в том числе около 94 % этого металла выбрасывают 5 предприятий: Среднеуральский медеплавильный завод (291 т/год); АО «Святогор» -Красноуральскии медеплавильный комбинат (170 т/год); Кировградскии медеплавильный комбинат (114 т/год); АО «Дальполиметалл» (28 т/год); завод «Электроцинк» (16 т/год).
Анализ источников выброса свинца показал:
57 % свинца выбрасывается в атмосферу с большими объемами запыленных газов отражательной плавки медного (свинецсодержащего) сырья, которые на всех заводах, использующих эту технологию, направляют в дымовые трубы без пылеочистки;
37 % свинца выбрасывается с конвертерными газами из-за отсутствия или недостаточной степенью очистки от богатой по содержанию свинца возгонной пыли;
существенным фактором является недостаточная эффективность существующих на предприятиях цветной металлургии средств пылеулавливания.
Методы исследования химических характеристик субстратов
Определение агрохимических показателей почвы было выполнено в Кировском областном центре охраны окружающей среды и природопользования с использованием стандартных методик.
Определение ферментативной активности свинецзагрязненных субстратов проводили следующим образом:
Активность каталазы определялась методом перманганатометрии и газометрически (в основе обоих методов лежит измерение скорости распада пероксида водорода при взаимодействии с почвой) (Хазиев., 2006). При определении активности каталазы газометрически, к навеске исследуемой почвы добавляют раствор пероксида водорода и измеряют с помощью манометра количество выделяющегося кислорода. При определении перманганатометрией измеряют не количество выделившегося кислорода, а количество оставшегося, неразложившегося пероксида водорода титрованием раствором перманганата калия. В основе метода определения уреазы лежит ее способность разлагать мочевину на аммиак, углекислый газ и воду. Количество выделившегося аммиака определяют по интенсивности окраски раствора после добавления реактива Несслера. Навеску исследуемой почвы заливают раствором мочевины, фосфатного буфера (рН = 6,7) и инкубируют при температуре 25С в течение 24 часов. По истечении этого времени к смеси приливают 1н. раствор хлорида калия, фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 мл раствора, прибавляют реактив Несслера, раствор сегнетовой соли и фотометрируют. Содержание аммиака определяют по калибровочному графику (Лабораторный практикум ..., 2002).
В основе метода определения инвертазы лежит учет восстанавливающих Сахаров, образовавшихся в результате действия фермента. Навеску исследуемой почвы заливают раствором сахарозы, раствором ацетатного буфера (рН = 4,7) и оставляют на сутки при температуре 30С. По истечении времени суспензию фильтруют. К части фильтрата добавляют раствор сульфата меди (II) и сегнетовой соли, кипятят, снова фильтруют и фотометрируют. Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяют по калибровочному графику (Звягинцев и др., 1980).
Количественное определение подвижных форм свинца в почве было проведено методом прямой потенциометрии. Принцип метода
Потенциометрический метод анализа основан на том, что измерительный электрод избирательно (селективно) реагирует на определенный ион (или группу ионов), а его потенциал зависит от содержания этих ионов в растворе (Васильев, 2002).
Потенциал измеряют относительно другого электрода, потенциал которого не зависит от состава раствора и условно принимается равным нулю. Такой электрод называется электродом сравнения. Измерения всегда проводятся при помощи двух электродов: измерительного и электрода сравнения (электрод селективный ЭЛИС-131 РЬ) (Электрод селективный...).
Для приготовления почвенной вытяжки, в которой определялись подвижные формы свинца, использовали ацетатно-аммонийный буфер с рН = 4,8. Извлечение осуществлялось при соотношении массы пробы почвы к раствору буферного раствора 1:10 (Практикум ..., 2001).
Изменение структуры альго-микологических комплексов лесных почв под влиянием свинца
Целью данной работы был анализ изменений количественной структуры альго-микологических комплексов лесных почв под влиянием возрастающих доз свинца и выявление чувствительных и устойчивых к данному поллютанту групп микроорганизмов.
Для постановки опыта использовали 2 типа лесных почв (химико-биологическая характеристика приведена в табл. 3, 4), в которых были определены количественные параметры альго-микологических комплексов в момент отбора почвенных образцов. Как видно из табл. З, в исследуемых почвах изначально обнаружено различное исходное содержание свинца, различные запасы водорослево-грибной биомассы (табл. 4). Прямой микроскопический учет не выявил ЦБ. Нитчатые формы ЦБ имеют контагиозный характер распределения (Домрачева, 2005; Кузяхметов, 2006). Поэтому при невысокой численности могут встречаться только в отдельных полях зрения микроскопа, не на всех мазках. Вследствие этого невозможно провести статистическую обработку с получением достоверных результатов. Поэтому в таких случаях данные по численности ЦБ не включаются в показатели обилия фототрофных микроорганизмов, хотя выявляются при постановке водных и чашечных культур при изучении видового разнообразия.
Перед постановкой опыта в почву внесли свинец в виде ацетата в концентрациях 6, 60, 600 и 6000 мг Pb/кг почвы. Почву помещали в чашки Петри, увлажняли до 60 % от полной влагоемкости, на гладко выровненную поверхность раскладывали покровные стекла. Повторность опыта четырехкратная. Трижды за период опыта определяли прямым микроскопированием численность клеток фототрофов, длину грибного мицелия и численность грибных пропагул. В данном случае под грибными пропагулами понимаются обрывки грибного мицелия.
Увлажнение почвы инициировало размножение в ней микроорганизмов. Так, поллютант в концентрации до 600 мг/кг практически не влиял на интенсивность развития грибного мицелия (табл. 5). Только при 6000 мг/кг РЬ этот показатель уменьшается почти в пять раз, при этом гифы грибов имеют темный цвет. Считают, что доминирование в составе микобиоты пигментированных видов грибов является надежным биоиндикационным показателем неблагополучного состояния почвы (Жданова, Васильевская, 1988; Марфенина, 2005; Терехова, 2007а).
