Содержание к диссертации
Введение
1. Получение, свойства и использование лизина в сельском хозяйстве 11
1.1. Значение микроорганизмов в природе 13
1.2. Получение органических кислот 15
1.3. Получение аминокислот ' 20
1.4. Биологические свойства кормового концентрата L-лизина (ККЛ) 33
1.5. Питание человека 45
2. Условия, объекты и методы исследования 57
2.1. Метеорологические условия в год проведения исследования 58
2.2. Задачи и программа исследования 60
2.3. Методика эксперимента 61
3. Вещества, сопутствующие биохимическому синтезу лизина 63
3.1. Определение свойств меланоидов, содержащихся в КЖ, методом гельхроматографии на сефадексах 64
3.2. Изучение природы и свойств окрашенных соединений, сопутствующих выделению лизина 66
3.3. Полученные результаты и их обсуждение 69
3.4. Свойства меланоидинов, содержащихся в КЖ 78
3.5. Свойства окрашенных веществ, содержащихся в КЖ Ливанского биохимзавода 87
3.6. Сорбция лизина микробиологического синтез 95
4. Исследование осажденной биомассы микробиологического лизина в качестве удобрений 106
4.1. Агрохимическая характеристика почвы вегетационных опытов и опытных участков 106
4.2. Влияние удобрений на урожайность и качество зерна ячменя и кукурузы на силос 107
5. Санитарно-химическое исследование ионитов 116
5.0. Эксплуатация ионитов в условиях пищевых производств 117
5.1. Санитарно-химические исследования анионитаАВ-17-2П5.2 118
5.2. Исследования санитарно-химических свойств ионита ИА-IP 129
5.3. Санитарно-химические исследования ионита ИА-3 135
5.4. Гигиенические оценки катионита КУ-1 148
5.5. Токсико-гигиеническая оценка катионита КУ-2-8 167
5.6. Органолептические исследования катионита КУ-2-8 171
5.7. Токсикологические исследования КУ-2-8 172
Выводы 181
Заключение 184
Список использованной литературы 186
Приложения 204
- Значение микроорганизмов в природе
- Метеорологические условия в год проведения исследования
- Определение свойств меланоидов, содержащихся в КЖ, методом гельхроматографии на сефадексах
Введение к работе
Актуальность исследования. Производство синтетических аминокислот и разработка условий их эффективного использования являются одним из путей решения проблемы увеличения продуктов животноводства при минимальных затратах белка. Среди проблем аминокислотного питания животных наибольшую важность представляет разработка вопросов лизинового питания, так как он относится к незаменимым аминокислотам, а также экологически целесообразного способа производства лизина. В микробиологическом производстве это может быть достигнуто, начиная от приёмов выращивания бактерий до рационального использования отходов, которыми являются культуральные среды. Они содержат также ряд других аминокислот, питательные и ростовые вещества, и другие продукты биосинтеза, которые могут быть использованы как в качестве корма, так и комплексных удобрений. Увеличение продуктивности агро - и техносферы требует разработок источников питания, корма и сырья для перерабатывающей промышленности [25, 59, 26, 171,172,173,183].
Использование экологических решений в управляемых промышленных условиях биотехнологий позволяет получать кормовые продукты, аминокислоты, удобрения с минимальным воздействием на окружающую среду. Необходим экологический контроль осуществления микробио-логических конкретных процессов вплоть до очистки сточных вод при выделении веществ из культуральных сред или из биомассы микроорганизмов, так как побочные продукты могут привести к уничтожению природной микрофлоры и потере очищающей способности окружающей среды. Поскольку в микробиологической промышленности все технологические процессы связаны с потреблением воды и после извлечения целевого продукта в ней остается много редуцирующих веществ в виде ассимилируемых микроорганизмами источников углерода, то ее можно использовать в качестве среды для получения кормовых дрожжей, иных
полезных продуктов. Сказанное справедливо и в отношении жидких и твёрдых отходов биосинтеза в смысле извлечения полезных и утилизации вредных побочных продуктов.
В настоящее время имеет место дефицит лизина как при потреблении человеком, так и при кормлении животных. Концепция государственной политики в области здорового питания населения, принятая правительством Российской Федерации (постановление №910 от 10 августа 1998г.), предусматривает разработку технологии качественно новых продуктов питания функционального назначения. В связи с чем извлечение лизина из культуральных сред и его последующее использование является актуальной задачей, решение которой позволяет, наряду с утилизацией отходов, способствовать повышению качества жизни населения и кормления животных [9,12,16,27, ПО, 125, 132, 133].
Существующая биотехнология получения лизина, разработанная институтом им. А.Н. Баха экологически небезопасна, т.к. требует больших объёмов воды и, соответственно, наличия стоков, содержащих редуцирующие вещества, микроорганизмы, органические вещества и иные источники углерода, которые могут быть неконтролированно использованы микроорганизмами окружающей среды в сторону изменения микрофлоры и нарушения биологического равновесия. Поэтому актуальной является разработка технологических приёмов выделения лизина, использования культуральной среды в качестве корма и комплексных удобрений. Экологически целесообразными методами выделения лизина являются сорбционные. Литературные данные содержат сведения о возможности использования катионо и анионообменных сорбентов для выделения лизина; однако, они обладают рядом недостатков, повышенной сорбцией органических веществ, и в связи с этим, потерями лизина, невысокой стойкостью сорбентов в кислой и щелочных средах, что ведёт к загрязнению целевого продукта. В то же время ряд катионитов обладает высокой сорбционной селективностью к аминокислотам и химической стойкостью.
6 Использование таких смол в технологии извлечения лизина позволяет решить актуальную задачу - повысить эффективность процесса выделения лизина без отделения от биомассы в виде двухзарядного катионита с получением легко вытесняемого продукта в условиях элюирования аммиаком [63, 74,75,76, 77, 78, 150].
Культуральные среды, помимо лизина, содержат в своём составе другие аминокислоты, а также такие минеральные примеси как азот, фосфор, калий, которые можно с одной стороны использовать в качестве корма животных, а с другой - получить удобрение, что в целом повышает экологическую безопасность и экономическую целесообразность биотехнологического производства. Решение этой задачи может быть осуществлено на основе использования катионообменных смол марок КУ при выделении лизина, а также культуральных сред в качестве удобрений в сельскохозяйственной промышленности [13, 17, 32, 33, 34,93,111].
Литературные данные содержат сведения об использовании лизина в качестве кормовых добавок для выращивания животных, но недостаточно сведений об использовании биомассы в качестве удобрений зерновых культур. Поэтому актуальным является поиск технологических решений экономии кормового протеина и кормовых средств растительного происхождения за счет балансировок кормов животных препаратами незаменимых аминокислот (лизина), а также путей повышения продуктивности зерновых культур за счёт эффективного использования отходов биосинтеза, в том числе и биомассы микробного синтеза [13, 35, 37, 40, 138, 248].
Цель и задачи исследования. Целью работы является разработка процесса сорбционного извлечения лизина из культуральных сред без отделения от биомассы, а также экологически целесообразных приёмов использования биомассы в качестве удобрений под ячмень и кукурузу.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Исследование возможности применения биомассы микробного синтеза в качестве удобрений полевых культур, изучение структуры урожая и качества зерна.
Выявление путей использования лизина для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных.
Повышение уровня экологической безопасности процесса биохимического выделения лизина за счёт комплексного использования отходов производства.
Определение рациональных параметров сорбции лизина катионитом КУ-2-8.
Выявление оптимальных условий глубокой и эффективной десорбции лизина.
Установление физико-химических характеристик культуральных сред.
Разработка технологической схемы получения лизина и путей использования биомассы в качестве удобрений зерновых культур.
Санитарно-химическая оценка катионитов и анионитов, используемых в микробиологическом производстве лизина.
Научная новизна работы. Выявлено, что применение биомассы в качестве удобрений способствовало улучшению качества зерна, содержание сырого протеина и крахмала в зерне ячменя Дина повышалось; в зелёной массе кукурузы РОСС-209 содержание сырого протеина увеличивалось, а клетчатки не менялось. Внесение биомассы способствовало повышению урожайности ячменя на 100 и 25%, а кукурузы на 70 и 25% в вегетационных и микрополевых опытах соответственно. Улучшилась сохранность растений за вегетацию, увеличилась озернённость колоса и масса зерна с колоса.
Проведены санитарно-химические и токсикологические исследования катионитов КУ-2, анионитов ИА-3, АВ-17-2П. Выявлено по данным морфологических, биохимических, патологических исследований, что
экстракты из водных вытяжек отмытых и неотмытых форм смол не оказывают влияния на организм животных, а органолептическая активность экстрактов из смол незначительна и находится в пределах санитарных норм.
Исследована кинетика и динамика сорбции лизина из водных соляно-и сернокислых сред микробного синтеза в широкой области изменения концентрации, рН и температуры, высоты слоя сорбента, скорости потока раствора на разных сорбентах.
На основании экспериментов и выявленных закономерностей сорбции лизина в зависимости от многих параметров разработана технология выделения лизина из культуральных сред без отделения от биомассы.
Выявить параметры процесса, повышающие эффективность сорбции лизина, которые внедрены в виде технологических рекомендаций.
В результате изучения взаимодействия насыщенного лизином катионита и анионита с различными основаниями разработан способ и режим регенерации отработанного сорбента для восстановления его работоспособности, позволяющий достигать высокого эффекта десорбции при минимальном расходе реагентов.
Предложен механизм сорбции и десорбции лизина и дано объяснение закономерностей сорбции и десорбции с позиций физико-химических свойств лизина в виде цвиттер-ионов, катионов, анионов, нейтральных молекул.
Практическая значимость работы: повышена экологичность процесса микробного синтеза лизина за счет вовлечения отходов производства в качестве удобрений полевых культур. Установлено, что биомасса содержит азот, фосфор, калий, другие минеральные ионы, органические элементы питания, которые усваивались растениями и повышали урожай зерна ячменя и зелёной массы кукурузы.
Предложены методики определения тяжелых металлов в продуктах с/х производства, крови, шерсти и органах животных с помощью |3-дикетонатных аддуктов.
Научно обосновано практическое применение катионита КУ-2-8 для выделения лизина из культуральных сред без отделения от биомассы. Разработан режим проведения процесса в промышленном производстве. Показана возможность восстановления сорбционной емкости сорбента и предложены параметры регенерации фильтра.
Определены режимы безопасного кондиционирования ионитов КУ-2-8. ИА-3, АВ-17-2П в условиях сельскохозяйственного производства.
Положения, выносимые на защиту:
Экспериментальные результаты исследований по сорбции лизина на ряде ионитов. Влияние на сорбционную способность ионитов- рН, концентрации, температуры, скорости потока раствора, вида смолы.
Определение оптимального расхода регенерирующего агента для эффективного восстановления сорбционной ёмкости.
Экологически обоснованная технологическая схема получения лизина.
Агроэкологические условия выращивания, урожайность и качество полевых культур в свете использования биомассы микробного синтеза в качестве удобрений.
Результаты исследований санитарно - химических свойств ионитов, используемых в пищевой и микробиологической промышленности.
Достоверность результатов работы. Достоверность результатов работы, представленных в диссертации, подтверждается использованием современных физико-химических методов анализа, математических методов обработки данных, лабораторными и полевыми испытаниями.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены:
На 17 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии «Достижение и перспективы химической науки», Казань, 2003 год.
На V международной научно-практической конференции
«Проблемы строительства, инженерного обеспечения,
благоустройства и экологии», Пенза, 2003 год.
На Всероссийской научно-практической конференции «Среды
обитания, проблемы экологической реабилитации нарушенных
экосистем», Пенза, 2003 год.
На V Международной научно-практической конференции
«Экономика, экология и общество России в 21-м столетии», Санкт-
Петербург, 2003год.
На III Международной конференции «Экстракция органических
соединений», Воронеж, 2005 год.
На Х-ой Всероссийской научно-практической конференции
«Проблемы экологической безопасности центрального черноземья
Российской Федерации, Липецк, 2006 год.
На научных и учебно-методических конференциях профессорско-
преподавательского состава, научных сотрудников ЕГУ им. И.А.
Бунина 2004-2007г.г.
Работа выполнена в соответствии с открытым планом хоздоговорных работ ЕГУ им. И.А. Бунина «Разработка экологических основ и технологий производства в агроэкосистемах ЦЧР» на 2000 - 2007 г.г.
Публикации. По теме исследования опубликовано 12 научных работ, в том числе 2 в изданиях, реферируемых ВАК РФ.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и рекомендаций по практическому применению. Общий объём диссертации состоит из 212 страниц, в том числе 40 рисунков, 93 таблиц. В списке используемой литературы приведено 247 библиографических ссылок на отечественные и иностранные источники. Приложения даны на 8 страницах.
Значение микроорганизмов в природе
Самым важным процессом в живой природе, от которого зависит существование человека, является фотосинтез. Он осуществляется растениями, содержащими зеленый пигмент хлорофилл. Микроорганизмы (дрожжи, плесневые грибы и бактерии) являются бесхлорофильными низшими растениями. Однако, некоторые низшие одноклеточные растения, например хлореллы, содержат хлорофилл и, следовательно, осуществляют фотосинтез. Суммарную реакцию фотосинтеза можно записать так:
6С02 + 6Н20 + солнечная - С6Н1206+ 602 энергия В процессе фотосинтеза получается не только глюкоза, но и другие вещества очень сложного состава, образующие протоплазму. Баланс фотосинтеза протоплазмы можно выразить следующим уравнением:
5447000 кДж + 106СО2 + 90Н2О + 16NO" + РО " +
+ минеральные — 3258 г протоплазмы + 15402 + 5392530 кДж. вещества
Освобожденный в процессе фотосинтеза кислород образуется из воды в результате фотолиза. Водород, который одновременно образуется при фотолизе, имеет очень большое энергетическое значение, так как стимулирует превращение особого энергопереносящего вещества — аденозин-дифосфата (АДФ) в энергетически более богатое соединение -аденозинтрифосфат (АТФ) [25, 59].
Органических растворители можно получать не только химическим путем, но и с помощью микробиологического синтеза.
Брожение ацетона и бутилового спирта является анаэробным процессом, вызывается бактериями Clostridium acetobutilicum или близкими к ним видами маслянокислых бактерий.
Ацетон и бутиловый спирт получают, сбраживая зерновые, мелассно-зерновые заторы или мелассу.
Разработаны методы получения ацетона и бутилового спирта из сульфитного щелока и гидролизатов древесины.
При этом образуется уксусная и масляная кислоты, выделяется водород и углекислый газ. Масляная кислота восстанавливается до бутилового спирта. Ацетон образуется из продукта конденсации уксусной кислоты — ацетонуксусной кислоты при декарбоксилировании. Во время брожения в среде накапливается много рибофлавина, причем количество его тем больше, чем интенсивнее образуется ацетон. Разработаны способы получения кормового препарата рибофлавина из ацетоно-бутиловой барды после отделения органических растворителей. Для этого барду десятикратно упаривают в многоступенчатых вакуум-аппаратах и затем высушивают в распылительных сушилках. Так получают сухой концентрат, содержащий рибофлавина 60—100 мкг/г.
В Институте биохимии им. А. Баха РАН разработан метод получения ценного витаминного концентрата из ацетоно-бутиловой барды путем дополнительного сбраживания ее метанообразующими бактериями, которые, используя часть сухих веществ, синтезируют витамин Bi2.
Метеорологические условия в год проведения исследования
Липецкая область занимает центральную часть черноземной полосы. Климат области носит континентальный характер и выражается в резких различиях температурных условий зимы и лета. На территории области выделяют две природные зоны - лесостепная и степная.
Осадки. Среднегодовое количество осадков колеблется по области от 250-900 мм. По средним многолетним данным Липецкой метеорологической станции годовая сумма осадков в районе реки Воронеж составляет 529 мм. Наибольшее количество осадков выпадает в летние месяцы, наименьшее - в зимние месяцы и в марте, что составляет 20-30% от годовой нормы.
Климат характеризуется значительной засушливостью. Отмечается два вида засух - почвенная и засушливая или атмосферная. Часто наблюдаются суховеи, засухи. Влажность воздуха колеблется в зимнее время от 80-90%, в летнее время от 60-70%. Минимальная относительная влажность воздуха наблюдается в мае, июне, августе, доходя до 10-18%.
Температурный режим. Температурные условия области благоприятны для роста и развития большинства сельскохозяйственных растений. Продолжительность периода роста и развития растений определяется в северных районах области в 185 дней, в южных - 200 дней. Январь был теплее обычного. Отмечен недобором осадков, незначительной толщиной снежного покрова. Условия для перезимовки озимых были вполне удовлетворительными.
Февраль был холоднее обычного на 2-4 С со значительным недобором осадков. Их выпало от 5 до 20% месячной нормы.
Март - средняя температура воздуха была не выше обычной на 1-2 С. Осадков выпало 50-70% месячной нормы. Перезимовка озимых проходила нормально.
Апрель характеризовался теплой погодой на 1-2 С выше нормы. Отмечен недобор осадков, их выпало от 16 до 40% месячной нормы. Условия для вегетации сельскохозяйственных культур и проведения полевых работ в целом были благоприятными.
Май года испытаний был засушливым. Выпало менее половины месячной нормы осадков. Запасы продуктивной влаги под озимыми и яровыми культурами в метровом слое почвы был недостаточные, плохие. Влагообеспеченность посевов составила менее 50% оптимума. Жаркая погода привела к низкорослости, быстрому росту и развитию растений. Состояние посевов удовлетворительное.
Июнь характеризовался температурой воздуха близкой к норме и незначительным недоборам осадков. Их выпало менее половины месячной нормы. Запасы продуктивной влаги под яровыми зерновыми в метровом слое почвы плохие. Состояние посевов удовлетворительное.
Июль. Средняя температура около нормы. Осадков выпало около 70% нормы. Запасы продуктивной влаги в метровом слое почвы явно недостаточны. Состояние посевов поздних яровых культур удовлетворительное.
Август был прохладнее обычного на 1,5-2 С. Отмечался недобор осадков. Их выпало 50-70% месячной нормы. Начался сев озимых. Запасы продуктивной влаги в пахотном слое почвы хорошие и удовлетворительные. Состояние посевов поздних яровых культур удовлетворительное. Сентябрь был теплее обычного на 1-2 С. Осадков выпало мало - от 5-40% месячной нормы. Условия для проведения уборочных работ были благоприятными.
Определение свойств меланоидов, содержащихся в КЖ, методом гельхроматографии на сефадексах
После предварительной обработки КЖ и разделения веществ с помощью бумажной хроматографии, осуществляли разделение методом гельхроматографии на сефадексах.
Для этого раствор красящих веществ пропускали через колонку с сефадексом со скоростью 0,2 мл/мин. Тип сефадекса подбирали опытным путем для эффективного разделения. Объемы используемых растворов - 1 мл. После прохождения 1 мл исследуемого раствора через колонку, начинали элюирование дистиллированной водой. На выходе из колонки отбирали фракции по 5 мл, контролируя концентрацию раствора с помощью спектрофотометра СФ - 4А при длине волны 260 нм. Область поглощения изучаемых растворов установлена предварительно. Данные, полученные с гельхроматографии, использованы для определения веса окрашенных соединений. Определение основано на том, что в значительном диапазоне элюационный объем является линейной характеристикой логарифма величины молекулярного веса. Поэтому для определения молекулярного веса строили калибровочную кривую с использованием белковых веществ с известными молекулярными весами и структурой, близкой к меланоидам. Затем определяли элюационный объем и по кривой находили известный молекулярный вес.
Был определен элементный состав красящих веществ. Для количественного определения углерода и водорода (по Либиху) использовали реакции сожжения испытуемого вещества с окисью меди. Сожжение вели в специальной установке в токе кислорода и продукты горения СО2 и Н2О, затем рассчитывали на величину навески [44, 117, 201, 202].
Для количественного определения азота (по Дюма) точную навеску сжигали с окисью меди, сожжение вели в токе СОг- В этих условиях углерод и водород испытуемого вещества превращается в СО2 и Н20, азот - в газообразный N2. Продукты горения пропускали через крепкий 40% КОН в специальный прибор азотомер. Щелочь поглощает ССЬ и Н20, а над ней собирается чистый азот, объем которого собирается и пересчитывается на навеску. Кислород определяли по разности между 100% и суммой % содержания остальных элементов с учетом минерального остатка. По полученным данным атомного состава выводили простейшую молекулярную формулу. Ниже приводится средний молекулярный вес, элементарный состав и эмпирические формулы меланоидинов.
На стадиях производства лизина температура раствора достигает высокой величины. В связи с этим возможно протекание реакции между соединениями, имеющими карбонильные и амино-группы. Это приводит к увеличению цветности за счет образования меланоидинов [201]. Кроме того, при подкислении КЖ (перед подачей ее на ионообменную колонну) концентрированной серной кислотой происходит осмоление органических веществ, что в свою очередь ведет к увеличению цветности КЖ.
Таким образом, можно предположить, что в ферментационных растворах лизина содержатся окрашенные соединения, отличающиеся по своему составу и строению от красящих веществ как сахарного, так и лимоннокислого производств. Следовательно, для создания эффективной технологической схемы обесцвечивания возникает необходимость тщательного изучения физико-химических свойств и строения красящих веществ.
