Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эколого-физиологические и биохимические аспекты адаптации растений к стрессу 9
1.1. Адаптация растений к избытку тяжёлых металлов в окружающей среде 9
1.1.1. Токсическая роль тяжелых металлов в системе растения - окружающая среда 9
1.1.2. Физиологические механизмы инактивации тяжёлых металлов... 15
1.1.2.1. Задержка ростовых процессов 16
1.1.2.2. Нарушения фотосинтеза и дыхательного метаболизма 18
1.1.2.3. Действие на системы ионного транспорта 22
1.1.2.4. Воздействие на липиды 23
1.1.2.5. Изменение активности ферментов 25
1.1.2.6. Образование комплексующих агентов 28
1.1.2.7. Биологическая роль пролина при стрессе 29
1.1.2.8. Роль корней в формировании механизма устойчивости растений к тяжелым металлам 31
1.1.3. Классификация и специфичность растений по металлоустой-чивости 33
1.2. Адаптация растений к изменяющимся условиям среды (недостаток элементов минерального питания растений) 35
1.3. Энергетические аспекты адаптации растений 36
1.3.1. Интенсивность процессов фотосинтеза и дыхания при изменении условий среды 36
1.3.2. Функциональные составляющие дыхательного газообмена растения 41
1.3.3, Соотношение альтернативных биохимических путей дыхательного обмена растений 47
Глава 2. Объекты и методы проведения исследований 56
2.1. Объекты исследований 56
2.2. Условия выращивания растений 56
2.3. Морфофизиологические характеристики и параметры продуктивности 58
2.4. Определение интенсивности дыхания и активности альтернативных терминальных путей дыхательного обмена 60
2.5. Метод специфических ингибиторов путей дыхательного обмена 64
2.6. Определение активности пероксидазы и каталазы 65
2.6.1. Определение активности гваяколпероксидазы 65
2.6.2. Определение активности каталазы 66
2.7. Определение содержания малонового диальдегида 67
2.8. Определение накопления пролина 67
2.9. Определение содержания металлов 68
Глава 3. Общность и поливариантность механизмов устойчивости растений при стрессе 70
3.1. Формирование адаптации к повышенному содержанию цинка 70
3.1.1. Характеристика морфофизиологических параметров у растений, выращенных в условиях избыточного содержания цинка 70
3.1.2. Интенсивность темнового дыхания и энергетические затраты у растений, выращенных в условиях избыточного содержания цинка... 76
3.1.3. Соотношение путей дыхательного обмена у растений, выращенных в условиях избыточного содержания цинка 79
3.2. Формирование адаптации к повышенному содержанию меди 86
3.2.1. Характеристика морфофизиологических параметров у растений, выращенных в условиях избыточного содержания меди 86
3.2.2. Интенсивность темнового дыхания и энергетические затраты у растений, выращенных в условиях избыточного содержания меди 90
3.2.3. Соотношение путей дыхательного обмена у растений, выращенных в условиях избыточного содержания меди 92
3.3. Формирование адаптации при дефиците элементов минерального питания 96
3.3.1. Характеристика морфофизиологических параметров у растений в разных условиях минерального питания 96
3.3.2. Интенсивность темнового дыхания и энергетические затраты у растений в разных условиях минерального питания 100
3.3.3. Соотношение путей дыхательного обмена у растений, выращенных в условиях дефицита элементов минерального питания 102
3.4. Антиоксидантная система в структуре адаптации к избытку тяжелых металлов 106
3.4.1. Антиоксидантная система в структуре адаптации к избытку цинка 106
3.4.1.1. Изменение ростовых показателей у растений, выращенных в условиях избыточного содержания цинка 106
3.4.1.2. Влияние цинка на активность пероксидазы и каталазы... 106
3.4.1.3. Влияние цинка на процессы перекисного окисления липидов и накопление свободного пролина 107
3.4.1.4. Содержание цинка в побегах и корнях растений, выращенных в условиях избыточного содержания его в среде 108
3.4.2. Антиоксидантная система в структуре адаптации к избытку меди 110
3.4.2.1. Изменение ростовых показателей у растений, выращенных в условиях избыточного содержания меди 110
3.4.2.2. Влияние меди на активность пероксидазы и каталазы..,. 110
3.4.2.3. Влияние меди на процессы перекисного окисления ли- ПО пидов и накопления свободного пролина исследуемыми растениями 110
3.4.2.4. Содержание меди в побегах и корнях растений, выращенных в условиях избыточного содержания его в среде 111
Заключение 113
Выводы 118
Литература 120
Приложение 158
- Адаптация растений к избытку тяжёлых металлов в окружающей среде
- Объекты исследований
- Формирование адаптации к повышенному содержанию цинка
Введение к работе
Актуальность темы. Соли металлов в окружающей среде являются мощным экологическим фактором, оказывающим влияние на физиолого-биохимические процессы в растительных организмах. Как избыток, так и недостаток многих макро - и микроэлементов может вызывать целый ряд негативных процессов, таких как нарушение дыхания, фотосинтеза, фиксации и ассимиляции некоторых главных питательных веществ (Ильин, 1985; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989; Демидчик и др., 2001; Singh et al., 2005).
Общей реакцией живых систем на отклонение условий среды от оптимальных является активизация адаптивных механизмов к изменившимся условиям. Ранее было показано, что для каждого вида растений вырабатываются характерные механизмы устойчивости, представляющие комплекс морфо-физиологических и биохимических приспособлений, через которые реализуется адаптивная стратегия (Grime, 1988; Миркин, 1999; Усманов и др., 1990, 2001; Рахманкулова и др., 2001). Известно, что от эффективности использования растением материально-энергетических ресурсов зависит успех адаптации растений (Жученко, 1988; Усманов, 1987), Однако оценка энергетической эффективности таких затрат представляет собой сложную задачу (Се-михатова, 1998; Рахманкулова, 2001). При изменении условий среды может происходить смена соотношений альтернативных путей дыхательного метаболизма (Шугаев, 1999; Меденцев и др., 1999; Федяев, 2002). Изменение направления и величины соотношений альтернативных путей дыхательного метаболизма характеризует энергетическую эффективность трат на адаптацию (Рахманкулова и др., 2003).
Одним из главных проявлений токсического действия избытка тяжёлых металлов (ТМ) является окислительный стресс (Prasad et al., 1999; Cli-jsters et al., 1999; Cuypers et al., 1999; Schutzendubel, Polle, 2002). Возникающие при стрессе активные формы кислорода (АФК) изменяют активность эн-зиматических антиоксидантных защитных систем (Chen et al., 2000; Ванюшин, 2001; Malecka et al., 2001; Erdei et al., 2002; Wang et al., 2004). Имеются
данные об увеличении степени вовлечённости альтернативной оксидазы в дыхание при стрессе, что препятствует накоплению активных форм кислорода (АФК) (Шугаев, 1999; Maxwell et al., 1999).
Цели и задачи исследования. Цель исследования состояла в выяснении особенностей формирования адаптации представителями разных видов растений при стрессе (избыток цинка и меди, дефицит элементов минерального питания).
Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:
Исследование морфометрических параметров растений видов ТгШ-cum aestivum L., Zea mays L., Dactylis glomerata L., Leonurus quinquelobatus Gilib., и растений в пределах одного вида Calendula officinalis L. на примере трех сортов: Кальта, Каблуна Голд и Калифорнийская в изменяющихся условиях (избыток цинка и меди, дефицит элементов минерального питания). .
Изучение реализации в данных условиях адаптационного потенциала исследуемых растений на уровне энергетических параметров.
Исследование включения адаптационных защитных механизмов на уровне биохимических процессов у растений Т. aestivum и Z mays.
Научная новизна работы. Впервые у представителей разных видов растений проведен сравнительный анализ соотношения дыхательных путей в условиях стресса (повышенного содержания цинка, меди и дефицита элементов минерального питания). Изучены пути формирования стресс - индуцированного адаптационного ответа растений на уровне морфофизиологических и биохимических параметров.
Теоретическое значение. Материалы диссертационного исследования дополняют и расширяют современное понимание механизмов, лежащих в основе развития устойчивости растений.
Практическое значение. На основании данных могут быть выработаны рекомендации при выращивании растений на территориях загрязнённых тя-
жёлыми металлами. Полученные в работе материалы могут быть использованы при чтении лекций по общему курсу экологической физиологии растений и спецкурсам.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых «Проблемы физиологии растений и генетики на рубеже третьего тысячелетия» (2000, Киев), научной конференции по научно-техническим программам Минобразования России (Уфа, 2000), 5-ой Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 2001), годичном собрании Общества физиологов растений России «Экспериментальная биология растений 2001» (Уфа, 2001), 4-ом международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001), международной конференции по экологической физиологии растений «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке» (Сыктывкар, 2001), международном симпозиуме «Растение под влиянием стресса», (Москва, 2001), VI международном симпозиуме «Ионы металлов и растения» (Санкт-Петербург, 2002), 13-ом конгрессе FESPP (Греция, 2002), 21-ом конгрессе Scandinavian Plant Physiology Society (Дания, 2003), 5-ом международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2003), 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2003), 5-ом Съезде Всероссийского общества физиологов растений, международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехноло-гии», (Пенза, 2003), Региональной научно-практической конференции «Технология выращивания и использование лекарственных культур», (Уфа, 2003), XI международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2004», (Москва, 2004), Всероссийской конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы экологии и охраны окружающей среды», (Уфа, 2004), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006», (Москва, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 работы.
Адаптация растений к избытку тяжёлых металлов в окружающей среде
К экстремальным факторам, способным вызвать повреждения растительных организмов, следует отнести загрязнение окружающей среды ТМ. К ТМ относят химические элементы с атомной массой более 40 у.е или более 50 у.е, обладающие свойствами металлов и металлоидов (Прохорова, 1998). В литературе имеется множество различных классификаций ТМ, в основе которых лежит их физиологическая роль, биохимическое поведение, степень биологического поглощения, токсичность для живых организмов (Ильин, 1991; Wood, 1974). К наиболее токсичным отнесены Be, Со, Ni, Си, Zn, Sn, As, Se, Pb, Cd, Hg, Ті, Sb, Ft и Ag (Wood, 1974, Кабата - Пендиас, Пендиас, 1989). Условно выделяют два источника поступления ТМ в окружающую среду: природные и техногенные. Из природных наибольшее значение имеют выветривание горных пород и минералов, эрозия почв, вулканическая деятельность, высокие естественные уровни содержания ТМ (Глазовская, 1992; Ковальский, 1981; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Наиболее мощный поток ТМ в среду обеспечивает антропогенный фактор (Добровольский, 1980; Алексеев, 1987; Зимаков и др., 1990): развитие металлургических, угледобывающих и энергетических мощностей (Hutchinson et al., 1974; Ягодин, 1990: Ильин, 1991; Барахтенова, 1993), продукты сжигания топлива (Lagerwerft, 1970; Никифорова, 1981; Берзиня, 1980), использование сточных вод (Гармаш и др., 1985; Chang et al., 1999), а также систематическое применение больших доз удобрений (Минеев, 1990; Басманов и др., 1990; Ягодин и др., 1989; Вредные химические..., 1988). По данным С. Patterson (1971), интенсивность вовлечения в биохимический круговорот соединений ТМ из техногенных источников в среднем в 100 раз выше, чем из природных. Рекультивация загрязненных ТМ земель осуществляется разнообразными способами: выщелачивание легкоподвижных элементов и перевод их в трудноподвижные формы, снятие верхнего загрязненного слоя, перемешивание с незагрязненным грунтом, и т.д. В последнее время широкий интерес в развитых и развивающихся странах вызывает использование растений-сверхнакопителей для восстановления экосистем загрязненных металлами (Yanqun et al., 2004; РІІоп-Smits, Pilon, 2002), а также для добычи полезных ископаемых с их помощью (Baker et al., 2000; Ma et al., 2001; Markert, 2003). Поэтому поиск и исследование таких растений ведется во всем мире (Datta, Sarkar, 2004; Холодова и др., 2005). Среди важнейших видов растений, используемых для восстановления окружающей среды находятся Amarantus retroflexus, Azolla pin-nata, Brassica canola, B. Juncea (Прасад, 2003; Gleba et al., 1999), Car-damonopsis hallerii (Прасад, 2003; Dahmani-Muller et al., 2001; Cosio et al., 2004), Helianthus annus, Salix sp., Atriplex prostrata (Прасад, 2003), A. halimus L. (Lutts et al., 2004), Thlaspi caerulescens (Gleba et al., 1999; Cosio et al., 2004), Holcus lanatus (Rengel, 2000), и др.
Известно, что растения более устойчивы к повышенным концентрациям элементов, нежели к пониженным. Благодаря различным морфологическим и физиологическим свойствам высшие растения способны адаптироваться к неблагоприятным факторам (Cheng, 2003). При этом химический состав растений может меняться без проявления явно видимых повреждений (Barazani et al., 2004; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Видимые симптомы токсичности различны между видами и внутри одного вида, однако общими, малоспецифичными симптомами являются торможение роста, хлорозные или бурые точки на листьях, нарушение водного обмена, чахлые, уродливые корни (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989; Школьник, Алексеева-Попова, 1983; Барсукова, 1997). Установлено, что при повышении уровней загрязнения биотопов у особей одуванчика уменьшаются длина и масса семянок, параллельно возрастают доля недоразвитых семянок и семенная продуктивность
(Савинов, 1998). У двух форм Taraxacum officinalis L. выявлены разные стратегии адаптации. В условиях максимального загрязнения Т. dahlstedtii продуцирует более жизнеспособные семена, чем Г. pectinatiforme, однако семенная генерация последней обладает более высоким индексом металлоустойчиво-сти, что позволяет двум формам существовать в пределах одной ценопопуля-ции (Жуйкова и др., 1999). Исследование метаболических изменений в организме сосны обыкновенной в зоне действия слабых доз атмосферных выбросов также показало, что изменения носят защитно-приспособительный характер, свидетельствующий о снижении содержания поллютантов в ассимиляционных тканях хвои путем аккумуляции их в метаболически инертных зонах (ретидиум); увеличивалось содержание веществ, обладающих протекторными свойствами, возрастали барьерные функции покровных тканей (Брянцева и др., 1993).
Хорошо известно, что медь, цинк, и другие металлы являются необходимыми микроэлементами для растений (Shier, 1994; Welch, 1995; Reeves, Baker, 2000), и становятся токсичными при высоких их концентрациях в окружающей среде (Алексеев, 1987; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989; Marschner, 1995; Monni et al., 2000; Blaylock, Huang, 2000; Rout, Das, 2003). О токсичном действии металлов в растении докладывалось различными авторами (Foy et al, 1978; Демидчик, Соколик, 2001; Rout, Das, 2003 и др.). Действие металлов на растительный организм начинается с поступления в клетку, и в дальнейшем может проявляться на разных уровнях организации. В основе их токсического влияния лежат нарушения различных звеньев обмена, вследствие денатурирующего действия ТМ на метаболически важные белки, а также конкуренция с другими элементами минерального питания (Школьник, Алексеева-Попова, 1983).
Объекты исследований
Для проведения исследований были созданы полуконтролируемые условия. Опыты проводились в течение всего года в лабораторных условиях.
Растения пшеницы и кукурузы выращивали в условиях водной культуры, все остальные объекты - в условиях песчаной культуры. Исследуемые растения выращивались в вегетационных сосудах на светоплощадке: освещенность 15 кЛк, светопериод 14 часов. Средняя температура воздуха составляла 25 ±6 С, влажность воздуха 40 - 60 %.
Поскольку растения кукурузы, пшеницы, ежи и пустырника выращивали в течение 50 суток, растения календулы - до возраста 75 суток, а также данные объекты отличались по скорости накопления биомассы, то при выращивании первой группы растений мы использовали 0,5 - нормальный раствор Хогланда - Арнона (Х-А), для растений календулы -1 - нормальный состав X - А (Гродзинский, Гродзинский, 1973).
При выращивании растений в условиях водной культуры семена первоначально проращивали в термостате при температуре 30 С. После начала прорастания, семена с одинаково развитыми корнями переносили на стеклянные плотики.
В случае с песчаной культурой семена высеивали сразу на песок. Перед использованием песок просеивали, оставляя частицы диаметром 2 -4 мм, многократно промывали водопроводной водой, далее промывали дистиллированной водой и высушивали при температуре 200С. На каждый сосуд помещали по 5 кг сухого песка. На седьмые сутки с момента прорастания семян вносили раствор минеральных солей.
Для изучения влияния ТМ при выращивании пшеницы и кукурузы использовали 1,5 кратное превышение ориентировочно допустимой концентрации (ОДК) Zn (1,2 10"3 М) и предельно допустимой концентрации (ПДК) Си (7,08"10 5М); при выращивании календулы в опытном варианте использовали 3-х кратное превышение ОДК Zn и Си (2,4 10"3 М и 1,5 10 3 М, соответственно) (Основные правовые, нормативные,... Дополнение №1... 1994). Предельно допустимая концентрация - это максимальное содержание загрязняющего почву химического вещества, не вызывающее прямого или косвенного негативного влияния, включая отдаленные последствия на окружающую среду и здоровье человека, а также не приводящее к накоплению токсичных элементов в сельскохозяйственных культурах. Ориентировочно допустимые количества (концентрации) загрязняющих веществ позволяют получить более полную характеристику о загрязнении почв тяжёлыми металлами, так как учитывают уровень реакции среды и гранулометрический состав почвы. В наших исследованиях подбор концентраций цинка и меди осуществлялся в зависимости от степени токсичности ТМ и способа выращивания (условия водной или песчаной культуры). Выбор более высоких концентраций ТМ для календулы обусловлен также тем, что данные растения потенциально устойчивы к действию цинка и меди вследствие способности к накоплению данных элементов без видимого ущерба для развития (Исмагилов, Костылев, 2000).
Для экспериментов по созданию дефицита элементов минерального питания растения выращивали на растворе 10 "4М CaS04.
С целью предотвращения значительного загущения посевов, а также для размещения на одинаковых площадях разных вариантов опытов приблизительно одного количества растений предварительно были определены нормы высева семян.
Измерение морфофизиологических и биохимических параметров начинали со 2-ой недели от момента замачивания семян до 11-ой недели.
2.3. Морфофизиологические характеристики и параметры продуктивности
В ходе исследований первоначально измеряли морфометрические параметры: а) сырую массу побега (W sh) и корня (W г),
б) сухую массу побега (W ± &) и корня (W j. г),
в) длину побега и корня;
Сухую массу определяли после сушки частей растений до воздушно сухого состояния при 90С в течение 12 часов.
Формирование адаптации к повышенному содержанию цинка
Растения являются чуткими индикаторами геохимической среды. При этом рост растения является интегральной характеристикой отражающей степень адаптации растения к условиям окружающей среды (Барсукова, 1997).
В зависимости от условий выращивания ткани растений значительно отличались по степени оводнённости, поэтому расчет и обсуждение параметров проводился на основе значений сухой массы растений.
Ингибирование роста является общим проявлением для растений, связанным с токсичностью цинка (Collins, 1981). При выращивании растений в неблагоприятных условиях наблюдались значительные различия в чувствительности к избытку цинка, что в результате сказывалось на накоплении биомассы. Различия в накоплении растениями сухой массы представлены на рисунке 3.1.
В контрольных условиях в течение всего эксперимента масса 28 - ми дневных (фаза третьего листа) растений Z mays превосходила массу растений Т. aestivum, что вероятно обусловлено их принадлежностью к разным типам фотосинтетического метаболизма (Сз - и С4 - типам, соответственно). Известно, что у С4-растений ассимиляция С02 выше, чем у растений с С3 типом метаболизма (Полевой, 1989). Среди 60-ти дневных всходов контрольных растений календулы высокопродуктивным оказался сорт Калифорнийская (рис. З.1.).
В условиях стресса, при 1,5 кратном ОДК цинка в среде у растений кукурузы произошло снижение накопления массы в 2 раза; пшеницы и календулы сорта Калифорнийская в 1,6 раз, Кальта - в 1,5 раза, а у сорта Каблуна Голд наблюдалось увеличение накопления массы в 1,5 раза. Индекс устойчивости растений Т. aestivum имел значение 0,7 ± 0,02, Z mays L. - 0,5 ± 0,007, растений календулы сорта Кальта - 0,65 ± 0,07, Каблуна Голд -1,3, и сорта Калифорнийская - 0,64± 0,03.
Относительная скорость роста (RGR) является одним из главных критериев экологических адаптивных стратегий (Grime, 1979; 1988), который косвенно отражает комплексную систему устойчивости данного растения к конкретному виду стресса (Усманов, 1987). RGR является динамической характеристикой процесса использования накопленной биомассы на создание новых структур растения. У всех исследуемых объектов, кроме сорта Каблуна Голд, при изменении условий выращивания наблюдалось снижение параметра RGR (рис. 3.2.).
В оптимальных условиях 28-ми дневные растения пшеницы характеризовались меньшей относительной скоростью роста по сравнению с кукурузой, имеющей наибольшее значение RGR, что вероятно обусловлено различиями в метаболизме данных растений (рис. 3.2.). При 1,5 кратном ОДК Zn в среде растения кукурузы снизили RGR в 9 раз; пшеницы - в 4 раза, проявив
себя как более устойчивый по сравнению с кукурузой вид к данному типу стресса. Среди 60-ти дневных контрольных растений вида С. officinalis сорт Кальта имел более высокое значение RGR. При выращивании растений в условиях 3-х кратного превышения ОДК Zn у сортов Кальта и Калифорнийская происходило снижение RGR в 1,7 раз (рис. 3.2.); у сорта Каблуна Голд наблюдалось увеличение RGR в 1,2 раза.
