Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В ЭКОЛОГИИ И СИСТЕМАТИКЕ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ (обзор литературы) 11
1.1 Эколого-морфологическая характеристика гадюки Никольского 11
1.2 Цитологическая и молекулярно-биологическая характеристика гадюковых змей 17
1.3 Развитие систематики от морфологии до молекулярной биологии... 22
1.4 Методы молекулярной биологии, используемые для определения таксономического статуса и выяснения родственных отношений 26
1.4.1 Биохимические маркеры 26
1.4.2 RFLP-анализ 28
1.4.3 Методы, основанные на полимеразой цепной реакции 29
1.4.3.1 RAPD, AFLP-анализ 31
1.4.3.2 Анализ полиморфизма повторяющихся последовательностей 36
1.4.3.3 Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей 41
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1 Материалы и реактивы 49
2.2 Приборная база 50
2.3 Методы исследования 51
2.3.1 Выделение ДНК 51
2.3.2 Проведение полимеразной цепной реакции 53
2.3.3 Проведение электрофореза в агарозном геле 53
2.3.4 Экстракция ДНК из агарозного геля 54
2.3.5 Секвенирование ПЦР продуктов по Сенгеру 55
2.3.6 Фрагментный анализ микросателлитных локусов 56
2.3.7 Анализ нуклеотидных последовательностей и микросателлитных
локусов 56
Глава 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РОДСТВА ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК 58
3. 1 Обоснование выбора молекулярно-генетических маркеров для исследования генетического родства гадюк 61
3.2 Подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации, митохондриальных генов 66
3.3 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы (Субъединицы 2 -ND2) 67
3.4 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена цитохром с оксидазы (Субъединицы 3 — СО III) 76
3.5 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена 12S рибосомной РНК 84
Глава 4 ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ СЕГРЕГАЦИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ 93
4.1 Исследование внутривидовой вариабельности гадюки Никольского и обыкновенной гадюки с использованием микросателлитных локусов 93
4.2 Разработка сценария расселения и формирования ареалов гадюки Никольского и обыкновенной гадюки 114
Глава 5 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ 117
5.1 Подбор олигонуклеотидных праймеров для генотипирования гадюковых змей 117
5.2 Экспериментальная проверка работоспособности технологии генотипирования гадюковых змей 119
ВЫВОДЫ 122
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 124
ПРИЛОЖЕНИЕ 137
- Эколого-морфологическая характеристика гадюки Никольского
- Обоснование выбора молекулярно-генетических маркеров для исследования генетического родства гадюк
- Исследование внутривидовой вариабельности гадюки Никольского и обыкновенной гадюки с использованием микросателлитных локусов
Введение к работе
Одним из важнейших событий в науке XX в. было открытие двойной спирали ДЕЖ. В последствии это привело к интенсивному развитию такого направления как молекулярная генетика. Особое значение в молекулярно-генетических исследованиях приобрел разработанный в 1975 г. метод секвенирования ДНК, который привел к молекулярно-биологическому пониманию сущности гена, его структуры и функции. Логическим развитием молекулярной генетики становится Международная научная программа «Геном человека», позволившая вывести науку на новый уровень развития. Начинают появляться отдельные направления в генетике, такие как генная диагностика, генная терапия, генная систематика, генная инженерия и др., вышедшие на первый план в медицине и в биологии (Горбунова и др., 1997; Чемерис и др., 1999; Venter et al, 2001).
Особое значение молекулярная генетика приобрела в медицине. Происходит более глубокое понимание вопросов этиологии и патогенеза большинства заболеваний. Широкое распространение приобретает диагностика заболеваний, имеющих в своей основе наследственный компонент. Появляется новое направление — предиктивная диагностика, позволяющая предсказать вероятность развития заболевания, и соответственно принять меры по его профилактике. И как логичное продолжение этого направления - разрабатываются современные лекарственные препараты, воздействующие на генетический аппарат, позволяющие лечить до настоящего времени неизлечимые заболевания (Горбунова и др., 1997).
Современные разработки молекулярной генетики находят применение в судебно-медицинской экспертизе. Результаты ДНК-анализа являются доказательной базой в большинстве судебных процессов. Во многих странах уже существуют банки ДНК, позволяющие быстро идентифицировать человека.
Аналогичная технология используется и при доказательстве биологического отцовства (Пименов и др., 2001).
Развитие молекулярной генетики послужило мощным импульсом для развития биотехнологии. В основе данного направления лежит создание нового продукта или получение уже известного продукта путем переноса генетического материала. В настоящее время биотехнология получила широкое применение в промышленном производстве различных биологически активных веществ (Гловера, 1988; Горбунова и др., 1997; Глик и др., 2002).
Следует отметить, что молекулярная генетика позволила углубить представления о механизмах наследования и об эволюции организмов, заложив тем самым основы филогенетики и генной систематики. По результатам сравнения генов и геномов делается заключение о генетическом родстве организмов. Чем больше имеется отличий в нуклеотидных последовательностях сравниваемых генов, тем дальше в генетическом родстве находятся организмы (Антонов, 2005).
Особое значение генная систематика приобрела при решении спорных вопросов относительно таксонов, систематический статус которых до конца не установлен. С данной проблемой часто сталкиваются исследователи, когда невозможно при использовании традиционных методов морфологического анализа оценить таксономическое положение организма. Принимая во внимание тот факт, что все морфологические признаки закодированы в последовательности ДНК, использование для систематики генетического материала позволяет более глубоко понять процессы эволюции и на их основе сделать заключение о систематическом положении. Важную роль в таксономии рептилий в последнее время приобрело сравнение нуклеотидных последовательностей ми-тохондриальньтх генов. Особенно интенсивно данное направление развивается в отношении змей, ящериц и черепах. Географические популяции пресмыкающихся зачастую характеризуются сходными морфологическими метрическими и меристическими признаками, когда без применения методов молекулярной генетики решение спорных вопросов их систематики становится за труднительным (Калябина-Хауф и др., 2004; Семенова и др., 2004; Garrigues et al., 2005; Ursenbacher et al., 2006; Huang et al., 2007).
К группе рептилий, вопросы филогенетического родства, систематики и распространения которых остаются до конца не выясненными, относятся га-дюковые змеи (Viperidae). На современном этапе развития эколого-таксоно-мических исследований повышенный интерес среди этих животных проявляется к гадюке Никольского {Vipera {Pelias) nikolskii Vedmederja, Grubant, Rudaeva, 1986), которая широко распространена в Европе. В настоящее время не существует единого мнения в отношении ее таксономического статуса. Некоторые авторы выделяют гадюку Никольского в качестве самостоятельного вида, другие рассматривают на уровне подвида обыкновенной гадюки или включают ее в состав комплекса «Vipera berus» в качестве черной морфы (Ведмедеря и др., 1986; Кудрявцев и др., 1998; Бакиев и др., 2004; Grabant et al., 1973; Joger at al., 1997; Milto et al, 2005; Zinenko et al., 2005; Kotenko, 2006).
Во многих работах, выполненных в последнем десятилетии, отсутствует стройная аргументация в подтверждение той или иной точки зрения. Более того, зачастую даже невозможно определить, какую же позицию занимает тот или иной исследователь, не признающий видовой самостоятельности Vipera nikolskii, в отношении статуса «черных гадюк» вообще и изучаемых локальных географических группировок в частности.
Гадюка Никольского занесена в Красную книгу России и Украины как малоизученный вид. Сведения о состоянии ее популяций в Нижнем Поволжье ограничены: не известен таксономический статус окраинных поселений, поэтому с приемлемой точностью не выявлены границы распространения змей. Отсутствуют достоверные данные о возможности гибридизации близкородственных видов гадюк в природе и их экологической сегрегации в зонах симпат-рического обитания. Не разработаны методы оперативной диагностики видовой принадлежности рептилий в природе и лабораторных условиях. Указанные проблемы не позволяют определить категорию редкости и природоохран ный статус вида, приступить к разработке действенных мероприятий по сохранению популяций этих животных, особенно на периферии ареала.
Использование только морфологических, экологических и кариологиче-ских методов не позволяет дать однозначные ответы на поставленные вопросы (Бакиев и др., 2004; Кайбелева и др., 2005). В связи с этим на современном этапе большое значение приобретают эколого-таксономические приемы и подходы, основанные на анализе молекул ДНК. Использование данных методов позволяет уточнить таксономический статус некоторых видов гадюковых змей, а значит значительно приблизиться к пониманию процессов и явлений их морфологической изменчивости под действием комплекса абиотических факторов среды. На основе применения молекулярно-генетического анализа возможно также установление генетической структуры популяций гадюк, а также выявление механизмов, лежащих в основе эволюции изучаемых змей.
Целью работы явилось выявление распространения и экологической сегрегации гадюковых змей в Нижнем Поволжье, определение таксономического статуса их популяций с использованием молекулярно-генетических маркеров. В ходе реализации цели исследования решались следующие задачи:
оценка таксономического статуса гадюки Никольского {Vipera nikolskii) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях на основе анализа нук-леотидных последовательностей митохондриальных генов;
установление генетической структуры популяций гадюк Никольского и обыкновенной с использованием анализа микросателлитных локусов, выявление факторов внешней среды, участвующих в ее формировании;
определение границ ареала гадюки Никольского на территории Нижнего Поволжья и на сопредельных территориях;
выявление механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции и пространственного распространения видов рода Vipera;
разработка экспресс-технологии идентификации популяций гадюковых змей (V. berus и V. nikolskii), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено.
Для оценки таксономического статуса гадюки Никольского предлагается использовать сравнение нуклеотидных последовательностей митохондриаль-ных генов. Сравнение необходимо проводить с обыкновенной гадюкой, являющейся наиболее таксономически близким животным. Для этого выбираются митохондриальные гены, которые наиболее оптимально позволят выявить генетические различия между данными таксонами. Далее определяется первичная структура данных генов и с использованием пакета прикладных программ оценивается таксономическое положение гадюк (Joger at al., 1997).
Для установления генетической структуры популяций гадюк предлагается использовать анализ микросателлитных локусов гадюк. Для этого все использованные в анализе гадюки целесообразно разбивать по отдельным популяциям, после чего выявляются индивидуальные аллели, характерные для каждой популяции в отдельности. На основе результатов микросателлитного анализа делается заключение о различиях между исследованными популяциями, и выявляются вероятные экологические факторы, вызывающие данные различий (Villarreal et al., 1996; McCracken et al., 1999, Carlsson et al., 2004; Manier et al., 2005).
Для определения границ распространения гадюки Никольского предлагается использовать результаты сравнения нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов, как гадюки Никольского, так и обыкновенной гадюки с различных мест обитания. В этом случае важное значение приобретает анализ гадюк с территорий, где вероятно обитают оба вида.
Для выявления механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции предлагается использовать результаты анализа микросателлитных локусов. Вместе с этим, анализ нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов позволяет определять вероятное время дивергенции видов и соответственно разрабатывать сценарии распространения организмов в связи с событиями четвертичного периода.
Для разработки универсальной технологии идентификации гадюк предлагается использовать возможности полимеразной цепной реакции. Данная технология основана на использовании аллель-специфичной ПЦР к мутациям, отличающим гадюку Никольского от обыкновенной гадюки, выявленным при секвенировании митохондриального гена 12S рибосомной РНК. Данная технология позволит за более короткое время и без использования дорогостоящего секвенирования проводить идентификацию спорных экземпляров гадюк (Ко-фиади и др., 2006).
В данной работе предполагается провести комплексную оценку эколого-таксономического статуса гадюки Никольского, а также определение границ ее распространения с использованием анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов гадюк. Для выявления генетических особенностей популяций гадюки Никольского и обыкновенной гадюки будет проведен анализ микросателлитных локусов, проявляющих высокий уровень полиморфизма. Будет разработана технология идентификации популяций гадюко-вых змей (V. berus и V. nikolskii), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено.
Эколого-морфологическая характеристика гадюки Никольского
Обычно самки гадюки Никольского имеют более крупные размеры, а также относительно короткую и широкую голову (Табачишин и др., 2002; Та-бачишин и др., 2003). Самцы характеризуются более узкой и удлиненной головой (Tabatschischin et al., 2004), а хвост их имеет «гантелевидную» форму и сохраняет одинаковый диаметр до половины своей длины, после чего сужается. Для определения пола гадюк в тех случаях, когда особи проявляют промежуточные признаки прибегают к зондированию прианальных карманов (Шляхтин и др., 2005).
Появление гадюки Никольского после зимней спячки отмечается во второй половине апреля. В это время гадюки выходят на поверхность при температуре воздуха выше 10С. Наиболее активны гадюки при температуре воздуха в пределе 20 - 25С. С апреля по июнь гадюка активна на протяжении всего дня, а в июне-июле имеются два выраженных пика активности: утренний с 6 до 9 ч и сумеречный с 19 до 22 ч. Со второй декады августа активность гадюк снижается и встречаются только днем в основном вблизи водоемов и различных укрытий. В конце сентября отмечаются массивные скопления около мест зимовки, а к первой половине октября уходят в спячку (Завьялов и др., 1998).
Спаривание обычно отмечается через 2-3 недели после выхода животных с зимовки. По данным наблюдений, в брачный период вступают особи с хорошей упитанностью; у самцов относительное содержание жира составляет 9.6 - 14.9%, у самок — 14.3 - 17.4%. В это время для реализации необходимых форм поведения (питание, половая активность и т.д.) самцы расходуют жира значительно больше, чем самки (Завьялов и др., 1998).
Для гадюк характерно яйцеживорождение. Молодые особи гадюк появляются в последней декаде июня — первой декаде сентября. В условиях Нижнего Поволжья рождаются от 12 до 18 (в среднем 15) детенышей со средней длиной тела 171.6 ± 0.69 мм, хвоста 24.1 ± 0.30 мм, а вес 4.4 ± 0.08 г. Новорожденные гадюки имеют серую окраску с зигзагообразным рисунком по спине, характерную для обыкновенной гадюки, который после 4-6 линек сменяется на абсолютно черный, характерный для взрослых особей (Завьялов и др., 1998; Кудрявцев и др., 1998).
Линька гадюки Никольского начинается в третьей декаде апреля -первой декаде мая. В холодных условиях особи в стадии подготовки к линьке встречаются до середины мая. Молодые гадюки линяют в течение двух суток после рождения. Следует отметить, что самки линяют на 1 - 2.5 недели позднее, чем самцы и продолжительность растянута на 2 — 4 недели. В линьке выделяют несколько стадий. Самая продолжительная стадия - стадия помутнение брюшных и подхвостовых щитков (8-14 сут). Вторая стадия вдвое короче и называется стадия мутных глаз и прояснения брюшных и подхвостовых щитков (при последующих линьках разница в продолжительности этих стадий практически исчезает). Третья стадия - стадия прояснения глаз (1-4 сут), после которой проходит собственно линька и протекает у физиологически здоровых особей в течение несколько минут. Вторая линька начинается вскоре после периода спаривания. Третья линька - со второй половины июля до конца августа. Продолжительность второй и третьей линек 9-14 сут (Завьялов и др., 1998).
В качестве основных морфологических признаков, используемых для описания гадюк, являются метрические и меристические показатели (Шляхтин и др., 1986). Среди них длина тела (L.), хвоста (L.cd.), отношение длины неповрежденного хвоста к сумме длины тела и хвоста (L.cd./L. +L.cd.), отношение длины головы (от кончика морды до заднего края последнего верхнегубного щитка) к длине пилеуса (L.cap./L.pil.), отношение длины пилеуса к ширине головы на уровне глаз (L.pil./Lt.cap.), отношение ширины головы к расстоянию от переднего края глаза до кончика морды (Lt.cap./rl), отношение наибольшей длины лобного и теменного щитков к их наибольшей ширине (L.fr./Lt.fr. и L.par./Lt.par.), отношение наибольшей длины лобного щитка к расстоянию от его переднего края до шва между апикальным и межчелюстным щитками (L.fr./rostr.), отношение.a
Обоснование выбора молекулярно-генетических маркеров для исследования генетического родства гадюк
Обыкновенная гадюка является наиболее изученным объектом со стороны молекулярной биологии. В международной базе GenBank имеются нуклео-тидные последовательности митохондриальных генов цитохрома Ъ (cyt b), 168рибосомной РНК (16S rRNA), субъединицы 2 и 4 НАДН-дегидрогеназы (ND2, ND4), контрольного региона, ядерного гена фосфолипазы и некоторые другие.
Гадюка Никольского {Vipera nikolskii) или как ее еще называют лесостепная гадюка, описана украинскими герпетологами в 1984 г., получила научное название в честь известного герпетолога, академика А.Н. Никольского (Ведмеря и др., 1986). До этого времени о гадюке Никольского с Харьковщины говорили как о цветовой форме обыкновенной гадюки. В настоящее время существует несколько мнений, основанных на использовании молекулярно-генетических маркеров, относительно таксономического статуса гадюки Никольского. Первое из них основывается на сравнении нуклеотидных последовательностей цитохрома Ъ, на основе чего было предложено рассматривать гадюку Никольского в качестве подвида обыкновенной гадюки (Joger et al., 1997). Второе мнение базируется на результатах исследования ферментов яда. На основе полученных результатов авторы предлагают рассматривать гадюку Никольского как отдельный вид по отношению к обыкновенной гадюке за счет наличия фракции гетеродимеров фосфолипазы A (HDP-1 и HDP-2) (Ramazanova et al., 2008).
Следует отметить, что в последние годы с развитием секвенирования, используемого для разрешения спорных вопросов систематики, интенсивно стала применяться митохондриальная ДІЖ для различения видов животных. По сравнению с ядерной ДНК, митохондриальная характеризуется отсутствием рекомбинаций и высоким уровнем вариабельности. Вместе с этим исползование в качестве маркеров ядерной ДНК, в частности ITS (внутренних транскрибируемых спейсеров), в некоторых случаях не позволяет выявлять существующую вариабельность. Это в основном связано с высокой консервативностью данных участков, не позволяющих различать близкородственные виды внутри одного рода (Горюнов и др., 2005). Все выше перечисленные характеристики позволяют использовать митохондриальную ДНК для изучения межвидовых взаимоотношений.
Между тем нельзя забывать и об артефактах, возникающих при недостаточном использовании индивидуализирующих свойств митохондриальной ДНК. Имеется в виду принцип редукционизма, связанный с неверным заключением о генетическом родстве, основанном на сравнении небольших фрагментов мтДНК. Можно сказать, что в этом случае исследуются организмы по какому-то одному и очень незначительному признаку. Выход из данной ситуации видится в одновременном использовании сразу нескольких фрагментов митохондриальной ДНК, за счет чего будут анализироваться участки, обладающие различным уровнем консерватизма и произойдет снижение вероятности появления неверных заключений.
В связи с тем, что различные участки мтДНК обнаруживают разный уровень полиморфизма, поэтому необходимо использование более вариабельных фрагментов для анализа родства на низком таксономическом уровне, а более консервативных участков для более высоких таксономических единиц.
В настоящее время наиболее актуальным является использование моле-кулярно-генетических маркеров для исследования спорных вопросов в таксономии гадюки Никольского. Гадюка Никольского является видом, занесенным в Красную книгу России и Украины и в связи с этим необходима разработка точной технологии ее идентификации.
Исследование внутривидовой вариабельности гадюки Никольского и обыкновенной гадюки с использованием микросателлитных локусов
В настоящее время гадюка Никольского является одним из самых распространенных представителей рода Viper а на территории Саратовской области. Выявленные различия между саратовскими популяциями гадюк и остальными исследованными представителями указанного таксона позволили подтвердить обоснованность выделения гадюки Никольского в качестве самостоятельного вида.
Географически гадюка Никольского не распространяется в Саратовской области выше границы Саратовского и Волгоградского водохранилища, т.е. южнее г. Хвалынска. Территория выше данной границы, по нашим данным, заселена обыкновенной гадюкой. Данные результаты получены при сравнении, секвенированных последовательностей митохондриальных генов особей на исследуемой территории. Однако эти исследования позволили лишь разделить все экземпляры на три группы (V. berus, V. nikolskii, V. renardi) и не дали возможности оценить полиморфизм на уровне отдельных популяций.
Наряду с этим заключением большой интерес представляет анализ различий между отдельными популяциями гадюк Никольского и обыкновенной. Данная проблема связана с вероятностью гибридизации номинативного подвида обыкновенной гадюки и монотипической гадюки Никольского. Явление гибридизации между данными видами было выявлено в неволе. Гибридные особи имели промежуточные признаки родительских форм. Причем гибридные самцы имели окраску, свойственную гадюке Никольского, а самки свойственную обыкновенной гадюке (Зиненко, 2003). Данное явление гибридизации свидетельствует о возможности этого события и в дикой природе. Имея обширную зону интеградации вдоль границы Канев — Курск — Тамбов — Бузулук, вероятность данного события возрастает. Вместе с этим результаты анализа морфологических признаков выявили сложный переход от обыкновенной гадюки к гадюке Никольского на обширной зоне их интеградации (Бакиев, 2004).
Хотя результаты сравнения нуклеотидных последовательностей мито-хондриальных генов и позволили нам провести границу между данными подвидами, это не решило вопроса о возможности их гибридизации. Митохондри-альная ДНК в связи с материнским характером наследования не позволяет анализировать гибридных особей. На помощь в данной ситуации приходит ядерная ДНК. Большинство маркеров ядерной ДНК наследуются по законам Менделя, в связи с чем существует возможность оценить гибридное поколение от двух родительских форм. Наиболее часто используемыми ядерными маркерами для анализа генетического полиморфизма популяций являются микроса-теллитные локусы. Они обладают высоким уровнем вариабельности и наследуются по кодоминантному типу (Сингер, 1998; Иванов и др., 2005). В связи с этим, для исследования внутривидовой вариабельности гадюк и анализа гибридизации было предложено использовать микросателлитные локусы.
На первом этапе для оценки полиморфизма гадюки Никольского на территории изучаемого региона с использованием микросателлитных локусов осуществляли подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации необходимых участков ДНК. У змей на данный момент найдено достаточно ограниченное число микросателлитных локусов. Это создает различные трудности для изучения популяции гадюк с применением анализа микросателлитных последовательностей. Одной из таких проблем является отсутствие близкородственных видов для гадюк с исследованными микросателлитными локусами. Имеются данные об использовании микросателлитных локусов для гремучей змеи (Crotalus horridus), подвязочного ужа {Thamnophis sirtalis) и полосатой неродии (Nerodia fasciata fasciata) (Villarreal et al., 1996; McCracken et al., 1999; Carlsson et al., 2004; Manier et al., 2005). Однако не все данные микросателлит-ные локусы позволяют анализировать популяции гадюк. Это вызвано моно-морфностью некоторых микросателлитных локусов для данной группы, либо полным их отсутствием из-за далекого родства.
