Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 9
Обзор литературы 9
1.1. Подходы к методам оценки состояния окружающей среды 9
1.1.2 Молекулярный и клеточный уровень организации биосистем 12
1.1.3 Организменный уровень биосистем (морфологический подход) 15
1.1.4 Ценотический и экосистемный уровни биосистем 16
1.1.5 Ценотический уровень: симбиотические ассоциации
1.2 Тяжёлые металлы, как приоритетный загрязнитель окружающей среды 24
1.2.1 Взаимодействие соединений тяжёлых металлов с компонентами среды 25
1.2.3 Подходы к оценке биоаккумуляция и биоконцентрации металлов 29
1.3 Биологические особенности морских звезд Asterias rubens
1.3.1 Общая характеристика морских звезд Asterias rubens 34
1.3.2 Характеристика Asterias rubens, как объекта биоиндикационных и экотоксикологических исследований 35
1.3.3 Поступление, биоаккумуляция и выведение металлов в теле морских звезд Asterias rubens 39
1.5.2 Клеточные элементы целомической жидкости морских звезд Asterias rubens 42
ГЛАВА 2 45
Материалы и методы 45
2.1. Объекты исследования 45
2.1.1. Симбиотическая ассоциация морских звезд Asterias rubens L. и обитающих на них копепод Scottomyzon gibberum Scott 45
2.2. Методы сбора материала 46
2.3. Характеристика заселенности 49
2.4. Поведенческий ответ (время переворота, RT) 51
2.5. Анализ клеток целомической жидкости 52
2.6. Оценка токсичности тяжелых металлов 53
2.7. Анализ содержания металлов 55
2.8. Статистический анализ данных 56
ГЛАВА 3 58
Краткая характеристика района исследования 58
3.1. Общая характеристика Белого моря 58
3.2. Характеристика уровней антропогенного воздействия на экосистему Белого моря 59
3.3. Характеристика района сбора материала 62
3.4 Гидролого-химическая характеристика района сбора материала 63
ГЛАВА 4 70
Результаты и их обсуждение 70
4.1 Биоаккумуляция тяжелых металлов (BAF) в морских звездах Asterias rubens 4.2 Биоконцентрация тяжелых металлов (BСF) в морских звездах Asterias rubens в экспериментальных условиях 77
4.3 Особенности клеточных элементов целомической жидкости в морских звездах Asterias rubens
4.3.1 Численность целомоцитов и доля микроядер в них 80
4.3.2 Доля микроядер в морских звездах Asterias rubens в экспериментальных условиях 4.4 Изменение поведенческих реакций морских звезд Asterias rubens при воздействии металлов в экспериментальных условиях 84
4.5 Выживаемость морских звезд Asterias rubens при воздействии тяжелых металлов 85
4.6 Плодовитость копепод Scottomyzon gibberum при воздействии тяжелых металлов и оседание на морские звезды 86
4.7 Особенности размера карапакса и относительного возраста копепод Scottomyzon gibberum 87
4.8 Особенности заселенности морских звезд Asterias rubens копеподами Scottomyzon gibberum 4.8.1 Заселённость размерных классов морских звезд 92
4.8.2. Сезонная динамика заселенности морских звезд Asterias rubens копеподами Scottomyzon gibberum 96
4.8.3 Особенности заселенности морских звезд Asterias rubens копеподами Scottomyzon gibberum на разных глубинах 98
4.8.4 Пространственные различия заселенности морских звезд Asterias rubens копеподами Scottomyzon gibberum 99
4.8.5 Распределение копепод Scottomyzon gibberum на поверхности тела морских звезд Asterias rubens и доля копепод в галлах 106
4.9 Обобщение результатов 108
Заключение 114
Выводы 116
Благодарности 117
Список литературы 118
- Организменный уровень биосистем (морфологический подход)
- Симбиотическая ассоциация морских звезд Asterias rubens L. и обитающих на них копепод Scottomyzon gibberum Scott
- Характеристика района сбора материала
- Особенности клеточных элементов целомической жидкости в морских звездах Asterias rubens
Организменный уровень биосистем (морфологический подход)
Широкий интерес проявляется к механизмам влияния окружающей среды на физиологические процессы в живых организмах, что приводит к интенсивному развитию биохимического подхода в оценке состояния окружающей среды. Биохимические индикаторы активности метаболизма важные компоненты, вовлеченные в физиологические процессы жизнедеятельности и репродукции. Белковые структуры, вызывающие изменения скорости физиологических процессов, необходимых для покрытия энергетических потребностей организма, типичные компоненты клеточного ответа на стресс, вызванного влиянием факторов окружающей среды. Биохимические показатели стресса – рецепторы, вследствие воздействия на которые окружающей среды изменяется структура белков. Изменения в концентрации таких компонентов стресса, как прямой результат изменений условий окружающей среды, вызывают изменения в скорости синтеза белков, обмене веществ, что влияет на рост и репродуктивные функции. Таким образом, измерение биохимических показателей стресса или обмена веществ может быть использована как «моментальный снимок» состояния организма во время взятия пробы [5].
Биохимические показатели для оценки состояния окружающей среды впервые использовались для изучения популяций экономически важных рыбных ресурсов [5]. Последующие исследования на рыбах, морских двустворчатых моллюсках и ракообразных в аквакультуре продемонстрировали применимость набора биохимических показателей для определения кормовых условий и метаболической активности (активности ферментов и соотношения РНК и ДНК) сразу после отбора пробы [16,17]. Параллельные исследования привели к открытию экспрессии стресс-индуцируемых молекулярных шаперонов (белки теплового шока и убиквитин) в при экстремальных воздействиях внешней среды. Поскольку эти методы стали широко использоваться, на них обратили внимание морские экологи и экофизиологи, которые впоследствии использовали биохимические показатели стресса и метаболизма при исследовании отношений между организмами и окружающей средой [5].
При цитогенетическом анализе различных организмов была доказана возможность использования содержания микроядер как индикатора степени загрязнения окружающей среды [18–20]. Показана высокая достоверность подобного биохимического скрининга для оценки интегрирующего эффекта антропогенных факторов и для ранжирования отдельных районов по степени экологического неблагополучия.
Проведено сравнительное изучение клеточного и гуморального иммунитета массовых видов водных животных из экологически чистых районов Ругозерской губы Кандалашского залива Белого моря (северной наваги Eleginus navaga Walbaum, беломорской трески Gadus morhua maris-albi Gadidae, обыкновенной съедобной мидии Mytilus edulis L., морской звезды Asterias ruben L.) в норме, при патологии и в условиях техногенного воздействия. Это позволяет точно и быстро определять напряженность иммунитета животных и связывать с состоянием экосистемы. Сравнительный анализ данных в норме, при патологии и техногенном воздействии выявил, что иммунологические и гематологические показатели, наряду с другими характеристиками, могут служить критерием состояния организмов, их популяций и среды обитания в целом. [21]
Корреляции между биохимическими и структурными анализами в культурах клеток и тканей, а также в естественных условиях при антропогенном воздействии привело к развитию концепции биомаркеров воздействия и эффекта генотоксичности и ее хронических проявлений, таких как, например, новообразования наблюдаемые у мальков рыб. Направление современных токсикологических исследований - сопоставление результатов исследований биомаркеров с ответными реакциями на уровне организмов и сообществ. Биомаркеры были применены для оценки сильно загрязненных регионов и исследования масштабных аварий, таких как разливы нефти или промышленные аварии. В течение последних 15-ти лет, в лабораториях широко используются небольшие модели аквариумных рыб, например, оризии (Oryzias latipes Temminck & Schlegel), рыбоки данио (Danio rerio F. Hamilton) , виды рода Xiphophorus, толстоголов (Pimephales promelas Rafinesque), карпозубик (Cyprinodon variegatus Lacpde) для изучения механизмов действия токсикантов на уровне клеток и тканей. Те же организмы могут предоставлять экологическую информацию на более высоких уровнях биологической организации, позволяющую оценивать токсические ответы на для популяций и сообществ [15].
Широко используется микроядерный тест. Микроядра (Мя) образуются при нарушении целостности хромосом в процессе деления. Измерение доли Мя для оценки повреждения хромосом в клетках млекопитающих был впервые предложен в 1975 году [22]. В дальнейшем микроядерный тест расширен на водных позвоночных и беспозвоночных, в том числе рыб и мидий [23,24]. Микроядерный тест на представителях иглокожих был проведен для взрослых Asterina gibbosa Pennant, [25], личинок морских ежей Strongylocentrotus purpuratus Stimpson [26], Hemicentrotus pulcherrimus A. Agassiz, и Clypeaster japonicus Lamarck [27], и в настоящее время успешно реализуется на других видах иглокожих. В работе Саотоми многообещающие результаты оценок действия генотоксинов на эмбриональные стадии [27] могут быть необъективны из-за высокой плотности эмбрионов, которая, вероятно отрицательно влиет на их развитие,. Леаней [25] обнаружил, что в естественных условиях воздействие этилметансульфоната (EMS) на А. gibbosa приводит к значительному увеличению частоты Mя в клетках целомической жидкости. Экспозиции в 100 мг/кг 1-бензо-(а)-пирена приводит к значительному увеличению доли Mя в клетках гаструлы морского ежа [26].
Симбиотическая ассоциация морских звезд Asterias rubens L. и обитающих на них копепод Scottomyzon gibberum Scott
Морские звезды Asterias rubens являясь эвригалинным видом, обитают в условиях широкого диапазона солёности от 18 (по некоторым данным 8 [96]) до 40, в связи с этим солёность может оказывать влияние на клеточные элементы целомической жидкости. Исследования в норвежском фьорде Srfjord [66,71] показали, что концентрации амебоцитов и выделение клетками активных форм кислорода (АФК) в условно чистом районе не зависели от уровней солености, в котором обитали морские звезды. Однако, в загрязненных районах высокая соленость значительно увеличивала эти показатели.
Иглокожие способны адаптироваться к колебаниям солености за счет внутриклеточной осмотической регуляции [71,72]. Меняющиеся концентрации осмолитов в амебоцитах влияет на способность этих клеток на производство АФК. Активные формы кислорода, как полагают, способны уничтожать чужеродные частицы путем прямого действия на них. Также, что они могут оказывать свое разрушительное действие, вызывая осмотический дисбаланс в лизосомах (из-за распределения K+) [114].
При бактериальном заражении в морских звездах, обитающих в условиях низкой солености, выделение ROS значительно выше, что указывает на более сильный иммунный ответ. Возможно, это также связано с тем, что концентрации кадмия в морских звездах из районов низкой солености значительно выше, которые также увеличивают выделение ROS. Так для биоаккумуляции Cd и Pb и доли микроядер в клетках целомической жидкости и ROS показана прямая зависимость от содержаний в окружающей среде [66].
При этом повышение ROS является маркером апоптоза и представляют угрозу целостности амебоцитов, поскольку способны изменить активность макромолекул, таких как ДНК и белки[114].
Отмечено увеличение концентрации амебоцитов в ответ на паразитарные инвазии и считается, частью воспалительного ответа в отношении паразита. После инъекции грамположительных бактерий в целомическую полость увеличивает концентрации клеток только двух субпопуляций амебоцитов, которые являются наиболее активными фагоцитами [66].
Повышенная концентрация амебоцитов наблюдается в морских звёздах в загрязнённых тяжёлыми металлами районах фьорда Srfjord, что может способствовать детоксикации [71].
В качестве объекта исследования выбран симбиоценоз массового литорального вида морских звезд Asterias rubens L. и обитающих на них копепод Scottomyzon gibberum Scott. Распространены по всей территории северных морей России [86].
Морские звезды A. rubens L. распространены на северо-востоке Атлантики на глубинах до 400 метров, иногда до 650 метров. Распределение A. rubens в Белом море тесно связано с распределением моллюсков, служащих ей основной пищей.
Впервые S. gibberum описан для Белого моря А.В Смуровым [4]. Взрослые самки S. gibberum, обитающие на коже морских звезд A. rubens, индуцируют образование галлов. На звездах, радиус которых менее 120 мм, симбионты не найдены. Местом локализации на хозяине являются верхние и боковые части лучей, на дорсальной стороне имагинального диска рачки не встречаются. Личиночные стадии, самцы и молодые самки свободноживущие, и обитают непосредственно на поверхности тела хозяина, как типичные эктосимбионты [115].
Симбионтам для северных морей характерен 1.5-годовой жизненный цикл с гибелью самок в октябре-ноябре [116].В яйцевых мешках наблюдаются зрелые яйца, в течение всего вегетационного периода.
В лабораторных условиях, В.И. Иваненко, описано созревание яиц в яйцевых мешках за 7-6 суток, при температуре воды 10-11 оС, после чего происходил практически одновременный вымет науплиев. В воде науплии линяли не менее трех раз, доходя до стадии копеподита за 8-9 дней, после чего начинался активный поиск и оседание на хозяев [117]. 2.2. Методы сбора материала
Морские звезды A. rubens собирались в полиэтиленовые пакеты в районе Беломорской биологической станции имени Н.А. Перцова, Мурманская область, Россия (66.55359 N, 033.10403 E). Отбирались неповрежденные пятилучевые морские звезды диаметром 66-100 мм.
Морских звезд A. rubens собирали с 6 стационарных точек (табл. 2.1 и рис. 2.1), в течение всего вегетационного периода 2012-2013 годов со средней частотой раз в три недели по 30-40 экземпляров. С 6-ти дополнительных точек был произведен сбор 2-3 раза. Сбор морских звезд проводился в Белом море на акваториях Ругозерской, Чернореченской, Кислой губ и «Бабьего моря». Точки сбора морских звезд представлены на рисунке 2.1.
Для каждой станции определялся тип донного сообщества по доминирующим видам зообентоса и макрофитов (таб. 2.1). Для проведения ковариационного анализа все точки разделены по трем типам биотопов, по характеру грунта и доминирующим макрофитам. Тип биотопа определяет условия обитания морских звезд.
Каждую морскую звезду помещали в индивидуальный пакет. Объем выборки составил 1015 экземпляров. С глубины до двух метров морских звезд собирали сачком, на глубинах 3-8 метров с использованием легкого водолазного снаряжения.
Характеристика района сбора материала
Ковариационный анализ не показывает статистически достоверного влияния солености на долю микроядер в клетках целомической жидкости в течение 10-ти дневного эксперимента.
На клеточном уровне наблюдалась адаптация к воздействию тяжелых металлов, при этом низкая соленость увеличивала токсический эффект металлов. На десятые сутки эксперимента наблюдалась адаптация к воздействию тяжелых металлов. В работе Котеура [71] не выявлено влияние различной солености (22, 25 и 30) на образование микроядер, а токсические эффекты на уровне клеток целомической жидкости связаны с воздействием только металлов. Уменьшение генотоксичности вероятнее всего связано, с накоплением белков способных связывать свободные ионы металлов [72].
В эксперименте отмечается кратковременное увеличение токсичности металлов, выраженное в бактериальном заражении, что связано с совместным действием тяжелых металлов и низкой солености. На 10 сутки эксперимента клеточный иммунный ответ в условиях низкой солености восстанавливается, в амебоцитах обнаруживаются фагоцитированные бактериальные гранулы, при этом отдельные бактерии уже не обнаруживаются [72].
При воздействии тяжелых металлов и резкого понижения солености наблюдаются прямые цитогенетические эффекты (образование микроядер и бактериальное заражение). Далее, при более длительной экспозиции, можно предположить адаптацию, направленную на умещение токсических эффектов металлов за счет клеточных протекторных механизмов, что проявляется в отсутствии различий исследуемых характеристик с контрольными на 10 сутки эксперимента. В целомоцитах обнаружены белки, способные связывать металлы в хелатные комплексы и, далее, эти клетки выводятся через пищеварительную систему и органы выделения, способствуя детоксикации металлов и являясь эффективным инструментом их выведения из органов морских звезд[136][137].
Таким образом, соленость повышает токсичность металлов при кратковременном воздействии в течение адаптации морских звезд к изменившимся условиям, при длительном воздействии влияние солености не наблюдаются.
Изменение поведенческих реакций морских звезд Asterias rubens при воздействии металлов в экспериментальных условиях
Поведенческие реакции отражают ответ целого организма на токсическое воздействие. Результаты измерения скорости переворота при действии раствора смеси металлов представлены на рис. 4.6. Рис. 4.6. Время переворота морских звезд Asterias rubens. По оси абсцисс – значения ИИТ для нормальной и низкой солености на 3-и, 7-е и 10-е сутки эксперимента. При солености 25,7 после трех суток наблюдается увеличение среднего времени переворота морских звезд, на 7-е и 10-е сутки различий во времени переворота не наблюдается. При солености 21 время переворота при увеличении концентраций металлов увеличивается, однако статистически-достоверных отличий не наблюдается.
По скорости переворота на третьи сутки при низкой солености наблюдается проявление токсических эффектов, но далее на уровне целого организма можно отметить адаптацию морских звезд к воздействию ТМ при нормальной и низкой солености.
Выживаемость морских звезд Asterias rubens при воздействии тяжелых металлов
По десять экземпляров морских звезд помещали в аквариумы с морской водой из места обитания и добавленной смесью металлов со значениями ИИТ 0, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, 6400 на третьи и десятые сутки эксперимента. Определялось количество мертвых особей (рис 4.7).
Выживаемость морских звезд Asterias rubens при воздействии смеси тяжелых металлов. ИИТ – значения интегрального индекса токсичности металлов в морской воде; А Выживаемость после 10-суток экспозиции; Б Выживаемость после 3-суток экспозиции. R2=0.97 F(2,5)=117.68, Р 0.00006
Летальные значения ИИТ для воды после десяти суток составляет 4000 (средние значения ИИТ воды для данного региона 300-400 [138]). ЛД50 после трех суток составляет 5800 ИИТ. Высокое значения ИИТ при котором наступает гибель морских звезд позволяет говорить об их устойчивости к воздействию ТМ, что обуславливает распространение в биотопах с высокими уровнями антропогенной нагрузки.
Особенности клеточных элементов целомической жидкости в морских звездах Asterias rubens
В связи с тем, что загрязнение тяжелыми металлами является одним из наиболее актуальных типов загрязнения для побережья Белого моря. В качестве тестируемых параметров выбраны биоаккумуляция и биоконцентрация металлов в теле морских звезд, как возможность оценить биологическую доступность металлов в морской среде, в связи с тем, что большая часть металлов находится в связанном виде и не оказывает влияние на организмы. Металлы обладают различными механизмами связывания и выведения из организма морских звезд, что обуславливает в большинстве случаев, при относительно низких концентрациях, отсутствие прямой связи между их содержанием в среде, биоаккумуляцией и биологическими эффектами. Так по значения фактора биоаккумуляции металлы можно разделить на две группы: накапливающиеся в теле морских звезд, со значениями BAF больше 1 (медь, цинк, кадмий ртуть), и не накапливающиеся, со значениями BAF меньше 1 (марганец, железо, никель, свинец). В экспериментальных условиях биоконцентрация наблюдалась для меди. Эти данные соответствует результатам полученным на морских звездах вдоль побережья Норвегии [67]. Для некоторых металлов (никеля, меди, цинка, свинца и ртути) наблюдается отрицательные значения коэффициента корреляции между содержаниями металлов в теле и донных осадках, что может свидетельствовать о механизмах регуляции и выведения этих металлов из тела морских звезд и их низкой биодоступностью. Для других (марганца, железа и кадмия) показаны положительные значения коэффициентов корреляции, это связанно с возможностью этих металлов связываться с белками в тканях и тем самым аккумулироваться.
Для биоаккумуляции марганца, железа, меди, цинка, никеля и свинца наблюдается отрицательная корреляция с соленостью воды. В экспериментальных условиях статистически достоверного влияния солености на биоконцентрацию не выявлено, однако линии регрессии биоконцентраций металлов в аквариумах с низкой и нормальной соленостью различаются.
По уровням биоаккумуляции при ординационном анализе выделяется Кислая губа. В этом биотопе обитает популяции морских звезд, которая отличается менее ярким красным цветом, запахом и пищевым рационом.
Металлы, накапливаемые в теле морских звезд, влияют и на копепод обитающих на поверхности. Так, ртуть вызывает уменьшения размеров карапакса копепод, в то время как медь увеличение.
Таким образом, для понимания природы симбиотических ассоциаций, взаимодействий в системе «симбионт-хозяин», их места и роли в существовании и динамике сообществ необходимо изучение различных аспектов, включающих трофические и топические взаимодействия, сезонную и пространственную динамику, влияние условий местообитания, защитные механизмы хозяина.
Выбранная для исследований морская звезда Asterias rubens является удобным объектом для задач экологической диагностики и мониторинга, благодаря широкому ареалу распространения, высокой численности, простоте сбора, изученности биологии и экологии этого вида, высокой толерантности к антропогенному воздействию и эвригалинности, что позволяет им обитать в условиях сильно загрязненных морских и эстуарных экосистем. Биологические особенности различных уровней организации морских звезд A. rubens (молекулярно-генетические, клеточные, организменные и ценотические) возможно использовать как биоиндикаторы и биотесты, причем каждый уровень характеризует различную глубину процессов происходящих в морских экосистемах при антропогенном воздействии. Используемые в данной работе биологические особенности симбиотической ассоциации морских звезд A. rubens, характеризуются простотой изучения и относительно низкой себестоимостью получения экологической информации. Химический анализ содержания металлов в теле морских звезд возможно измерять параллельно с анализом донных осадков.
Отдельно следует сказать о проблеме нормирования и интегральной оценки качества морской среды. При оценке результатов химических анализов компонентов морских экосистем встает вопрос о целевых показателях (ПДК и ОБУВ) в морской воде и донных осадках, отсутствие нормативно закреплённых и обоснованных для морской среды значений, усложняет сравнение и интерпретацию результатов. При этом получаемые при интегральной оценке загрязнённости результаты, основанные на существующей в Российской Федерации нормативной базе в сфере морского водопользования нельзя считать адекватными реальной загрязненности морских экосистем, в связи с тем что используемые подходы основаны на разработанных для пресноводных экосистем методах. Поэтому, следует разработать систему нормирования качества морской среды, выбрать целевые показатели для оценки токсичности компонентов морской среды и поступающих в моря загрязняющих веществ, основанные на изученных биологических характеристиках морских организмов и физико-химических особенностей морской среды.
Биологические особенности морских звезд и обитающих на их поверхности копепод возможно использовать как с целью экологической диагностики состояния морских экосистем в качестве биоиндикаторов, так и в качестве тест-объектов при биотестировании токсичности веществ в условиях морской среды, биологические характеристики этой симбиотической ассоциации могут быть добавлены к методам обязательного экологического мониторинга акваторий северных морей.
