Содержание к диссертации
Введение
1. Влияние электромагнитного излучения и токсичных веществ на биологические системы и их модели (обзор литературы) 11
1.1. Особенности взаимодействия электромагнитного излучения миллиметрового и субмиллиметрового диапазонов с биологическими системами 11
1.2. Комбинированное действие химических веществ и физических факторов на живые организмы 20
1.3. Токсические свойства и физиологическое действие никотина 24
1.4. Физико-химические и токсические свойства сероводорода 29
1.5. Экспериментальные модели для изучения воздействия химических веществ и физических факторов на организм человека 31
1.5.1. Лабораторные животные 31
1.5.2. Гидробиологические модели 34
1.5.3. Модели клеточных мембран 37
2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Материалы исследования '. 47
2.2. Методы исследования 49
2.2.1. Установки для генерации электромагнитного излучения 49
2.2.2. Изучение изолированного и комбинированного с электромагнитным излучением воздействия никотина на культуру простейших Paramecium caudatum 51
2.2.3. Изучение изолированного и комбинированного с электромагнитным излучением действия никотина на эритроциты 52
2.2.4. Исследование воздействия никотина на липосомы 54
2.2.5. Изучение влияния никотина на свойства гидрозолей ультрадисперсных алмазов и диоксида кремния 55
2.2.6. Изучение изолированного и комбинированного с электромагнитным излучением воздействия сероводорода на лабораторных животных 56
2.2.7. Статистический анализ 58
3. Изолированное и комбинированное воздействие электромагнитного излучения и никотина на био объекты 59
3.1. Действие электромагнитного излучения терагерцового диапазона
на культуру простейших Paramecium caudatum 59
3.2. Изолированное и комбинированное с электромагнитным излучением воздействие никотина на культуру простейших Paramecium caudatum 63
3.3. Изолированное влияние никотина на клеточные мембраны эритроцитов и в сочетании с резонансными частотами электромагнитного излучения 67
3.4. Изучение влияния никотина и электромагнитного излучения на модели мембран и белков 75
4. Изолированное и комбинированное с электромаг нитным излучением действие сероводорода на лабораторных животных 87
4.1. Изучение токсичных свойств сероводорода 87
4.2. Определение летальных концентраций сероводорода, облученного на частотах его резонансного поглощения 91
Заключение 91
Выводы , 103
Список использованных источников
- Комбинированное действие химических веществ и физических факторов на живые организмы
- Установки для генерации электромагнитного излучения
- Изолированное и комбинированное с электромагнитным излучением воздействие никотина на культуру простейших Paramecium caudatum
- Определение летальных концентраций сероводорода, облученного на частотах его резонансного поглощения
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время окружающая природная среда и значительная часть человечества подвержены постоянному воздействию различных химикатов, электромагнитного излучения, радиации и других экологически опасных факторов, большинство из которых являются продуктами хозяйственной деятельности человека. Очевидными последствиями такого воздействия являются увеличение заболеваемости людей, особенно связанной с нарушением иммунного статуса, а также уменьшение численности или даже полное исчезновение отдельных видов животных, как правило, находящихся на высоких трофических уровнях. Таким образом, речь уже идет об отдаленных и глубоких воздействиях на природные экосистемы.
В связи с этим остро стоит задача разработки способов неспецифической защиты клеток от экологически опасных факторов. Прослеживается также связь этой проблемы с изучением механизмов адаптации живых организмов к изменяющимся условиям природной среды.
Перспективным направлением в данных исследованиях является изучение эффектов и механизмов действия электромагнитного излучения (ЭМИ) миллиметрового (ММ) или крайне высоко частотного (КВЧ) диапазона на биологические объекты различного уровня организации, от отдельных клеточных компонентов, изолированных клеток и микроорганизмов до организма животных и человека. Характерной особенностью его воздействия на биообъекты является наличие резонансных эффектов, в проявлении которых ключевая роль отводится структурным и волновым свойствам воды (Синицин и др., 1998). Доказана способность излучения резонансных частот КВЧ-диапазона корректировать реакцию живых организмов на воздействие химических веществ и физических факторов. Обнаружено, что электромагнитные волны компенсируют отрицательное влияние атомов тяжелых металлов на жизнедеятельность гидробионтов, оказывают реабилитирующий и протекторный эффекты при воздействии на человека ионизирующего излучения и электромагнитных полей других диапазонов (Бецкий и др., 2004).
Малоизученным на шкале электромагнитных полей (ЭМП) остается излучение коротковолновой части ММ-диапазона и субмиллиметрового (субММ) диапазона длин волн, которое называют терагерцовым (ТГц). Известно, что мембрана живой клетки находится в возбужденном колебательном состоянии в диапазоне частот 0.1–1.0 ТГц, а в интервале 0.05–0.40 ТГц лежит подавляющее большинство вращательных молекулярных спектров низкомолекулярных газов, играющих важную роль в процессах обмена веществ и в проявлении токсических эффектов (Бецкий и др., 2005). Поэтому поиск новых биологически значимых частот в ТГц-диапазоне ЭМИ и изучение биоэффектов их воздействия в сочетании с токсичными и физиологически активными веществами (ФАВ) представляют важную и актуальную задачу экологии.
Для исследования эффектов сочетанного воздействия ЭМИ и химических веществ нами выбраны экотоксиканты различной химической природы и физиологического действия: никотин и сероводород.
Цель и задачи исследования. Выявление новых биологически значимых частот в терагерцовом диапазоне и изучение эффектов воздействия электромагнитного излучения этих частот в сочетании с токсичными химическими соединениями на биологические объекты разного уровня организации. В ходе реализации основной цели решались следующие задачи:
– определить с помощью гидробиологической тест-культуры Paramecium caudatum резонансные частоты электромагнитного излучения низкой интенсивности в терагерцовом диапазоне;
– исследовать изолированные и комбинированные эффекты воздействия никотина и электромагнитного излучения резонансных частот на клетки простейших Paramecium caudatum и эритроциты лабораторных животных;
– изучить влияние никотина на клеточные мембраны и примембранную водную фазу, используя методы экспериментального моделирования;
– изучить комбинированное действие сероводорода и электромагнитного излучения низкой интенсивности на лабораторных животных;
– определить среднелетальные концентрации сероводорода, облученного на частотах его резонансного поглощения.
Научная новизна. По изменению подвижности клеток гидробиологической культуры простейших P. caudatum установлен резонансный характер низкоинтенсивного излучения в диапазонах частот 120–170 и 270–380 ГГц. При этом обнаружено, что излучение на частотах 151.8, 155.7, 156.6, 161.3 и 167.1 ГГц, приводит к наибольшему отклонению тест-реакции инфузорий от контроля. Впервые изучены эффекты изолированного и комбинированного воздействия водных растворов никотина и излучения указанных резонансных частот на инфузории и эритроциты. Показано, что воздействие ЭМИ на резонансной частоте 167.1 ГГц приводит к уменьшению токсического эффекта никотина. Установлено дестабилизирующее действие никотина на клеточные мембраны. С помощью моделей мембран и белков показано, что никотин в низких концентрациях дестабилизирует сетку водородных связей приповерхностной воды, что, возможно, определяет характер его неспецифического действия на живой организм. Полученные результаты свидетельствуют о корректирующей роли воды в реализации эффектов комбинированного действия ТГц-излучения низкой интенсивности и токсичного вещества. Впервые изучено влияние низкоинтенсивного терагерцового излучения на токсические свойства сероводорода. Установлено, что среднелетальная концентрация газа под воздействием ЭМИ на частотах его резонансного поглощения 167 и 303 ГГц увеличивается практически в два раза.
Научно-практическая значимость. Показана возможность применения гидробиологической тест-культуры P. caudatum для определения биологически значимых частот ЭМИ в ТГц-диапазоне, что можно использовать в экологическом мониторинге. Определена резонансная частота ЭМИ (167.1 ГГц), при которой компенсируется токсический эффект никотина в водных растворах. На примере сероводорода впервые показана возможность уменьшения токсичности газов в результате воздействия излучения низкой интенсивности на частотах их резонансного поглощения. Эти результаты могут найти применение в экотехнологиях. Установленная способность никотина в малых концентрациях дестабилизировать структуру сетки водородных связей примембранной воды позволит уточнить механизм неспецифического действия алкалоида на клеточные мембраны.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены: на десятой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006), четвертом Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006), третьей Научно-практической конференции «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия» (Москва, 2006), седьмой Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), третьей Всероссийской конференции «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2007), четвертой международной научно-практической конференции «Экология речных бассейнов» (Владимир, 2007), седьмой международной крымской конференции «Космос и биосфера» (Судак, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 3 из которых в изданиях перечня ВАК РФ.
Декларация личного участия автора. Диссертантом выполнен весь объем экспериментальных работ, проведены расчеты, обработка и анализ результатов, сформулированы положения, выносимые на защиту и выводы. В совместных публикациях доля участия автора составила 50–80%.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах, состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов, содержит 25 рисунков и 10 таблиц. Библиографический указатель включает 213 источников отечественной и зарубежной литературы.
Положения, выносимые на защиту:
-
Низкоинтенсивное электромагнитное излучение терагерцового диапазона определенных частот вызывает достоверное изменение тест-отклика инфузорий Paramecium caudatum.
-
Электромагнитное излучение на резонансной частоте 167.1 ГГц способно компенсировать токсические эффекты водных растворов никотина.
-
В неспецифическом действии никотина в низких концентрациях на мембраны важную роль играет структура и подвижность примембранной воды.
-
Воздействие электромагнитного излучения низкой интенсивности на частотах 167 и 303 ГГц на сероводород способствует снижению его токсичности.
Комбинированное действие химических веществ и физических факторов на живые организмы
Практический интерес к излучению миллиметровых и субмиллиметровых волн возник в 1960-е гг., когда российскими учеными были разработаны широкополосные генераторы - лампы обратной волны с продольным магнитным полем (ЛОВ-О). С помощью этих электровакуумных приборов можно полностью перекрыть ММ-диапазон и значительную часть субмиллиметрового диапазона (Голант и др., 1965; Девятков, 1985). На основе ЛОВ-0 были созданы измерительные приборы (генераторы стандартных сигналов типа Г4-141, 142 и др.), а также первые терапевтические установки (Бецкий, Яременко, 2002). В настоящее время существует большое разнообразие приборов с малой и большой выходной мощностью, генерирующих ММ- и субММ-волны: оротроны, гиротроны, лазеры на свободных электронах, мазеры на циклотронном резонансе, релятивистские черенковские генераторы (карци-нотроны, многоволновые черенковские генераторы) и т.д., которые позволя ют использовать данное излучение в различных областях науки и техники (Соколов, 1995; Бецкий и др., 2004).
Крайне высоко частотное излучение нашло широкое применение в радиолокации, радионавигации, радиосвязи (Бецкий и др., 2005). Сравнительно новыми техническими областями его использования являются локальные информационные системы (связь вне и внутри зданий), системы радиовидения, миллиметровая спектроскопия. Особый интерес вызывает применение ММ-волн в медицине, экологии и биотехнологии. В последние годы ММ-излучение низкой интенсивности активно внедряется в медицинскую практику для лечения широкого спектра заболеваний (КВЧ-терапия). Современные лечебно-диагностические аппараты выпускаются, как правило, с фиксированными длинами волн - X = 2.5, 4.9, 5.6 и 7.1 мм (Ермолаев, 1998).
Практически не освоенным остается ТГц-диапазон ЭМИ (Бецкий и др., 2005), однако он привлекает внимание специалистов самых различных областей. Например, рассматривается возможность применения ТГц-волн в экологии для мониторинга окружающей среды: определения вредных примесей в атмосфере, воде, в ближнем космическом пространстве и т.д. (Петросян и др., 2001; Бецкий, Яременко, 2002). В медицине большие надежды связывают с использованием ТГц-излучения в ранней диагностике онкологических заболеваний, а также в новых методах физиотерапии (Бецкий и др., 2005).
Таким образом, биофизические свойства электромагнитных волн ММ-и субММ-диапазонов определяют особенности их взаимодействия с физическими и биологическими средами и возможности применения в нетрадиционных областях. В связи с этим огромный научный и практический интерес представляют эффекты воздействия данного излучения на биосистемы.
Наиболее подробно изучены биоэффекты ММ-излучения низкой интенсивности. Исследование воздействия ЭМИ ММ-диапазона на биологические объекты началось сразу за освоением в радиотехнике этого диапазона частот. К настоящему времени, благодаря большому количеству научно-исследовательских работ в области биологии, медицины, радиофизики и электроники, получены неопровержимые доказательства биологической значимости данного излучения (Бецкий и др., 2005).
Исследователи отмечают, что эффекты воздействия регистрируются при плотности потока энергии (ППЭ) значительно ниже 10 мВт/см , при которой практически отсутствует нагрев облучаемого объекта (Девятков и др., 1991; Хижняк и др., 1991; Бецкий и др., 1996), поэтому данное излучение относят к нетепловым, «информационным» воздействиям (Пресман, 1968). Кроме того, для низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ часто наблюдается протяженный участок (плато), в пределах которого эффект воздействия слабо зависит от мощности излучения, что характерно для эффектов «сверхмалых доз» (Бурлакова и др., 2004).
С другой стороны, биологический отклик зависит от параметров КВЧ-излучения (частоты, формы сигнала, экспозиции), а также локализации облучения, исходного состояния и индивидуальных особенностей биологического объекта. Частотная зависимость биоотклика обычно имеет вид острой резонансной кривой. Эффект воздействия носит кумулятивный характер.
Первыми объектами, которые использовались в биологических исследованиях КВЧ-излучения, являлись микроорганизмы. Практически во всех экспериментальных работах (Брюхова и др., 1987; Исаева, 1991; Божанова и др., 1991; Тамбиев и др., 2003 и др.) отмечено, что под действием ММ-волн изменяются параметры жизнедеятельности, регулируется физиологическая активность, мобилизуются резервные возможности микроорганизмов. На примере бактерий Е. coli обнаружено сохранение эффектов в нескольких последующих циклах пересева культуры (Андреев и др., 1991). Установлено, что в результате облучения увеличивается способность микроорганизмов продуцировать белки, витамины, аминокислоты, что находит применение в биотехнологических процессах. Например, облучение пивоваренных дрожжей Saccharom carlsb (штамм S-Львовская) на длине волны X = 6.036 мм приводит к интенсификации производственного процесса, улучшению вкусовых качеств и питательности пива (Брюхова и др., 1987). Изучение биоэффектов ЭМИ проводилось также на клетках и субклеточных структурах, например, биологических мембранах. В работах С.А. Ильиной (1987, 1991) показано уменьшение осмотической устойчивости эритроцитов и проницаемости их мембран для ионов калия под действием ММ-волн. С другой стороны обнаружено восстанавливающее действие ЭМИ КВЧ (40-50 ГГц, 1-5 мВт/см ) на мембраны, поврежденные в результате электрического пробоя. Следовательно, КВЧ-излучение нетепловых интен-сивностей способно индуцировать структурные перестройки в мембранах.
Установлена важная роль ионов Са в проявлении эффектов КВЧ на мембраны: только кальций-зависимые системы внутриклеточной сигнализации (Са2+-активируемых калиевых и хлорные каналы) проявляли чувствительность к ЭМИ (Adey, 1988; Walleczek, 1992; Сафронова и др., 1997; Алов-ская и др., 1998). Предположено, что под действием ЭМИ изменяется внутриклеточная концентрация ионов кальция и сродство к ним белков (Гапеев и др., 1996, 1997; Сафронова и др., 1997; Аловская и др., 1998). Обнаружено, что посредником действия ЭМИ КВЧ на ионные каналы является водный раствор, контактирующий с их внутриклеточной стороной (Fesenko et al., 1995).
Таким образом, при облучении мембран наблюдаются как структурные, так и функциональные изменения. Видимо, мембраны играют главную роль в эффективном восприятии и дальнейшем проявлении действия ЭМИ КВЧ на клетку.
Установки для генерации электромагнитного излучения
К лабораторным животным относятся некоторые виды грызунов, плотоядных и птиц (мышей, крыс, морских свинок, хомяков, кроликов, кошек, собак, обезьян, голубей, перепелов и др.), специально разводимых в лабораториях или питомниках для последующего использования в медико-биологических исследованиях (Западнюк и др., 1983; Петровский, 1989; Покровский, 1992).
Известно, что разведение лабораторных животных контролируется по генетическим, морфологическим и экологическим признакам. Генетически их подразделяют на нелинейных и линейных. Нелинейных, т.е. генетически гетерозиготных животных, разводят на основе более или менее случайных скрещиваний внутри имеющегося поголовья; линейных (генетически высокогомозиготных) - на основе близкородственного скрещивания внутри линии. Каждая линия (так называемая чистая или инбредная линия) имеет особенности в наборе генов и реактивности на изучаемые воздействия. Экологический контроль направлен на унификацию условий содержания и кормления. С этой точки зрения лабораторных животных подразделяют на конвенциональных и гнотобиотических, или гнотобиотов. Конвенциональные животные выращиваются в обычных условиях, гнотобиоты контролируются по микрофлоре и паразитам (Петровский, 1989).
Отмечается, что выбор вида, линии, возраста и пола животных диктуется областью и целями исследований. В экспериментах рекомендуется использовать подопытных животных однородных по возрасту, полу, массе и генетическим характеристикам (Западнюк и др., 1983).
В токсикологии, в соответствии с дифференцированными задачами моделирования эффектов токсического воздействия химических соединений, эксперименты проводят на различных лабораторных животных, самыми распространенными видами являются грызуны, птицы и крупные млекопитающие (Западнюк и др., 1983; Шелыгин и др., 2002).
По мнению некоторых авторов для моделирования последствий острых и хронических интоксикаций наиболее удобно использовать неинбредных крыс (альбиносы черной и серой крыс). Это объясняется простотой содержания животных, возможностью размещения на сравнительно небольшой территории достаточного количества особей, небольшим весом, устойчивостью к инфекционным заболеваниям, большим приплодом (Шелыгин и др., 2002).
Следует отметить, что токсикологические исследования проводятся и на линейных животных. В данном случае указывается линия (штамм) животных, поскольку чувствительность к веществу может меняться и внутри вида в зависимости от линии. Сообщается, что в настоящее время выведено более 100 отдельных аутобредных стоков и инбредных линий лабораторных крыс, из которых в токсикологических исследованиях используются крысы стоков Wistar, Bio Breeding Sprague-Dawley, C57BL, CFI, СЗН и др. (Шелыгин и др., 2002).
Во всех токсикологических экспериментах предпочтение отдается самцам, так как они не имеют гормональных колебаний, способных оказывать влияние на мембранотропное действие ядов, и молодым животным, поскольку у них меньше толерантность к различным токсичным веществам (Запад-нюк и др., 1983).
Основные результаты в области исследований воздействия ЭМИ КВЧ низкой интенсивности на живой организм получены на лабораторных крысах и мышах (Севастьянова и др., 1969, Севастьянова и др., 1970; Соболева, Иг-нашева, 1991; Рыжова и др., 1991). Выбор животных в качестве объекта исследования обусловлен тем, что они обладают повышенной чувствительностью к действию ЭМИ и являются удобным экспериментальным материалом для моделирования воздействия данного фактора на человека. Эти исследования позволили применить низкоинтенсивные ММ-волны в условиях клиники (Бецкий и др., 2004).
Однако, существует свидетельства того, что реакция человека и животных на действие различных факторов может быть не одинакова (Грабовская, 1992; Штемберг и др., 2000, Чуян, 2004). Поэтому для моделирования эффектов низкоинтенсивных воздействий, в том числе электромагнитной природы, на человека некоторые авторы считают целесообразным использовать не случайные выборки, а однородные группы животных, однотипно реагирующих на внешние воздействия (Чуян, Джелдубаева, 2006).
Для определения типологических особенностей крыс многие исследователи предпочитают применять тест «открытое поле» (Родина и др., 1993; Коплик, 1995; Юматов, 1990; Судаков, 1998). Данный тест позволяет относительно быстро выявить индивидуальные различия между животными, оценить их эмоциональную реактивность (Маркель, 1981). Так, в работе Е.Н. Чуян и Э.Р. Джелдубаевой (2006) с помощью теста «открытое поле» сформированы однородные группы животных при исследовании антиноци-цептивного действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ.
Таким образом, экстраполяция на человека экспериментальных данных, полученных с помощью лабораторных животных, требует определенной осторожности ввиду индивидуальных особенностей реакций на действие различных факторов внешней среды. Тем не менее, опыты на животных позволяют оценить степень воздействия неблагоприятных факторов на организм человека.
Анализ литературных данных позволяет нам выбрать для изучения эффектов комбинированного действия сероводорода и ЭМИ лабораторных крыс-самцов, отобранных по возрасту и весу. Для определения острой токсичности газа не требуется подбора животных по их типологическим особенностям.
В настоящее время для оценки биологической активности химических соединений и физических факторов, а также прогноза последствий их воздействия на экосистемы, все большее распространение получают методы биологического тестирования. В биотестировании о качестве среды, факторах, действующих самостоятельно или в сочетании с другими, судят по выживаемости, состоянию и поведению специально помещённых в эту среду организмов - тест-объектов (Евгеньев, 1999; Дятлов, 2000; Брагинский, 2000).
В качестве организмов-биоиндикаторов применяются различные гид-робионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы (Галактионов, 1980; Кудрин и др., 1997; Жмур, 1997; Федоров, Капков, 2000). Наиболее популярными объектами биотестирования являются ювенальные формы планктонных ракообразных фильтратов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis, ресничные инфузории (класс Ciliata).
В биологических экспериментах используют такие безвредные, высокочувствительные к загрязнениям окружающей среды виды инфузорий, как тетрахимены (род Tetrahymena, вид Tetrahymena pyriformis), парамеции (род Paramecium, вид Paramecium caudatum), спиростомы (род Spirostomum, вид Spirostomum ambiguum) (Зайцева, 2001). По сравнению с другими группами простейших инфузории имеют наиболее сложное строение, являясь вершиной организации одноклеточных животных.
Отмечается, что результаты, полученные на инфузориях, имеют высокий коэффициент корреляции с результатами подобных исследований на мышах, крысах, кроликах и других животных (Зайцева, 2001). Благодаря сочетанию в инфузориях признаков клетки и организма на них можно моделировать как клеточные, так и организменные реакции на токсическое воздействие (Еропкин, 1999; Бакаева, 1998; Догель, 1975).
Часто в биотестах используют Paramecium caudatum. Они абсолютно безопасны в работе. Это обитатели наших пресноводных водоёмов, колодцев и т.д., их патогенных форм не существует. P. caudatum имеет форму туфельки, отсюда и произошло их название - «инфузория-туфелька». Длина клетки составляет 0.12-0.13 мм. Клетка парамеции состоит из жесткой пелликулы, т.е. плазматической мембраны с лежащим под ней слоем плоских вакуолей (альвеол), которая окружает клеточное содержимое - цитоплазму. Цитоплазма разделяется на два слоя - эктоплазму (наружный) и эндоплазму (внутренний). Зернистая внутренняя цитоплазма у P. caudatum содержит одно крупное ядро (макронуклеус) и одно мелкое ядро (микронуклеус), пищеварительные вакуоли и две сократительные вакуоли.
Изолированное и комбинированное с электромагнитным излучением воздействие никотина на культуру простейших Paramecium caudatum
Установлено, что действие ЭМИ на частотах 156.6 и 161.3 ГГц на клетки, проинкубированные в средах с никотином в концентрации 10" и 10"10 моль/л, приводит к увеличению отклонения реакции тест-культуры от контроля {р 0.05). Следовательно, для излучения на частотах 156.6 и 161.3 ГГц наблюдается аддитивный эффект комбинированного воздействия.
Из диаграммы, представленной на рис. 3.4. видно, что воздействие волн на «отрицательной» резонансной частоте (167.1 ГГц) на культуру, выдержанную в средах с никотином, приводит к уменьшению и увеличению эф фектов воздействия никотина в концентрациях 10 9 и 10"10 моль/л соответственно (р 0.05). Для концентрации никотина 10"9 моль/л отмечается приближение тест-реакции к контролю.
На наш взгляд, наблюдаемое явление обусловлено различным воздействием резонансного излучения и никотина на структуру воды, что проявляется в изменении отклика культуры простейших P. caudatum. Следует отметить, что некоторые авторы связывают парадоксальный характер действия низких концентраций БАВ на биосистемы со структурными изменениями в их водной компоненте (Бурлакова и др., 2003, 2004).
Представляло интерес сравнить эффекты комбинированного действия никотина и ЭМИ с аналогичными эффектами с участием метронидазола - лекарственного препарата антимикробного действия, у которого были обнаружены цитопротекторные свойства. Показано, что последние обусловлены способностью вещества в концентрации 10"5-10"9 моль/л снижать диффузионную подвижность воды и формировать мощную гидратную оболочку в примембранной области (Кузнецов и др., 2006).
Нами изучалось совместное действие метронидазола в концентрации 10" моль/л и ЭМИ на резонансной частоте 167.1 ГГц на инфузории. В данном эксперименте время инкубации культуры с метронидазолом составило 40 мин, время экспозиции ЭМИ - 10 мин. Результаты представлены на рис. 3.5.
Из диаграммы видно, что при комбинированном воздействии метронидазола и ЭМИ с частотой 167.1 ГГц наблюдается увеличение тестового показателя на 50% по сравнению с изолированным эффектом вещества (р 0.05). Наблюдаемый синергизм действия вещества и ЭМИ хорошо объясняется однотипным влиянием на структуру воды.
Таким образом, при изучении комбинированного воздействия ФАВ в низких концентрациях и излучения на резонансных частотах выявлена частота 167.1 ГГц, при которой наблюдается антагонистический эффект ЭМИ и никотина, синергетический эффект ЭМИ и метронидазола
Изолированное влияние никотина на клеточные мембраны эритроцитов и в сочетании с резонансными частотами электромагнитного излучения
На данном этапе исследований нами изучалось изолированное и комбинированное действие никотина и ЭМИ на мембраны эритроцитов.
Первоначально определяли действие никотина в широком концентра-ционном диапазоне (10"-10"" моль/л) на активность мембраносвязанного фермента эритроцитов АТФ-азы. Биологическое значение АТФ-аз связано с рядом важных метаболических процессов в эритроците: обмен энергии и АТФ, гемоглобина, транспорт ионов, процесс гликолиза и др. Активность этого фермента существенно зависит от состояния мембраны, конформации белка, подвижности его водного окружения, т.е. по изменению АТФ-азной активности можно судить о неспецифическом действии ФАВ на мембраны.
На рис. 3.6. представлена зависимость активности фермента от концентрации вещества, ее характер свидетельствует об увеличении активности АТФ-азы эритроцитов, проинкубированных с никотином, по сравнению с контролем (р 0.05).
Фермент не обладает сродством к алкалоиду, поэтому эффекторное действие вещества может быть обусловлено его неспецифическим связыванием с мембранами, с определенными участками белка, а также с изменением подвижности и структуры приповерхностной воды, влияющей на кон-формацию белка. Последнее предположение более вероятно из-за немонотонности действия и эффекта низких концентраций никотина. Оценить уровень воздействия химического соединения на мембраны эритроцитов можно также по изменению их гемолитической устойчивости в отношении детергента ДСН (Черницкий, Сенькович, 1997). В некоторых работах данный метод использовался для изучения неспецифического воздействия ФАВ в низких концентрациях на мембраны (Кузнецов и др., 2004, 2005).
Нами изучался характер медленного гемолиза эритроцитов, проинкубированных в растворах никотина концентраций 10 15-10"4 моль/л. Определяли относительные значения скорости и процента медленного гемолиза. Контролем являлась суспензия эритроцитов без никотина. Из рис. 3.7. видно, что полученные зависимости имеют волнообразный характер во всем диапазоне концентраций никотина с тенденцией к увеличению параметров гемолиза относительно контроля. Значимое локальное увеличение параметров зафиксировано для концентраций никотина 10"6,10"9и 10"12 моль/л (р 0.05).
Можно предположить, что дестабилизирующее воздействие никотина в концентрациях до 10"6 моль/л (сопоставимой с содержанием детергента -4x10"5 моль/л) обусловлено встраиванием его молекул в билипидный слой мембраны. Но для низких концентраций алкалоида такой механизм маловероятен. Мы связываем дестабилизирующее действие низких концентраций вещества (10" , 10" моль/л) с изменением структуры и подвижности при-мембранной и трансмембранной воды, индуцированным алкалоидом.
Известно, что метронидазол в низких концентрациях оказывает стабилизирующее действие на мембраны эритроцитов, уменьшая степень их гемолиза волнами низкой интенсивности на резонансной частоте 65 ГГц (Кузнецов и др., 2006). Поскольку никотин проявляет противоположное метронида-золу действие на структуру приповерхностной воды, ожидалось, что эффект его воздействия на мембраны в сочетании с ЭМИ резонансной частоты будет более выражен, чем изолированные эффекты.
Определение летальных концентраций сероводорода, облученного на частотах его резонансного поглощения
Проведенные исследования показали, что воздействие ЭМИ на сероводород приводит к уменьшению смертности животных при затравке газом, среднелетальная концентрация облученного газа увеличивается практически в два раза. Причем, на токсический эффект сероводорода влияют параметры облучения. Наибольший эффект обнаружен при воздействии излучения на частотах 167 ГГц при ППЭ 6 мкВт/ см" и 303 ГГц при ППЭ 240 мкВт/см".
Причин уменьшения токсического воздействия сероводорода, облученного волнами с частотами собственного резонансного поглощения газа, может быть несколько. Во-первых, в газовых пробах могут присутствовать пары воды, а вода под действием ЭМИ изменяет свою структуру - это может оказывать влияние на живой организм (Fesenko et al., 1995; Гапочка и др., 1994; Бецкий, 1998). Во-вторых, не исключена возможность структурирования сероводорода. Образование квазиустойчивых структур может проявляться в снижении токсичности газа (Николаев, 2000). В-третьих, уменьшение токсического воздействия сероводорода на лабораторных животных может быть связано с образованием в газовых пробах под действием ЭМИ сульфа-нов, которые имеют меньшую токсичность (Губер и др., 1985).
Проверка данных гипотез требует проведения комплексных физико-химических исследований газовых проб, подвергнутых облучению ЭМП. Изучалась возможность снижения токсичности сероводорода путем воздействия на него низкоинтенсивного терагерцового излучения на частотах резонансного поглощения газа: 167 и 303 ГГц. Влияние ЭМИ на свойства газа оценивали методом определения острой токсичности на белых неинбред-ных крысах. Поскольку среднелетальные концентрации сероводорода для человека и крыс при ингаляционном введении по разным источникам составляют 1000-1400 мг/м"3 (Haggard et al., 1922 для затравки использовали концентрации, начиная с 940 мг/м , последовательно увеличивая на 320 мг/м .
В процессе ингаляции газа наблюдали два типа поведения животных: реакция первого типа - моментальное наступление заторможенного (малоактивного) состояния (животные сжимались или забивались в угол), позже наступало коматозное состояние; реакция второго типа - возбужденное поведение крыс с момента начала воздействия газа (животные метались в камере вплоть до наступления коматозного состояния).
Методом пробит-анализа определены среднелетальные концентрации сероводорода: без облучения - 1303 мг/м ; при облучении на частоте 167 ГГц с ППЭ 6 мкВт/см - 2465 мг/м ; при облучении на частоте 303 ГГц с ППЭ 6 и 240 мкВт/см" - 2199 и 2465 мг/м" соответственно. Обнаружено, что токсичность газа при его облучении уменьшается в 1.7-1.9 раза и является мини-мальной при облучении на частотах 167 ГГц при ППЭ 6 мкВт/см" и 303 ГГц при ППЭ 240 мкВт/см . Контроль концентрации сероводорода в камере с животными и без них показал, что уменьшение токсичности газа не связано с его утечкой. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Антропогенное воздействие на окружающую среду в последнее время принимает угрожающий характер. Реальную опасность для жизни и здоровья человека, функционирования живых систем представляет загрязнение атмосферы табачным дымом, основным токсичным компонентом которого является никотин. Уменьшение средней продолжительности жизни человека связывают с негативным воздействием никотина на органы и ткани, а также с его наркотическими свойствами.
Другой потенциальной экологической опасностью является загрязнение окружающей среды сероводородом. Эта проблема имеет приоритетное значение, например, в Нижнем Поволжье, которое располагает крупнейшими в мире запасами нефти и газа с высоким содержанием (до 25%) сероводорода. Поиски, разведка и добыча углеводородного сырья в регионе становится экологическим бедствием. Очевидными последствиями неблагоприятного воздействия являются увеличение заболеваемости людей, уменьшение численности или даже полное исчезновение отдельных видов животных.
В связи с увеличением антропогенной нагрузки на организм и биосферу в целом остро стоит задача разработки способов неспецифической защиты организма от экологически опасных факторов. В последние годы большое внимание специалистов уделяется электромагнитному ММ-излучению низкой интенсивности. ЭМИ данного диапазона успешно используется в медицине (КВЧ-терапия), изучается возможность его применения для решения экологических задач: описана его способность снижать токсичность водной среды; установлены его реабилитирующий и протекторный эффекты при воз действии на человека ионизирующего излучения и неблагоприятного действия электромагнитных полей других диапазонов. Большой интерес вызывает ЭМИ терагерцового диапазона, в котором находятся вращательные спектры низкомолекулярных газов, собственные резонансные частоты некоторых биоструктур и воды.
С целью обнаружения новых биологически эффективных частот нами исследовано ТГц-излучение частотных диапазонов 120-170 и 270-380 ГГц. Известно, что первичными мишенями воздействия ММ- и субММ-волн является водная компонента биосистемы и клеточные мембраны, поэтому в экспериментах использовалась гидробиологическая тест-культура инфузорий P. caudatum, изменение отклика которой на химическое вещество или ЭМИ обусловлено изменением проводимости ионных каналов, регулирующих поступление в клетку кальция. Функционирование каналов зависит от конфор-мации белковых молекул, на которую оказывает влияние диффузионная подвижность воды, поэтому наибольший эффект излучения проявляется на резонансных частотах, для которых в водных средах существуют «окна прозрачности». Чем значительнее отклонение реакции инфузорий на ЭМИ от контроля, тем больше вероятность, что данная частота является резонансной, а значит биологически эффективной.
Нами установлен резонансный характер взаимодействия низкоинтенсивного ЭМИ указанных диапазонов с клетками и выявлены наиболее значимые резонансные частоты. В диапазоне 120-170 ГГц - это частоты 156.6 и 161.3 ГГц, для которых обнаружено увеличение подвижности инфузорий на 27% по сравнению с контролем и частоты 151.8, 155.7 и 167.1 ГГц, связанные с уменьшением тест-отклика в 2-3 раза. В диапазоне 270-380 ГГц выделены две частоты со значимым «положительным» эффектом (271 и 323 ГГц) и множество частот с «отрицательным» эффектом, из которых наиболее выражены частоты 289, 295, 333 и 347 ГГц.
