Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Древесина как субстрат для биотрансформации 10
1.2. Направления использования гидролизного лигнина 11
1.2.1. Применение гидролизного лигнина в промышленности 11
1.2.2. Использование гидролизного лигнина в сельском хозяйстве 13
1.3. Процессы, происходящие при компостировании, и оценка зрелости конечного продукта 18
1.3.1. Абиотические параметры компостирования 19
1.3.2. Микробиологические параметры компостирования 24
1.4. Ферменты, участвующие в разложении древесных материалов 27
1.4.1. Гидролазы 28
1.4.2. Оксидоредуктазы 29
1.5. Индикация степени зрелости компоста 33
1.6. Компостирование лигноцеллюлозных отходов 37
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
ГЛАВА 3. ДЕГРАДАЦИОННАЯ СУКЦЕССИЯ ПРИ КОМПОСТИРОВАНИИ ГИДРОЛИЗНОГО ЛИГНИНА И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОНЕЧНОГО ПРОДУКТА 56
3.1 Параметры компостирования и оценка зрелости компоста 57
3.2 Продуктивность агроценозов при использовании лигнокомпостов 68
ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПОНЕНТОВ ЛИГНОКОМПОСТА 78
4.1. Биологическая активность химических компонентов лигнокомпоста 79
4.2 Биологическая активность культуральных фильтратов микроорганизмов, используемых в закваске 90
ГЛАВА 5. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПИОНЕРНЫХ ШТАММОВ ГРИБОВ - КОЛОНИЗАТОРОВ ДРЕВЕСНЫХ ОТХОДОВ ДЛЯ КОМПОСТИРОВАНИЯ ГИДРОЛИЗНОГО ЛИГНИНА 106
ГЛАВА 6. КОМПОСТИРОВАНИЕ ОПИЛОК: СКРИНИНГ КУЛЬТУР И ИХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 116
ВЫВОДЫ 128
ФАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 130
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
- Применение гидролизного лигнина в промышленности
- ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Параметры компостирования и оценка зрелости компоста
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Россия является одной из ведущих стран по объему заготавливаемой древесины. Масса древесной зелени спелых древостоев составляет в России свыше 3 млрд. т, из которых 30,4 млн. т являются экономически доступными [1]. Только в Восточной Сибири ежегодно вырубается около 16 млн. м3 спелой древесины (преимущественно сосны), которая используется лесоперерабатывающей, целлюлозно-бумажной и гидролизной промышленностью или экспортируется. При существующих способах переработки древесного сырья в целом по России полезно используется около половины, а в сибирском регионе лишь третья часть биомассы дерева. Основные потери приходятся на древесную зелень (лесосечные отходы), кору (отходы деревопереработки), опилки и стружки (отходы лесопиления), гидролизный лигнин (ГЛ) (отходы гидролизного производства). Объем отходов в стране чрезвычайно велик. Например, на полигонах гидролизных заводов только Иркутской области находится свыше 2 млн. т ГЛ [2].
Необходимость утилизации отходов лесоперерабатывающей промышленности является одной из важнейших экологических проблем Сибири. К настоящему времени разработаны многие технологии переработки различных видов древесного сырья. Среди них - и весьма эффективные, базирующиеся на глубокой переработке древесных отходов. Однако их внедрение хотя и предполагает значительный экономический эффект, требует больших капитальных и эксплутационных затрат, квалифицированных кадров, сложного оборудования. Например, химическая переработка древесных отходов может утилизировать лишь 25-30% от их общего количества [3]. Большая же часть отходов размещается на свалках, которые занимают значительные площади. Это приводит к пожароопасным ситуациям, т.к. все древесные отходы способны самовозгораться. С целью снижения антропогенного
5 прессинга на территории, окружающие лесоперерабатывающие предприятия, наиболее экологически оправданным способом утилизации древесных отходов является использование их в качестве удобрения. Однако образующиеся при биодеструкции токсичные вещества не позволяют использовать непосредственно древесные отходы. Необходима длительная их переработка, обогащение доступными для растения питательными элементами, чтобы из отхода производства они превратились в ценное органическое удобрение. Самостоятельное разложение отходов де-ревопереработки растягивается на десятилетия, поскольку лигноцеллюлозные материалы устойчивы к микробной биодеградации и требуют заселения комплексом специфических высокоактивных микроорганизмов.
В литературе имеется значительное количество работ, посвященных биоконверсии лигноцеллюлозных субстратов с целью создания средозащитных технологий их утилизации [4], однако экологические аспекты происходящих при этом процессов практически не освещены.
В ИрИХ СО РАН разработан перспективно отличающийся от предложенных ранее способ ускоренного компостирования ГЛ с минеральными добавками при активном участии специально составленной микробной ассоциации, участвующей в биотрансформации и гумификации исходного субстрата [5]. Показана его эффективность для повышения урожайности сельскохозяйственных растений. В то же время остались не решенными вопросы, касающиеся возможности управления процессом компостирования, вклада компонентов компоста и микроорганизмов закваски в общий эффект удобрения, оценки перспективы расширения сферы исходных субстратов.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы - изучение микробиологических и биохимических процессов, происходящих при компостировании древесных отходов (гидролизно-
го лигнина и древесных опилок), и исследование биологической активности готового продукта и его компонентов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
исследовать изменения микробиологического состава созревающего компоста и найти достоверные методы контроля его готовности;
выявить взаимосвязь происходящих в созревающем компосте микробиологических и биохимических процессов с агрохимическими показателями удобрения;
изучить действие компоста, полученного в результате биоконверсии ГЛ, на урожай сельскохозяйственных культур;
выявить действующее начало удобрения на основе ГЛ, оценить влияние различных его компонентов на микроорганизмы и ферменты почвы, а также на рост и развитие сельскохозяйственных культур;
определить ферментативную активность грибов, выделенных из ГЛ, и их потенциал для биодеградации ГЛ по способности утилизировать модельные соединения лигнина;
провести скрининг микроорганизмов, обладающих высокой активностью при разложении опилок;
изучить фитогормоны, образуемые грибами - агентами компостирования, определить их физиологическую активность по отношению к сельскохозяйственным растениям.
Научная новизна работы.
Исследована микробная сукцессия, принимающая участие в компостировании гидролизного лигнина. Впервые для энзимоиндикации зрелости компоста использовано определение активности оксидоредуктаз.
Выделены новые перспективные культуры для деструкции ГЛ, отличающиеся высокой скоростью утилизации модельных соединений лигнина и Мп-пероксидазной активностью.
Проведен скрининг дереворазрушающих микроорганизмов и создана их ассоциация, способная компостировать опилки.
Выявлен вклад отдельных компонентов компоста и микроорганизмов закваски в биологическую активность готового продукта. Впервые исследован фито-гормональный потенциал дереворазрушающих грибов - агентов компостирования.
Практическая значимость работы.
Изучены экологические аспекты биотрансформации ГЛ в удобрение и применения его в сельскохозяйственной практике.
Разработан метод энзимоиндикации зрелости лигнокомпостов.
В полевых испытаниях показана эффективность лигнокомпоста для повышения урожайности зерновых культур и картофеля.
Создана ассоциация дереворазрушающих микроорганизмов, которая рекомендована для компостирования древесных опилок.
Среди дереворазрушающих грибов были выделены продуценты фитогормо-нов растений, показано действие их культуральных фильтратов на рост и развитие сельскохозяйственных растений.
Апробация работы.
Работа докладывалась и обсуждалась на региональных и международных конференциях «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002), на международной конференции «Микробиология и биотехнология XXI столетия» (Минск, 2002), на международной конференции «Закон Российской федерации «Об охране озере Байкал» как фактор устойчивого развития Байкальского региона» (Иркутск, 2003), на
конференции «Экологические проблемы промышленных регионов» (Екатеринбург, 2003), на международной научно-практической конференции «Химия - XXI век: новые технологии, новые продукты» (Кемерово, 2003,2004), на международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2004), на межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), на II Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2005), на 4 международном конгрессе по управлению отходами ВэйстТэк-2005 (Москва, 2005), на международной школе молодых ученых и специалистов «Перспективные технологии для современного сельскохозяйственного производства» (Курск, 2005), на III Всероссийской научной молодежной конференции «Под знаком Сигма» (Омск, 2005), на международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск - Раков, 2006).
Работа выполнена в соответствии с планом НИР Иркутского института химии им. А. Е. Фаворского СО РАН по теме: «Развитие химии и глубокой переработки древесины: получение новых биологически активных и технически ценных продуктов для медицины, сельского хозяйства и критических технологий» (№ государственной регистрации 0120.0 46380) и при финансовой поддержке РФФИ (грант №05-04-97-269).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
9 Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 151 страницах, содержит 25 рисунков и 29 таблиц. Список литературы включает 218 источников, из них 100 работ зарубежных авторов.
Применение гидролизного лигнина в промышленности
Существует множество путей утилизации ГЛ. В натуральном или подсушенном виде ГЛ применяется в производстве ферросплавов как заменитель коксового орешка, кристаллического кремния и алюминиево-кремниевых сплавов в качестве заменителя древесного и каменного угля, нефтяного кокса [13]. Использование ГЛ в качестве наполнителя в поливинилхлоридных композициях позволило снизить горючесть полимерных систем [14]. Замена кремнеземистого компонента в газобетоне неавтоклавного твердения ГЛ или древесными опилками способствует увеличению прочности образцов на 15-20 % [15]. Модифицированные же лигно-фенолами полиуретановые клеи обладают большей прочностью, нежели немоди-фицированные [16]. Особый интерес представляет использование ГЛ для синтеза жидких резольных лигнинсодержащих фенолформальдегидных смол, что позволяет снизить себестоимость готовой продукции без ухудшения ее качества [17].
Высокая поглотительная способность ГЛ обуславливает его хорошие сорбци-онные свойства. Например, в ИрИХ СО РАН на основе лигнина путем его термической и химической обработки получены эффективные, доступные и экологически безопасные сорбенты типа «активных углей» широкого спектра действия, способные практически количественно извлекать ртуть, золото, палладий и платину из водных растворов малой концентрации в широком интервале кислотности среды, а также неионогенные и анионные ПАВ [18]. Был предложен биопрепарат для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, состоящий из торфа, древесных опилок, навоза крупного рогатого скота, лигнина и птичьего помета [19]. Высокую эффективность препарата обеспечивает наличие микроорганизмов-деструкторов Pseudomonas putida, Rhodococcus ruber, Trichoderma citriniviride, Metarrihizium ani-sopliae. В настоящее время в медицине активно применяется энтеросорбент на основе ГЛ - препарат «Полифепан», а также разрабатываются новые фармакологические продукты. Например, запатентован лекарственный композиционный энтеросорбент повышенной адсорбционной способности, содержащий ГЛ, МКЦ, пектин и высокодисперсный диоксид кремния [20].
Существуют композитные материалы, включающие в состав ГЛ. Так, был предложен новый материал для создания пленок, плиток и ДСП, на 80-99 % состоящий из пористого или волокнистого материала (целлюлозы, ГЛ, древесных опилок) [21]. Наличие многочисленных вариантов утилизации лигнина является первым признаком отсутствия кардинального и всеобъемлющего решения проблемы [22].
Использование гидролизного лигнина в сельском хозяйстве При современной интенсивной системе земледелия очень остро встает проблема повышения плодородия почвы, обеспечения положительного баланса элементов питания и органического вещества. В последние годы резко сократилось внесение на поля удобрений. По данным счетной палаты РФ внесение органических удобрений составляет 6-7 % от научно обоснованной потребности [23]. Следствием этого стало снижение урожайности сельскохозяйственных культур и ухудшение качества продукции. Только для покрытия дефицита гумуса необходимо внести в почву свыше 800 млн. т органических удобрений [24]. Обычной практикой стало внесение только лишь минеральных удобрений, что приводит к дополнительным потерям гумуса из-за повышения активности почвенной микрофлоры, которая, при недостатке свежего органического вещества и достаточном количестве азота, удовлетворяет потребность в углероде преимущественно за счет разложения гумуса [25]. Положительный баланс органического вещества в почве дает только комплексное применение минеральных и органических удобрений, либо органоминеральных [26].
Привлекательно использование в виде органических удобрений нативных или модифицированных древесных отходов, не востребованных другими областями переработки. Рациональность этого пути заключается в том, что лигнин при переработке в удобрение частично превращается в гуминовые кислоты, составляющие основу гумуса почвы [27], следовательно, внесение лигнина в почву позволит вернуть ей утраченные в севообороте запасы гумуса, не нарушив сложившейся агро-экосистемы.
Основными положительными свойствами ГЛ, определяющими его ценность в качестве органического удобрения, является высокое содержание углерода и гу 14 мусообразующий потенциал, благоприятные физико-химические свойства, высокая сорбционная способность. В 1 т лигнина содержится 0.5 кг азота (в том числе 0.2 кг аммиачного), фосфор и калий практически отсутствуют. Таким образом, по своим агрохимическим свойствам лигнин приближается к верховому торфу [28], но, в отличие от последнего, в лигнине содержатся остаточные сахара (10-12 %) и ростовые вещества.
Существует несколько вариантов использования ГЛ. Наиболее простым представляется внесение в почву немодифицированного ГЛ, что улучшает ее структуру и увеличивает поглотительную способность [29]. Внесение лигнина способствует уменьшению объемной массы тяжелосуглинистых каштановых почв, что немаловажно для улучшения физико-химических свойств слабогумусированных, нередко засоленных почв в орошаемом земледелии. Вследствие своей большой вла-гоемкости ГЛ используется для понижения уровня грунтовых вод пахотного слоя, что было показано в условиях Архангельской области [30]. Применение лигнина уменьшает коркообразование на почве, повышает среднесуточную сумму эффективных температур. За вегетационный период на севере эта прибавка составляет 15-20%, поэтому урожай сельскохозяйственных культур созревает на 6-8 дней раньше, чем без использования ГЛ [31].
При всех своих достоинствах ГЛ обладает рядом существенных недостатков. Низкий уровень рН (1.5-3.0) приводит к подкислению почвы и грунтовых вод, что оказывает негативный эффект на наиболее чувствительные к подкислению почвы культуры. Так, внесение лигнина под кукурузу отрицательно влияло на ее рост, развитие и снижало урожайность на 10-15 % по сравнению с контролем [32].
Объекты и методы исследования
Исходным материалом для приготовления удобрения служил ГЛ, взятый сразу после стадии гидролиза древесины (Зиминский гидролизный завод Состав ГЛ (%): целлюлоза - 10.1, лигнин - 62.1, зола - 5.4, влажность - 75, рНвоД. 2.8, рНксі 2.55. При компостировании на 3 т ГЛ вносили 36 кг извести, 27 кг аммофоса, 21 кг калия хлористого, 75 кг сульфата аммония и 50 кг закваски [163].
В состав закваски входили Trichosporon cutaneum (beigelii) D-46, T.cutaneum 5, Streptomyces asterosporus, предоставленные чл.-корр. HAH Беларуси Э.И. Коло-миец, институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск, Penicillum citreo-viride, Cephalosporium (Acremonium) sp., Phanerochaete chrysosporium Burds. 1 MR-1, предоставленные д.б.н. Тен Хак Муном, институт водных и экологических проблем ДВО РАН, г. Хабаровск. Культуры выращивали на жидких средах в течение 5 суток {T.cutaneum - на среде для дрожжеподобных грибов [164], S.asterosporus - на среде для лигнинолитических актиномицетов [165], P.citreo-viride, Cephalosporium sp. - на среде Кирка для грибов [166]).
Компостируемую смесь перемешивали через 3, 7, 10 нед после закладки. Показателем для необходимости перемешивания служило снижение температуры в центральной части компостной кучи.
Пробы компоста для анализа отбирали каждую неделю с глубины 0-10, 20-30, 50-60 см в 20 точках по всему периметру бурта и усредняли. Масса средней лабораторной пробы составляла 2 кг.
Температуру измеряли на глубинах 0-10 см, 30-40 см, 60-70 см, 90-100 см и 120-130 см от поверхности на освещенной и теневой сторонах бурта. Кислотность солевой и водной вытяжки определяли на универсальном иономере ЭВ-74 по [167].
Численность микроорганизмов учитывали методом предельных разведений - бактерий на мясопептонном агаре (МПА), грибов на среде Сабуро, актиномицетов на среде Чапека, аэробных целлюлозолитиков на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой, термофильных микроорганизмов на среде Космачева [152]. Количество аммонификаторов определяли на мясопептонном бульоне (МПБ) (накопление аммиака выявляли по посинению лакмусовой бумажки, выделение сероводорода по почернению фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца). Число денитрификаторов учитывали на среде Гильтея, выделение газа регистрировали с помощью поплавков. Нитрификаторы выращивали на среде Виноградского, образование NO2 фиксировали по крахмало-йодной реакции, N03 - по реакции с дифениламином. Определения проводили в 3-4 повторно-стях. Достоверность результатов учета микроорганизмов оценивали по критерию Стьюдента.
Ферментативную активность в компостах определяли по методам, применяемым для исследования почвенных ферментов: активность каталазы перманга-натометрически, полифенолоксидазы и пероксидазы йодометрически [168], цел-люлазы - с карбоксиметилцеллюлозой, инвертазы - с сахарозой [169]. Количество выделяющихся редуцирующих Сахаров определяли методом Шомоди-Нельсона на спектрофотометре СФ-26 при X 610 нм [170]. В качестве контроля использовали нейтрализованный ГЛ с минеральными добавками, но без закваски. Фитотоксич-ность созревающего компоста определяли по прорастанию семян пшеницы.
Агрохимический анализ образцов проводили в соответствии с гостирован-ными методиками для органических удобрений: содержание валового азота определяли по ГОСТ 26715-85, Р205 - по ГОСТ 26717-85, К20 - по ГОСТ 26718-85, содержание подвижных форм Р205 - по ГОСТ 27894.5-88, аммонийного азота -по ГОСТ 27894.3-88. Нитратный азот определяли по реакции с дифениламином в модификации Рима [171]. Гуминовые кислоты определяли по ГОСТ 9517-76. Вла-гоемкость определяли по методике, изложенной в [172]. Измерение температуры проводили ежедневно, уровень рН, фитотоксичность и ферментативную активность еженедельно, количество микроорганизмов раз в две недели, агрохимические исследования и определение влагоемкости ежемесячно.
Полевые опыты проводили в 1999-2001 гг. на светло-серых лесных почвах учебно-производственного участка Иркутской государственной сельскохозяйственной академии (п. Молодежный). По гранулометрическому составу почвы тяжелосуглинистые, характеризуются кислой реакцией пахотного горизонта (рНка 4.6). Содержание гумуса (2.4 %) и валового азота (0.1 %) низкое. Содержание обменного калия в пахотном горизонте составляет 18 мг/100 г почвы, подвижного фосфора - 40 мг/100 г почвы.
В работе использовали семена ячменя сорта Неван, пшеницы сорта Ангара-86, кукурузы сорта Коллективный 100 СВ, картофеля сорт Невский. Компост (под кукурузу - 30 и 60 т/га, под картофель - 10 и 20 т/га, под пшеницу и ячмень - 10 т/га) вносили вручную под весеннюю перекопку лопатой. Для сравнения испытывали минеральные удобрения в дозе NwPeoKflfc а в опытах с кукурузой еще перегной в тех же дозах, что и компост. При составлении минеральной удобрительной смеси за основу брали нитроаммофоску. Недостающее количество азота восполняли за счет азотнокислого аммония. В полевых опытах использовали компост сроком компостирования 10, 12,13 недель и 1 год.
Параметры компостирования и оценка зрелости компоста
Правильно приготовленные компоста являются потенциальными активаторами биохимических процессов в почве, приводящими к увеличению урожая вследствие обогащения прикорневой зоны растений полезной микрофлорой и легкоусвояемыми биогенными элементами. Для прогнозирования поведения удобрения в почвенных условиях необходимо комплексное исследование его агрохимических и биохимических свойств, взаимосвязи происходящих в созревающем компосте микробиологических и биохимических процессов с агрохимическими показателями удобрения.
Одним из основных критериев зрелости компоста, т.е. окончания ферментации древесных остатков, считается понижение температуры компостируемой массы до температуры окружающего воздуха даже после перемешивания [76]. В полупромышленном эксперименте уже через сутки после внесения закваски наблюдался разогрев компостной кучи. Подъем температуры происходил в течение полутора недель, указывая на протекание ферментации (рис. 3.1.1). Затем температура плавно падала, свидетельствуя о снижении интенсивности микробиологических процессов и недостатке кислорода. Следующие подъемы наблюдались только после перемешивания, которое проводилось через 3, 7, 10, 13 недель после начала компостирования. Отсутствие температурной реакции компоста на перемешивание (13 нед) указывало на окончание ферментации.
Мы наблюдали значительные колебания температуры в зависимости от слоя компоста. Наиболее высокая температура (60 С) отмечалась в центральной части (на глубине 60-70 см). В поверхностном слое температура была значительно ниже, а колебания менее заметны вследствие рассеяния тепла в окружающий воздух. Около поверхности земли в связи с плохим доступом воздуха температура повышалась незначительно, достигая максимально 31 С. В целом динамика температуры свидетельствовала об активности протекающих в бурте микробиологических процессов. В контрольном бурте (без закваски) подъема температуры ГЛ за все время измерения (13 нед) не наблюдалось, а динамика температур практически не отличалась от температурных показателей для почвы и воздуха.
