Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы. Оценка токсичности индивидуальных веществ, состояния
почв и плотных антропо-генных образований с использованием микроорганизмов. 10
Общие положения
1.1 Методы биотестирования 10
1.1.1 Биотестирование с использованием микроорганизмов 13
1.1.1.1 Угнетение роста микробной культуры 13
1.1.1.2 Ферментные тесты 14
1.1.1.3 Тесты, основанные на ингибировании люминесценции 16
1.1.1 Биотестирование с использованием других организмов 21
1.2 Методы, основанные на оценке состояния аборигенной микрофлоры 24
1.2.1 Определение состояния почв и плотных антропогенных образований на основе измерения микробной биомассы
1.2.2 Оценка состояния объектов на основе анализа процессов трансформации азота и углерода в почве
1.2.3 Оценка состояния почв на основании измерения ферментативной активности аборигенной микрофлоры
1.2.4 Оценка состояния экосистем на основе определения микробного - разнообразия и устойчивости сообществ
1.3 Влияние металлов на микроорганизмы 40
Глава 2 Материалы и методы исследования 44
2.1 Объекты исследования, культивирование, идентификация 44
2.1.1 Объекты исследования 44
2.1.2 Культивирование организмов 44
2.1.3 Идентификация организмов 44
2.1.3.1 Экстрагирование ДНК 44
2 1.3.2 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 45
2.1.3.3 Секвенирование продукта ПЦР 46
2.2 Методы биотестирования 47
2.2.1 Биотестирование объектов с использованием Bacillus pumilus КМ-21 47
2.2.1.1 Контактное биотестирование 47
2.2.1.2 Биотестирование водных образцов 48
2 2.1.3 Элюатное биотестирование 49
2.2.2 Определение дегидрогеназной активности аборигенной микрофлоры почвенных образцов
2.2.3 Биотестирование объектов с использованием Paramecium caudatum 49
2.2.4 Биотестирование объектов с использованием Ceriodaphma affinis 51
2.3 Анализируемые образцы 52
2.3.1 Водные растворы 52
2 3.2 Искусственно загрязненные почвенные образцы 52
2.3.3 Незагрязненные почвы с различным содержанием органического .-вещества
2.3.4 Почвы, обработанные компостом 53
2.3.5 Модельные образцы отходов 53
2.3.6 Промышленные отходы 54
2.4 Обработка и оценка результатов 55
Глава 3 Результаты и обсуждение 57
3.1 Выбор тест-объекта 57
3.1.1 Ростовые характеристики бактерий рода Bacillus 57
3.1.2 Дегидрогеназная активность бактерий рода Bacillus 59
3.1.3 Чувствительность бактерий рода Bacillus к стандартным токсикантам
3.2 Идентификация тест-объекта 63
3.3 Определение опрерационных параметров и стандартизация методики контактного биотестирования
3.3.1 Определение операционных параметров методики 68
3 3.2 Стандартизация условий биотестирования 70
3 3.3 Определение поправочного коэффициента при тестировании почвенных образцов
3.4 Определение метрологических характеристик методики контактного биотестирования
3.5 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 50%-ный ингибирующий эффект
3.5.1 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью линейной модели
3.5.2 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью нелинейных методов
3.6 Анализ токсичности почвенных образцов, содержащих индивидуальные металлы, их смесь и органический токсикант, методами контактного и элюатного биотестирования
3.6.1 Анализ токсичности поченных образцов методами контактного и элюатного биотестирования
3.6.2 Определение токсичности почвенных образцов на основе оценки активности аборигенной микрофлоры
3.7 Анализ токсичности почвенных образцов, загрязненных хромом и кадмием, тестах с использованием Р caudatum и С affims
3.8 Использование методики контактного биотестирования для оценки класса опасности промышленных отходов и почв
3.8.1 Определение токсичности промышленных отходов 106
3.8.2 Создание ранжировочной таблицы для отнесения отходов к классам опасности
3.8.3 Определение классов опасности отходов на основании результатов биотестирования с использованием В pumilus, Р caudatum и С affims
Выводы 117
Введение к работе
Актуальность работы. Растущая антропогенная нагрузка на экосистемы диктует необходимость разработки системы мер по ее минимизации. Для эффективного природоохранного управления необходима информация о степени опасности загрязняющих веществ для окружающей среды, прежде всего, их токсичности (Filip, 2002; Ладонин, Пляскина, 2004; Feisthauer et al., 2005; Fernandez et al., 2005; Classens et al., 2006; Судницын, 2006). В настоящее время наряду с методами химического анализа для оценки состояния природных и антропогенных объектов все чаще используются биологические методы. Наиболее сложны для анализа плотные многокомпонентные объекты, такие как почва, бытовые и промышленные отходы (Латыпова с соавт., 2002; Malkomes, 2006).
Одно из перспективных направлений в оценке плотных многокомпонентных сред -микробные тесты (Abbondanzi et al, 2003; Van Beelen, 2003; Kookana et al., 2004; Hinojosa et al., 2004; Rajapaksha, 2004). Наиболее разработаны методы, основанные на оценке аборигенной микрофлоры, которые являются достаточно простыми и чувствительными к токсикантам (Хазиев, 2005; Moreno et al., 2006; Sauve, 2006; Palmroth et al. 2006). Однако при интерпретации результатов зачастую возникают проблемы, связанные с отсутствием незагрязненного образца, идентичного анализируемому. Альтернативой указанным методам являются методы биотестирования, основанные на оценке ответной реакции интродуцированной микрофлоры (Ronnpagel et al., 1998; Athiainen et al., 2002). В настоящее время разработано большое количество таких тестов, включая ряд коммерческих, однако в основном они предназначены для оценки токсичности водных образцов (Kapanen, Itavaara, 2001; Селивановская, 2004; Classens et al., 2006). В случае же тестирования плотных образцов обязательная процедура - это получение водного экстракта (ISO 10712: 1995 (Е), 1995; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.3-99, 1999; ФР. 1.39.2003.00923, 2003; Plaza, 2005; Fjallborg, 2006). Однако результаты, полученные на водных экстрактах, могут недоучитывать тип и количество
5 загрязняющих веществ (Roenpagel et al., 1998; Alonso, 2006). Кроме того, общая проблема
методов биотестирования - это отсутствие адекватного подхода к математическому
описанию результатов экспериментов.1
Минимизировать недостатки обоих подходов может использование методов контактного биотестирования. В настоящее время такие методы разработаны в основном для высших растений и животных (Feisthauer, 2005; Moreno, 2006), тогда как методы с использованием микроорганизмов - основных агентов круговоротов элементов - в России отсутствуют, а в Европейском Союзе и США находятся в стадии разработки. Перспективным, на наш взгляд, в качестве тест-объекта использовать микроорганизмы, относящиеся к роду Bacillus, которые являются типичными представителями микрофлоры плотных сред, в частности, почв, а в качестве тестовой функции рассматривать активность фермента дегидрогеназы, отражающего общую метаболическую активность клеток.
Цель данной работы - разработка метода контактного микробного биотестирования для оценки токсичности многокомпонентных плотных объектов.
Задачи исследования.
Выбрать в качестве тест-объекта штамм, обладающий максимальной дегидрогеназной активностью и высокой чувствительностью к токсикантам, и осуществить его видовую идентификацию с использованием методов молекулярной биологии на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК.
Разработать методику контактного биотестирования и определить метрологические
параметры методики - прецизионность, повторяемость и интервалы концентраций
стандартных токсикантов (Сг+6, Cd+2), вызывающих 50% ингибирование тест-функции
(ЕС50), в водных и почвенных образцах.
' Соруководитель работы в области математического моделирования - д.б.н., к.ф.-м.н., профессор Савельев А.А.
Определить адекватную математическую модель, описывающую результаты анализа водных и почвенных образцов различными методами биотестирования и методом оценки аборигенной микрофлоры.
Определить токсичность модельных почвенных образцов, загрязненных металлами, их смесью и органическим токсикантом, методом оценки активности аборигенной микрофлоры, методом контактного биотестирования с использованием Bacillus pumilus, методами элюатного биотестирования с использованием В. pumilus, инфузории Paramecium caudatum и ветвистоусого рачка Ceriodaphnia affinis и оценить чувствительность методов анализа
Разработать ранжировочную систему для отнесения промышленных и бытовых отходов к классам опасности и установить токсичность образцов промьппленных отходов для В. pumilus, P. caudatum и С. affinis.
Научная новизна. Впервые предложена методика контактного биотестирования с использованием дегидрогеназной активности бактерии В. pumilus КМ-21 для оценки опасности плотных объектов (почв и отходов). Стандартизированы условия культивирования тест-объекта, подготовки его к тестированию и операционные параметры реакции. Определены метрологические характеристики методики биотестирования - прецизионность, повторяемость и диапазон концентраций стандартных токсикантов (Cr*6, Cd+2), вызывающих 50%-ный ответный отклик тестового параметра (ЕС50).
Впервые проведен сравнительный анализ пяти математических моделей зависимости «концентрация токсиканта - эффект» и показано, что наиболее адекватно описывает реальные результаты кинетическая модель неполного ингибирования.
Впервые на основе изучения различных способов определения токсичности почвенных образцов, искусственно загрязненных индивидуальными металлами, их смесью и органическим токсикантом, установлено, что разработанная методика контактного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21 по чувствительности сопоставима с
7 тестированием на основе аборигенной микрофлоры и превосходит метод элюатного
биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21. Результаты контактного теста более
тесно коррелируют с результатами теста с аборигенной микрофлорой по сравнению с
элюатным тестом.
Впервые с использованием разработанной методики определены границы токсичности отходов, позволяющие ранжировать их по классам опасности. Продемонстрировано, что контактный тест с использованием В. pumilus КМ-21 дает возможность выявить большее количество отходов, относящихся к 2 и 3 классам опасности по сравнению с используемыми в настоящее время элюатными тестами на основе низших ракообразных С. affinis и простейших P. caudatum.
Практическое значение работы. По результатам проведенных исследований разработана, стандартизирована и подготовлена к аттестации в органах Госстандарта методика определения токсичности плотных объектов с использованием бактерии В. pumilus КМ-21. Предлагаемая методика опробована для определения токсичности реальных образцов промышленных отходов, образующихся на предприятиях г. Казани. Методика передана на апробацию в Центральную специализированную инспекцию аналитического контроля при МЭПР РТ и в Центральную заводскую лабораторию ОАО «КЗСК». Результаты исследований используются при проведении практических работ по курсам «Экологическое нормирование» и «Управление в обращении с отходами» на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета (КГУ), а также включены в учебное пособие «Теория и методы экологического нормирования» (2006), рекомендованное для обучения студентов и аспирантов экологического факультета КГУ.
Результаты, полученные в исследованиях, могут быть использованы для совершенствования системы почвенного мониторинга и при разработке мер по минимизации негативного влияния промьппленных отходов на окружающую среду.
8 На защиту выносятся следующие положения:
Разработанная методика контактного биотестирования плотных объектов (почв и отходов) с использованием дегидрогеназной активности бактерии В pumilus КМ-21 является более чувствительной в отношении ряда металлов, их смеси и органического токсиканта по сравнению с элюатнои методикой с использованием того же тест-объекта и сопоставима по чувствительности с методикой на основе тестирования аборигенной микрофлоры.
Установленные метрологические характеристики методики биотестирования (презиционность и диапазон ЕС50 стандартных токсикантов), а также стандартные условия ее проведения позволяют рекомендовать методику для использования в различных лабораториях и получать сравнимые результаты.
Для всех трех вариантов тестирования (контактное, элюатное биотестирование и оценка активности аборигенной микрофлоры) зависимость «концентрация токсиканта -вызываемый эффект» наиболее адекватно описывается кинетической моделью неполного ингибирования.
Предложенный способ создания «суррогатного» контрольного образца дает возможность оценить степень негативного воздействия токсикантов в природных образцах и отходах при отсутствии идентичных незагрязненных образцов.
Установленные границы токсичности, определяемые с использованием предлагаемой методики, позволяют ранжировать отходы по классам опасности для биологических объектов окружающей среды.
Апробация работы. Материалы работы изложены на II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2004), VI республиканской конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2004), Международных молодежных конференциях «Туполевские чтения» (Казань, 2004, 2005), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской
9
Iі научно-практической конференции «Современные проблемы аграрной науки и пути их
решения» (Ижевск, 2005), Всероссийской научной конференции «Современные аспекты
экологии и экологического образования» (Казань, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Личный вклад автора в работу состоит в выполнении экспериментальной части диссертации, обсуждении результатов и формулировании выводов на их основе. Соавторами публикаций являются научный руководитель д.б.н. Селивановская С.Ю., д х.н., профессор, заведующий кафедрой прикладной экологии Латыпова В.З., сотрудники Гиссенского Университета (ФРГ) профессора Hummel Н., Duering R-A. и Gaeth S., сотрудник Кливлендского университета (Огайо, США) профессор Hung Y-T., участвовавшие в обсуждении результатов В создании программы для математической обработки результатов принимали участие д.б.н., профессор Савельев А.А. и к.х.н., с.н.с. Семанов Д А.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 151 странице; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 34 рисунка, 15 таблиц. Список литературы содержит 47 отечественных и 249 зарубежных источников.
*
class1 Обзор литературы. Оценка токсичности индивидуальных веществ, состояния
почв и плотных антропо-генных образований с использованием микроорганизмов. class1
Методы биотестирования
Основой методов биотестирования является применение генетически однородной лабораторной культуры живых организмов для оценки качества природных и антропогенных объектов, в результате чего полученные результаты возможно сравнивать между собой. Несомненное преимущество методов биотестирования - возможность их применения для оценки токсичности образцов с неразвитой аборигенной микрофлорой, например обедненных песчаных почв или промышленных и бытовых отходов. Последнее обстоятельство имеет огромное значение, так как контроль состояния плотных многокомпонентных объектов является одним из важных этапов природоохранного управления (Ronnpagel et al., 1998; Kapanen, Itavaara, 2001; Латыпова с соавт., 2002; Селивановская, Латыпова, 2004; Davoren, Fogarty, 2004; Jiangning et al., 2004; Malkomes, 2006).
В зависимости от времени экспозиции методы биотестирования подразделяют на кратковременные (острые) тесты и долговременные (хронические). Острая токсичность, проявляющаяся в непосредственном воздействии токсиканта на тест-объект, определяется в опытах, длительность которых не превышает 96 часов, а определяемым параметром чаще всего является смертность. Острая токсичность выражается в LC50 или ЕС50, что означает 50%-ную гибель тест-организмов при определенном времени экспозиции или изменение на 50% оцениваемого параметра. Опыты с определением хронической токсичности применяются для оценки долговременных эффектов, которые, чаще всего, не ведут к гибели тест-объекта Хроническая токсичность отражает возможный суб-летальный экологический эффект и определяется как долговременный тест, в котором определяются суб-летальные эффекты, такие как рост, репродукция и т.д. Традиционно хронические тесты должны охватывать полный жизненный цикл, однако большинство тестов, рекомендованных Агентством по охране окружающей среды (ЕРА), укорочены до 7 суток и фокусируются на наиболее чувствительных ранних стадиях развития. Показателем, оцениваемым в хронических тестах, является NOEC (no observed effect concentration, или максимально недействующая концентрация) (Sloof, 1992; van Straalen, Denneman, 1989; Hoekstra, van Ewyk, 1993) или LOEC (наименьшая концентрация токсиканта, вызывающая эффект или минимальная действующая концентрация) или концентрация, вызывающая наблюдаемый эффект у определенного процента тест-организмов (например ЕС і о или ЕС50) (Burns, 1978; Kooijman, 1987; Edwards et al., 1996, 1998; van Beelen et al., 2001; Plaza et al., 2005b; Malkomes, 2006).
В последнее время получили распространение тесты с использованием микроорганизмов, воплощенные в виде коммерческих продуктов, применение которых не требует дополнительных лабораторных работ и гарантирует достоверность получаемых результатов (табл. 1.1) (Сазонова с соавт., 1997; Knoke et al, 1999; TU Hamburg-Harburg, 1999; Kapanen, Itavaara, 2001; Burrows, Edwards, 2002; Kuperman et al., 2002; Bloehm, Breure, 2003; van Beelen, 2003; Selivanovskaya et al., 2004; Classens et al., 2006). В этой же таблице представлены коммерческие тесты на основе беспозвоночных, простейших и растений.
Биотестирование водных образцов
Перед исследованием почвенные образцы увлажняли до 60-80% от общей влагоемкости и инкубировали в течение 7 суток при комнатной температуре.
Тестирование проводили аналогично процедуре, описанной в п. 2.2.1.1, при этом 1 мл культуры (или стерильной питательной среды - в слепой пробе) не добавляли. В качестве слепой пробы использовали вариант, где 1 мл ТТХ заменен на 1 мл дистиллированной воды. Расчет относительной дегидрогеназнои активности проводили относительно незагрязненной почвы (почвенного контроля).
Методика основана на определении смертности парамеций (Р caudatum) при воздействии токсических веществ, присутствующих в исследуемой пробе, по сравнению с контролем (ФР. 1.39.2003.00923).
Тестированию подвергали водные экстракты искусственно загрязненных почвенных образцов и промышленных отходов, приготовленных согласно п. 2.2.1.3.
Острое токсическое действие исследуемой пробы на парамеций определяли по их смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности служила кратность разведения экустрактов из почвенных образцов, при которой гибель тест-организмов не превышала 10% (Крю).
Определение токсичности каждой пробы без разбавления и каждого разбавления проводили в трех параллельных сериях. В качестве контроля использовали три параллельных серии с культивационной водой.
Для биотестирования использовали микроаквариум с лунками, который помещался на предметный столик стереомикроскопа. Одну из лунок заполняли культурой инфузорий с помощью капиллярной пипетки. В свободные лунки капиллярной пипеткой помещали по 10-12 особей в каждую лунку, так, чтобы на одну тестируемую пробу приходилось не менее 30 инфузорий в трех лунках. При помещении тест-объекта количество культуральной жидкости в лунке не превышало 0,02 мл. После помещения инфузорий контрольные лунки наливали по 0,3 мл культивационной воды, в опытные - по 0,3 мл тестируемой пробы. Микроаквариум с заполненными лунками помещали в чашку Петри, на дно которой помещена фильтровальная бумага, смоченнря водой, чтобы не испарялось содержимое лунок, и выдерживали в течение 1 часа при температуре 22-24С. По истечении этого времени производили подсчет выживших и погибших особей под микроскопом. Выжившими считали инфузорий, которые свободно перемещаются в толще воды. Обездвиженных особей относили к погибшим.
Для оценки острой токсичности пробы рассчитывали процент погибших парамеций (А,%): тестируемой воде через 1 час. Крю оценивали по линейному участку зависимости, построенной в координатах In концентрации элемента - процент погибших парамеций методом наименьших квадратов. Биотестирование объектов с использованием Ceriodaphnia affinis
Методика основана на определении смертности ветвистоусых рачков С. affinis при воздействии токсических веществ (ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.3-99,1999). Тестированию подвергали водные экстракты искусственно загрязненных почвенных образцов и промышленных отходов, приготовленных согласно п. 2.2.1.3.
Биотестирование проводили в химических стаканах объемом 150-200 см3, которые заполняли 100 см исследуемой пробы, в них помещали по десять дафний не более 24-часового возраста (разница между возрастом рачков не более 8 часов, что определяли по размеру рачков). Дафний отлавливали из культиваторов, в которых выращивалась синхронизированная культура. Посадку рачков начинали с контрольной серии. В исследуемые растворы дафний помещали, начиная с больших разбавлений к меньшим разбавлениям.
Учет смертности дафний в опыте и контроле проводили через каждый час до конца первого дня опыта, а затем 2 раза в сутки ежедневно до истечения 96 часов. Неподвижные особи считали погибшими, если они не начинали двигаться в течение 15 секунд после легкого покачивания стакана. Если гибель дафний в контроле превышала 10%, результаты опыта не учитывали и опыт повторяли.
Ростовые характеристики бактерий рода Bacillus
Для разработки теста на токсичность на первом этапе необходимо было выбрать микроорганизм, который бы служил тестовым организмом. В большом количестве публикаций сформулированы требования, предъявляемые к тест-организмам (Bloem, Breure, 2003; Seco et al, 2003; Alonso et al., 2006; Hansen et al., 2006). Во-первых, тест-объект должен являться представителем организмов того сообщества (биоценоза), на которое оказывает воздействие токсикант. Это позволяет получить данные, наиболее адекватно отражающие реальную ситуацию, а также свести к минимуму ошибки при экстраполяции данных, полученных в биотестировании. К числу других требований к тест-объекту относятся экспрессность анализа, простота культивирования и возможность поддержания генетически однородной культуры тест-объекта, что позволяет получить большое количество стандартных особей для биотестирования и осуществить статистическую оценку достоверности полученных результатов. Кроме этого, для включения в систему биотестов при его практическом использовании тест-организм должен быть хорошо изучен В качестве такого организма нами рассматривались бактерии, относящиеся к роду Bacillus Тест-параметром, на основании изменения которого предполагалось судить о токсичности, служила дегидрогеназная активность. Выбор бактерий этого рода был обусловлен тем, что, во-первых, бациллы являются характерными обитателями почв, представляющих собой плотную среду, во-вторых, они играют существенную роль в круговороте биогенных элементов, в-третьих, данные микроорганизмы располагают ферментом дегидрогеназой, причем уровень этого фермента у бацилл достаточно высок (Ronnpagel et al., 1995; Abbondanzi et al., 2003; Хазиев, 2005). В пользу использования в качестве тест-параметра активности фермента дегидрогеназы свидетельствовало то, что согласно данным литературы, активность фермента дегидрогеназы у микробов является адекватным показателем их метаболической активности (Moreno et al, 2002, 2006). Фермент дегидрогеназа осуществляет окисление органических веществ в анаэробных и аэробных условиях, осуществляя перенос электронов и протонов от окисляемого вещества к промежуточному акцептору, в процессе которого осуществляется фосфорилирование с образованием АТФ, и, по существу, этот фермент является ключевым в функционировании редуцентов.
На первом этапе было проведено изучение ростовых характеристик, уровня дегидрогеназной активности и чувствительности этого параметра к стандартным токсикантам у 9 штаммов бактерий, относящихся к роду Bacillus
Как видно из данных рис.3.1, кривые роста изучаемых микроорганизмов на L-бульоне имели классическую форму и были очень похожими, что объясняется их принадлежностью к одному роду. Штаммы завершают лаг-фазу роста на 12-15 час от начала инкубирования. Максимальная микробная биомасса, выражаемая в единицах оптической плотности, при достижении стационарной фазы составила 1,12, 1,15, 1,36, 1,12, 1,60, 1,44, 1,27, 1,36, 1,35 опт.ед у штаммов Bacillus sp. КМ-5, Bacillus sp КМ-15, Bacillus sp KM-22, Bacillus sp KM-3F, Bacillus sp KM-21, Bacillus sp KM-4F, Bacillus sp KM-13, Bacillus sp KM-6 и Bacillus sp KM-34 соответственно. Исходя из того, что максимальная дегидрогеназная активность наблюдается у клеток, находящихся в третьей части экспоненциальной фазы роста (Abbondanzi et al., 2003; Brandt et al., 2006), нами было определено время инкубирования культур микрооорганизмов, при котором в дальнейшем производили оценку уровня дегидрогеназной активности. Согласно построенным кривым роста это время составило 40, 39,40,42, 33,36, 39,34 и 40 час для штаммов Bacillus sp KM-21, Bacillus sp KM-5, Bacillus sp KM-34, Bacillus sp KM-3F, Bacillus sp. M-16, Bacillus sp. KM-22, Bacillus sp KM-4F, Bacillus sp KM-13 и Bacillus sp KM-6 соответственно.
