Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика неионизирующего электромагнитного излучения как фактора окружающей среды 10
1.1. Естественные электромагнитные поля 11
1.2. Источники электромагнитного излучения антропогенного происхождения13
1.4. Биологическое действие электромагнитных излучений сверхвысокочастотного диапазона на разных уровнях организации биологических систем 16
1.5. Механизмы действия электромагнитного поля сверхвысокочастотного диапазона на клетки 24
Глава 2. Материалы и методы 27
2.1. Объект исследования 27
2.1.1. Лабораторные животные 27
2.1.2. Характеристика штамма асцитной карциномы Эрлиха 27
2.2. Источники электромагнитного излучения СВЧ-диапазона, используемые в эксперименте 29
2.3. Биофизические методы исследования 31
2.3.1. Измерение микровязкости мембран клеток асцитной карциномы Эрлиха 31
2.3.2. Метод перфузии изолированной печени крыс 32
2.4. Биохимические методы исследования 34
2.4.1. Определение содержания кислорода и углекислого газа в выдыхаемой животным газовой смеси 34
2.4.2. Определение содержания кислорода, углекислого газа, глюкозы и лактата в периферической крови животных 35
2.4.3. Определение содержания глюкозы и лактата в оттекающем от органа перфузате 35
4 2.4.4. Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в клетках 36
2.4.6. Определение уровня генерации активных форм кислорода методом хемилюминесцентного анализа 40
2.5. Цитологические методы 41
2.5.1. Определение жизнеспособности клеток опухоли 41
2.5.2. Приготовление и окраска препаратов 42
2.6. Статистическая обработка результатов 43
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 44
3.1. Реакция организма здорового животного и животного с асцитной карциномой Эрлиха на действие ЭМИ СВЧ-диапазона 44
3.2. Влияние ЭМИ СВЧ-диапазона на функциональную активность изолированной перфузируемой печени крыс 66
3.3. Физиологические и метаболические изменения клеток в суспензии в ответ на воздействие ЭМИ СВЧ-диапазона 71
Заключение 94
Выводы 97
Использование полученных результатов и практические рекомендации 98
Список использованной литературы 99
- Биологическое действие электромагнитных излучений сверхвысокочастотного диапазона на разных уровнях организации биологических систем
- Источники электромагнитного излучения СВЧ-диапазона, используемые в эксперименте
- Определение уровня генерации активных форм кислорода методом хемилюминесцентного анализа
- Влияние ЭМИ СВЧ-диапазона на функциональную активность изолированной перфузируемой печени крыс
Введение к работе
Актуальность Электромагнитное излучение входит в число значимых экологических факторов. В настоящее время происходят изменения естественного электромагнитного фона в окружающей среде крупных городов за счет увеличения электромагнитной нагрузки в результате активного развития и внедрения в повседневную жизнь новых теле- и радиокоммуникационных технологий, в частности, систем мобильной сотовой связи (Kovacic, P. et al., 2010; Ozgur E. et al., 2010; Aydin B. et al., 2011; Григорьев Ю.Г. и др., 2011; Перов С.Ю. и др., 2012; Kesari K.K. et al., 2012; Kerman M. et al., 2012; Liu C., 2013; Bilgici B., 2013; Баджинян М.Г. и др., 2013; Grenier К. et al., 2013). Всемирная организация здравоохранения определяет необходимость повышения уровня знаний о последствиях влияния на организм электромагнитных полей в диапазоне частот работы системы сотовой связи.
Одним из побудительных мотивов к экспериментальному исследованию влияния ЭМИ СВЧ-диапазона на организм млекопитающих в лабораторных условиях послужил анализ данных по расчету коллективной и индивидуальной электромагнитной нагрузки в Красноярске, показавший, что с одной стороны произошло увеличение площади электромагнитного загрязнения, с другой, при снижении индивидуальной нагрузки в основном за счет повышения качества выпускаемых средств связи, имеется тенденция к увеличению коллективной нагрузки на территории города (Жуль Е.Г. и др., 2008; Кочемарова Ю.В. и др., 2010).
В связи с этим актуальным является изучение реакций организма на изменение уровня электромагнитного фона окружающей среды для оценки рисков нарушения гомеостаза организма и возникновения заболеваний. Несмотря на большое количество исследований по влиянию СВЧ-излучения на организм животных и человека, вопрос об уровне его вреда для здоровья (особенно при малых мощностях) остается открытым (Guney M. et al., 2007; Ammari M. et al., 2008; Григорьев Ю.Г.,2011; Volkow N.D. et al., 2011; Esmekaya M.A. et al., 2011; Arendash G.W. et al., 2012; Grenier К. et al., 2013; Apollonio F. et al., 2013). С другой стороны, в большинстве работ рассматривается реакция здорового организма на воздействие ЭМИ, а то, каким образом ведет себя организм в патологическом состоянии при изменении электромагнитной нагрузки радиочастотного диапазона, изучено крайне мало.
Цель работы – выявление особенностей энергетического метаболизма здоровых животных и животных-опухоленосителей при адаптации к действию электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона.
Задачи:
1. Определить показатели энергетического обмена у здоровых
животных и животных с асцитной карциномой Эрлиха, подвергшихся
воздействию электромагнитного излучения сверхвысокочастотного
диапазона.
2. Определить ключевые параметры метаболической адаптации
изолированной перфузируемой печени крыс после воздействия
электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона.
3. Оценить адаптационные возможности клеток асцитной карциномы
Эрлиха и гепатоцитов в динамике развития опухолевого процесса под
действием электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона.
Научная новизна заключается в установлении особенностей
энергетического обмена у здоровых животных и животных-
опухоленосителей в условиях действия абиотического фактора окружающей среды – электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона. Показано наличие адаптации к действию электромагнитного излучения в диапазоне частот работы системы сотовой связи у здоровых животных и ее отсутствие у животных с асцитной карциномой Эрлиха.
Получены новые данные по жизнеспособности и функциональной активности гепатоцитов и клеток асцитной карциномы Эрлиха в динамике развития опухоли в ответ на действие электромагнитного излучения в диапазоне частот работы системы сотовой связи.
Впервые проведен комплексный анализ влияния электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона одновременно на разных уровнях организации биологических систем: от уровня целого организма до уровня клетки.
Положения, выносимые на защиту:
1. В процессе адаптации к электромагнитному излучению
сверхвысокочастотного диапазона (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2) у здоровых
животных происходит включение в энергетический метаболизм в качестве
основного субстрата белков, а у животных-опухоленосителей – липидов.
2. Увеличение времени воздействия электромагнитного излучения
сверхвысокочастотного диапазона (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2) на организм
приводит к развитию адаптивного ответа в печени здоровых крыс в виде
повышения генерации активных форм кислорода в клетках печени, при этом
изменения функций печени отсутствуют.
Теоретическая значимость заключается в выявлении метаболических и физиологических изменений, возникающих в организме как у здоровых животных, так и у животных с асцитной карциномой Эрлиха, под действием низкоинтенсивного СВЧ-излучения в диапазоне частот работы сотовой связи. Полученные результаты могут способствовать пониманию механизмов адаптации и поддержания гомеостаза на разных уровнях организации биологических систем в состоянии нормы и при патологии в меняющихся условиях окружающей среды.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть
использованы при разработке новых нормативных документов по
электромагнитной нагрузке в диапазоне частот сотовой связи, мер
профилактики и регламентов работы технического персонала,
обслуживающего базовые станции.
Апробация результатов. По теме диссертационного исследования опубликовано 18 научных работ, из которых 4 – в журналах, предусмотренных перечнем ВАК РФ.
Основные результаты работы были представлены на XIII
Международном симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях»
(2006 г., Россия); XIV Всероссийском симпозиуме с международным
участием «Сложные системы в экстремальных условиях» (2008 г., Россия); II
съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (2008 г.,
Молдова); VII Международной конференции «Идентификация систем и
задачи управления» (2008г., Россия); III Международного молодежного
медицинского конгресса «Санкт-петербургские научные чтения – 2009»
(2009г., Россия); XV Всероссийском симпозиуме с международным участием
«Сложные системы в экстремальных условиях», (2010 г., Россия); 2
Всероссийской научно-практической конференции «Физиология адаптации»
(2010 г., Россия); III съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье
человека» (2011 г., Украина); XVI Всероссийском симпозиуме с
международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях» (2012г., Россия); Международной научной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (2013 г., Беларусь); Международной научно-практической конференции «Безопасность жизнедеятельности: психолого-педагогические и медико-биологические аспекты» (2013 г., Россия).
Структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 6 таблицами. Список использованной литературы состоит из 161 источника, из них – 79 отечественных и 82 зарубежных.
Личный вклад автора. Экспериментальные исследования, анализ
полученных результатов, приведенных в диссертационной работе,
выполнены автором лично. Исследования проведены в рамках базовых
проектов фундаментальных исследований II.9.2.5. «Исследование
закономерностей динамики смены клеточных популяций в системе крови» и
II.11.2.1. «Физические характеристики функционирования системы крови»
Федерального государственного бюджетного учреждения науки
«Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук».
Биологическое действие электромагнитных излучений сверхвысокочастотного диапазона на разных уровнях организации биологических систем
Электромагнитные поля не обладают ионизирующей способностью и в биологических объектах воздействуют на уже имеющиеся свободные заряды или диполи. Какие-либо значимые последствия для биологической системы может иметь только поглощенное излучение. Известно, что большая часть поглощенной энергии превращается в тепловую [39], которая отвечает за большинство реакций, наблюдаемых в биологических системах в ответ на воздействие. Показано, что низкоинтенсивное СВЧ-излучение не вызывает нагрева тканей. Однако параметры жизнедеятельности организма в ответ на воздействие ЭМИ СВЧ изменяются достаточно часто.
Существует большое количество работ как отечественных, так и зарубежных авторов, посвященных анализу экспериментальных данных, описывающих воздействие на биологические системы различного вида неионизирующих излучений. В подавляющем большинстве работы связаны с влиянием полей относительно низких уровней интенсивности (магнитного, КВЧ, УВЧ, СВЧ) [40–49]. При этом единого мнения о механизмах воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона нет, поэтому этот вопрос до сих пор остается открытым.
Существуют данные о том, что хроническое воздействие ЭМП радиочастотного диапазона (РЧ) при определенных параметрах оказывает как стимулирующее, так и угнетающее действие на структурные компоненты биосистем (животных, растений, насекомых, почвенные микроорганизмы). Последствиями таких воздействий могут быть подавление или стимуляция роста растений, усиление или ингибирование размножения насекомых, в том числе вредителей, изменение активности почвенных микроорганизмов и поражение растений грибковыми заболеваниями, снижение репродуктивности животных [50, 51].
Выявлено, что ЭМИ на частоте мобильной связи (1 ГГц) вызывает серьезные функциональные расстройства у одноклеточных гидробионтов инфузорий Spirostomum Ambiguum – снижение спонтанной двигательной активности. При этом имеет место необычная форма биологической реакции – эффект является пороговым, массовым и не зависит от продолжительности СВЧ-облучения [52].
Основное внимание исследователей, как правило, сосредоточено на оценке влияния ЭМП на нервную систему и нервные клетки. Важность этих исследований возросла с развитием мобильной сотовой связи и увеличением числа пользователей сотовых телефонов, среди которых большую долю составляют дети [14,16, 22, 53].
В работе [54] проведен сравнительный анализ и математическое моделирование чувствительности лабораторных животных (мыши, крысы) к СВЧ-облучению в зависимости от плотности потока энергии (ППЭ) и мощности поглощенной дозы (МПД). Были получены результаты, представленные в виде зависимостей продолжительности жизни животных различных видов в процессе облучения от ППЭ и МПД СВЧ излучения (0,46; 2,4 и 7 ГГц). Показано, что, если в качестве дозиметрического параметра использовать ППЭ, чувствительность животных к воздействию поля СВЧ возрастает с ростом массы животных. При использовании в качестве дозиметрического параметра МПД последовательность расположения животных по их чувствительности к СВЧ-излучению становится прямо противоположной. Также проведены исследования влияния ЭМИ РЧ на когнитивную функцию крыс в период полового созревания (2 мес.) и в возрасте морфофункциональной зрелости (3,5 мес.). Животных подвергали воздействию импульсного потока электромагнитной энергии частотой 925 МГц, частотой следования импульсов и скважностью в соответствии с сигналом подвижной станции мобильной связи стандарта GSM. В результате было выявлено, что воздействие ЭМИ РЧ в период полового созревания не приводит к изменению когнитивной функции, связанной с пространственной ориентацией, и вызывает улучшение когнитивной функции, связанной со зрительным восприятием, а в период морфофункциональной зрелости не приводит к изменению когнитивной функции, связанной со зрительным восприятием, но вызывает улучшение когнитивной функции, связанной с пространственной ориентацией [55].
Показано модифицирующее влияние низкоинтенсивного ЭМП на характер проявления у мышей поведенческих навыков и проявление адаптационной реакции [56].
В работах [57–60] авторы делают вывод о нейропротекторном эффекте на кортикальных клетках мозга при длительном воздействии ЭМИ (частота 900 МГц, стандарт GSM), предполагая, что полученные данные могут быть потенциальной нефармакологической стратегией при лечении болезни Альцгеймера. В подтверждение данных работ [57–59] можно рассматривать исследование [61] о благоприятном действии СВЧ излучения (частота 900 МГц, стандарт GSM) на смешанную культуру кортикальных клеток мозга эмбрионов крыс, где показана устойчивость и улучшение функций нейронов. Показано, что как у трансгенных животных с болезнью Альцгеймера, так и в культуре клеток мозга нейропротекторный эффект связан с изменением функционирования митохондрий при снижении уровня свободных радикалов в тканях мозга. Влияние нового формата работы сотовых телефонов – 3G на клетки головного мозга описан в работе [6]. Результаты работы показывают, что ЭМП, генерируемое мобильным телефоном в формате 3G, вызывает кратковременное повышение уровня фосфорилирования БТШ27 , БТШ70 и р38 митоген-активируемой протеинкиназы, что приводит к митохондриальной дисфункции: опосредованному высвобождению цитохрома с и последующей активации каспаз, вовлеченных в процесс апоптоза. Исследование показывает, что окислительный стресс является основным фактором, который активирует различные путей передачи сигнала, в том числе БТШ27/p38MAPK. Авторы предполагают, что использование мобильного телефона в формате 3G может привести к ряду неврологических расстройств у абонентов системы сотовой связи [62].
Экспериментальными исследованиями на крысах с моделированным инфарктом миокарда показано, что воздействие волн дециметрового диапазона (ВДД) на область сердца повышает кровенаполнение сосудов микроциркуляторного русла миокарда и скорость кровотока в них, увеличивает количество функционирующих сосудов [48]. Отчетливо проявилась однонаправленность вазодилататорных реакций при воздействии ВДД разной локализации: на область сердца и рефлекторно-сегментарную зону, что свидетельствует не о местном, а о генерализованном характере ответной реакции. Генерализованная вазодилатация, вызванная ВДД, по-видимому, является одним из механизмов снижения периферического сопротивления сосудов, обычно компенсаторно повышенного при сердечной недостаточности даже в начальных стадиях [63]. По мнению авторов, определенная роль в перестройке периферической и регионарной гемодинамики под влиянием ВДД принадлежит изменениям вегетативной регуляции – доминированию парасимпатической регуляции над симпатической, что приводит к снижению тонуса артериолярных и венулярных отделов микроциркуляторного русла.
Авторами показано [64] отклонение в деятельности щитовидной железы. При длительном облучении ЭМП (2375 МГц) у крыс наблюдается антимутагенный эффект, выражающийся в понижении уровня хромосомных аберраций в гепатоцитах, в то время как удаление щитовидной железы делает невозможным появление антимутагенного эффекта у облученных животных. В работе [34] также представлены данные по изучению влияния микроволн нетепловых интенсивностей на генетический аппарат белых крыс. Было отмечено увеличение количества структурных аберраций в клетках костного мозга крыс.
В [65] проведена оценка чувствительности ДНК и стресс-белков в крови у самцов Wistar к воздействию электромагнитного излучения частотой 900 МГц, при разном времени экспозиции 15, 30 и 60 мин. Были получены результаты, которые показали, что после воздействия в течение 15 и 30 мин происходит значительное увеличение повреждения ДНК лейкоцитов, тогда как после 60 мин уровень повреждения незначителен. Уровень содержания БТШ70 значительно увеличился у животных всех трех групп. Возрастание содержания БТШ70 может быть проявлением защитной реакции организма при повреждении ДНК. Таким образом, экспозиция в течение даже незначительного времени может приводить к существенным изменениям на уровне ДНК, которые, в свою очередь, служат причиной различных заболеваний, в том числе онкологических [18]. Об этом свидетельствуют исследования [3, 66], в которых показана связь между воздействием микроволнового излучения и возрастанием количества заболевших лейкемией и опухолями головного мозга. Имеется также ряд данных, указывающих на генетические изменения, вызванные микроволновым излучением [67,68]. В данных по изучению влияния микроволн нетепловых интенсивностей на генетический аппарат беспородных крыс было отмечено увеличение количества структурных аберраций в клетках костного мозга [49].
Напротив, авторы [69] показали отсутствие статистически значимых различий по количеству белков теплового шока и повреждениям лимфоцитов и моноцитов при воздействии полем 900 МГц на человека (0,4, 2,0 и 3,6 Вт/кг; 20 мин, 1 час и 4 часа). Это может свидетельствовать, о том что при данной мощности и времени экспозиции для человека мобильный телефон не является стресс-фактором для лимфоцитов и моноцитов здорового человека.
Источники электромагнитного излучения СВЧ-диапазона, используемые в эксперименте
Для выполнения работы в качестве источников электромагнитного излучения использовали сотовые телефоны марок Nokia 6300, Sony Ericsson W610i (900 МГц, ППЭ 7–9 мкВт/см2) и установку для облучения лабораторных животных электромагнитным полем СВЧ-диапазона, разработанную совместно с сотрудниками кафедры Радиотехники Института инженерной физики и радиоэлектроники СФУ [106]. Облучение в установке производили ежедневно (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2).
Генератор СВЧ энергии вырабатывает гармонический СВЧ сигнал частотой 1 ГГц и мощностью до 80 мВт. Измерение производили прибором М3–21А, подключаемым через аттенюатор с вносимым затуханием 30 дБ, использование которого необходимо для исключения возможности выхода из строя измерительной термоголовки измерителя мощности. Плотность потока энергии (ППЭ) – 70 мкВт/см2
СВЧ-энергия поступала от генератора Г4-22 через согласующий трансформатор и СВЧ коаксиальный кабель в тройник, где часть энергии ответвлялась для измерения уровня мощности, поступающей на облучаемый объект. Отрезок коаксиального кабеля необходим для осуществления конструктивного перехода от трансформатора к тройнику. Также из конструктивных соображений на выходе тройника установлен второй отрезок коаксиального кабеля, который реализует передачу СВЧ-энергии от тройника к антенне, облучающей исследуемый объект. Антенна, облучающая исследуемый объект, представляет собой разомкнутый на конце штыревой резонатор, выполненный из 1,5 мм медной проволоки. СВЧ-энергия подавалась на штыревую антенну через коаксиальный корпусной разъем, установленный на стенке металлической защитной камеры. Длина антенны выбрана равной четверти длины электромагнитной волны в свободном пространстве. Расстояния от антенны до стенок защитной камеры составляют не менее 10 см.
Защитная камера представляет собой металлический ящик со съемной крышкой и вентиляционными щелями для обеспечения подачи воздуха животному, находящемуся в эксперименте. Внутри защитной камеры под антенной на расстоянии около 1 см расположена метаболическая камера (плексигласовый бокс с присоединённым перистальтическим насосом, подающим воздух в камеру со скоростью 100 мл/мин, и отводом для забора проб), т.е., все генерируемое электромагнитное поле концентрируется в объекте, мало распространяясь в окружающее пространство.
Наличие измерителя мощности М3–21А в составе представленной установки позволило осуществлять постоянный контроль уровня мощности в канале передачи СВЧ-энергии на облучаемый объект, а также регулировать уровень мощности в канале до желаемого значения. Уровень мощности измерялся и устанавливался ежедневно до начала эксперимента. 2.3. Биофизические методы исследования
Измерение относительной микровязкости мембраны клеток оценивали по движению флуоресцентного зонда – пирена, включенного в мембрану. Вязкость характеризует трение, возникающее между соседними слоями жидкости, которые движутся с разными скоростями. Возбужденная молекула пирена, сталкиваясь с идентичной невозбужденной молекулой, образует комплекс – эксимер (димер). Пирен концентрируется в гидрофобных компартментах мембраны, располагаясь между жирнокислотными цепями липидов, его эксимеризация пропорциональна подвижности молекул зонда в бислое. Поэтому при прочих равных условиях и неизменной концентрации пирена коэффициент эксимеризации Кэ пропорционален текучести мембраны. При уменьшении микровязкости мембранного бислоя подвижность жирнокислотных цепей в середине бислоя возрастает, увеличивается и вероятность встречи молекул пирена. Поскольку при образовании эксимера на перенос заряда с одной молекулы пирена на другую тратится часть энергии, то эксимер флуоресцирует в более длинноволновой области (Стоксов сдвиг). Таким образом, образование димера можно определить по появлению новой полосы флуоресценции, в области длин волн, больших, чем те, при которых наблюдается обычный спектр флуоресценции зонда [107, 108].
Ход определения. В стаканчик помещали 2,5 мл раствора пирена в конечной концентрации 3 мкМ и 20 мкл суспензии клеток АКЭ. Смесь инкубировали в течение 1 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре, затем 2 мл полученной суспензии помещали в кювету. Снимали спектры флуоресценции на спектрофлуориметре Aminсo Bowman Series 2 (Thermo Spectronic, USA). Для каждого образца определяли микровязкость липидного бислоя мембран клеток (длина волны возбуждения возб= 334 нм) и микровязкость зон белок-липидных контактов (длина волны возбуждения возб= 286 нм).
Определение уровня генерации активных форм кислорода методом хемилюминесцентного анализа
По изменению интенсивности спонтанной хемилюминесценции биологических тканей, жидкостей и клеточных суспензий можно судить о быстропротекающих сдвигах равновесия про- и антиоксидантной систем (рисунок 6), оценивать их направление без учета поведения компонентов равновесия и скорость процессов образования активных форм кислорода. Метод высоко чувствителен, неинвазивен, применяется в диагностике ряда заболеваний[122– 127].
В качестве «люминесцентных зондов» использовали люминол и люцигенин, легко окисляемые свободно-радикальными формами кислорода с 3% квантовым выходом люминесценции в диапазоне 300-600 нм при максимуме излучения на длине волны 425 нм. Они могут либо участвовать в реакциях, образуя электронвозбужденные продукты (химические активаторы или хемилюминесцентные зонды), либо увеличивать квантовый выход эмиссии фотонов в результате переноса энергии электронного возбуждения на активатор (физические активаторы или сенсибилизаторы хемилюминесценции) [127].
Люцигенин избирательно реагирует на образование супероксида (О2-), тогда как люминол дает свечение под действием многих окислителей (ОН-, Н2О2 др.).
Для получения гомогената печени выделяли орган из организма животного и помещали в гомогенизатор. Гомогенизированную массу фильтровали и отмывали раствором Хенкса. Подсчет числа клеток ткани печени проводили в камере Горяева.
Ход определения. Для проведения хемилюминесцентного анализа в кювету набирали 100 мкл суспензии исследуемых клеток (6х106кл./мл), 200 мкл 2,2х10-4 М люминола (Sigma, USA) или люцигенина (Sigma–Aldrich, Switzelend) в растворе Хенкса, 50 мкл суспензии опсонизированных белками сыворотки крови человека частиц монодисперсного латекса (ВНИИСК, С-Петербург) размером 2,3 мкм в концентрации 5х108 частиц/мл для активирования фагоцитоза in vitro.
Регистрацию активных форм кислорода (АФК) in vitro при антигенной активации и без нее проводили в течение 90 мин при температуре 37 С на аппаратурно-программном комплексе «Хемилюминометр CL–3604–ПЭВМ», предназначенном для измерения сверхслабых свечений биологической и физико-химической природы.
Оценку продукции АФК проводили по амплитуде максимальной активности хемилюминесцентной реакции (Imax, имп./с).
Жизнеспособность клеток АКЭ определяли по окраске трипановым синим. Трипановый синий – бензидиновый краситель, водный раствор которого имеет синий цвет; малотоксичен; применяется для витальной окраски препаратов. Живые клетки непроницаемы для красителя, а мембраны погибших клеток проницаемы, вследствие чего клетки окрашиваются.
Использовали 1% раствор трипанового синего, приготовленный на 0,9% растворе хлорида натрия. Подсчет производили в 100 больших квадратах в камере Горяева при малом увеличении микроскопа.
На обезжиренные предметные стекла наносили каплю исследуемой суспензии клеток и делали мазок. Подсохшие на воздухе мазки асцитной карциномы Эрлиха помещали в краску-фиксатор Май-Грюнвальда на 3 мин, далее ополаскивали проточной водой и высушивали. Дальнейшую окраску производили красителем Романовского-Гимза (20 мин), после чего мазки промывали проточной водой, высушивали и микроскопировали (ок.х10, об.х90) с использованием иммерсионного масла. В результате взаимодействия с красителем клетки приобретают ярко выраженную специфическую окраску, что позволяет произвести подсчет и дифференцировку клеток [128].
На приготовленных мазках крови подсчитывали диаметры 1000 эритроцитов. На основании полученных данных строили кривые Прайс-Джонса, отражающие распределение эритроцитов по диаметру.
На приготовленных мазках АКЭ подсчитывали количество клеток, находящихся в состоянии блеббинга, их можно определить по активности цитоплазмы [129] (на мембране появляются выпячивания в виде лепестков цветка – «ромашка») (рисунок 7). Всего насчитывали 200 опухолевых клеток, выделяя клетки в состоянии блеббинга, попавшие в поле зрения.
Статистическую обработку результатов производили с применением критерия Стьюдента. Различия между выборками считали достоверным при уровне значимости меньше 0,05.
Для доказательства адекватности применения критерия Стьюдента проводили проверку нормальности распределения с определением выборочных коэффициентов асимметрии и эксцесса.
Гипотезу о том, что генеральная совокупность, из которой извлечена выборка, распределена по нормальному закону, проверяли с использованием критерия согласия Пирсона 2, сравнивая теоретическое нормальное распределение с числовыми характеристиками данной совокупности и распределение, полученное в эксперименте [130].
Влияние ЭМИ СВЧ-диапазона на функциональную активность изолированной перфузируемой печени крыс
Организм находится в постоянной взаимосвязи с окружающей средой. Интенсивность обмена веществ с внешней средой и скорость внутриклеточных реакций поддерживают постоянство внутренней среды и целостность организма. Одним из первичных регуляторов уровня в крови веществ, поступающих в организм, является печень, как активно метаболизирующая часть организма. Изучение всех аспектов биохимии печени позволит видеть ее участие в работе всего организма при воздействии факторов внешней среды и поддержании гомеостаза в целом.
Исследования проводили на крысах породы Wistar массой 200–250 г. В эксперименте животные были разделены на две группы: контрольную и экспериментальную (рисунок 21).
Животные группы 2 подвергались облучению ЭМИ СВЧ-диапазона в установке (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2) по 3 часа ежедневно в течение 5 суток. Животные группы 1 (контроль) находились в таких же условиях, но были изолированы от источника ЭМИ СВЧ-диапазона.
После окончания облучения печень извлекали и подключали к установке для перфузии органов мелких лабораторных животных. Отток желчи проводили с применением полиэтиленового катетера.
В результате проделанной работы были получены физиологические и биохимические характеристики функционирования изолированной перфузируемой печени крыс после воздействия электромагнитного излучения СВЧ-диапазона.
У животных группы 1 во время перфузии изолированной печени после облучения животного наблюдали повышение давления в воротной вене (рисунок 22), что свидетельствует о спазме сосудов органа, у животных группы 2 сосуды печени реагировали более стабильно: сопротивление сосудов в ходе эксперимента практически не изменялись, а значения располагались ниже контрольной кривой, что может свидетельствовать о возможном усилении микроциркуляции и отсутствии спазма сосудов органа после воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона на животное в установке. Подъем значений в начале перфузии печени животных контрольной группы связан со спазмом сосудов как следствие гипоксического состояния во время выделения органа [115].
Наблюдаемые изменения содержания кислорода в перфузате после трехчасового ежедневного воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона отражают потребление кислорода тканями изолированного перфузируемого органа, как и печенью животных контрольной группы (рисунок 23). Динамика сопротивления сосудов печени и динамика потребления кислорода органом во время изолированной перфузии свидетельствует о взаимосвязи уровня кислорода и изменений микроциркуляции перфузата в изолированном органе.
На рисунке 25 представлено изменение содержания лактата в оттекающем от органа перфузате в контрольной и экспериментальной группах. В контрольной группе прослеживается тенденция к колебаниям концентраций лактата, после облучения этого не наблюдалось.
При сравнении рисунков 23 и 25 можно видеть, что у животных экспериментальной группы содержание лактата в оттекающем от печени перфузате в течение первых 60 мин перфузии снижается сильнее, чем в пробах перфузата, оттекающего от печени животных контрольной группы в то время как содержание кислорода в пробах экспериментальной группы не превышает контрольные значения. Возможно, это результат компенсаторного переключения метаболизма с аэробного пути на анаэробный для поддержания жизнеспособности органа.
Кроме того, у животных группы 2 наблюдали небольшое повышение содержания лактата, за которым следует стабильное понижение. Исходя из этого, можно предположить перераспределение субстратных потоков в направлении глюконеогенеза. Это согласуется с литературными данными о том, что электромагнитное излучение СВЧ-диапазона (900 МГц) способно усиливать реакции синтеза в клетках различных тканей лабораторных животных, одновременно активируя свободно-радикальное окисление [139– 143].
Таким образом, после воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона на организм животного в печени сохраняется нормальное течение метаболических процессов, что способствует выполнению органом своих функций и формированию адаптации к действию фактора внешней среды.
