Содержание к диссертации
Введение
Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
I. Полимерные микросферы как носители биолигандов 8
1.2. Ковалентная иммобилизация биолигандов на поверхность полимерных носителей^ 17
1.3. Создание тест-систем на основе
полимерных микросфер . 29
1.4.Свойства полимерных микрочастиц в тонком слое на межфазных границах 38
Глава II ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
II. 1 Исходные вещества 51
И.2. Методы исследования 52
П.2.1. Получение полимерных суспензий в реакторе 52
11.2.2. Активация карбоксильных групп карбодиимидом 54
11.2.3. Ковалентное связывание биолигандов с функциональными группами полимера, расположенными на поверхности полимерных микросфер 55
П.2.4.Иммобилизация протеина А на поверхность полимерных микросфер ...55
Н.2.5.Иммобилизация антител на поверхность полимерных микросфер через спейсор-протеин А 55
П.2.6. Реакция латексной агглютинации 56
ІІ.2.7. Реакция нейтрализации антител (торможения) 56
П.2.8. Метод фотон-корреляционной спектроскопии 57
II.2.9. Метод весов Ленгмюра. Метод получения изотерм двумерного давления 2D пленок 60
Глава III РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 65
ВЫВОДЫ 145
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 147.
- Полимерные микросферы как носители биолигандов
- Получение полимерных суспензий в реакторе
- Реакция латексной агглютинации
Введение к работе
Проблема индикации загрязнения внешней среды продуктами биологического происхождения возникла на этапах открытия возбудителей инфекционных болезней. Экологический аспект ее в начале не выходил за рамки эпидемиологии и эпизоотологии. Методологически она решалась путем выделения из объектов внешней среды самого возбудителя и последующей его идентификации.
С развитием общества загрязнение среды биополлютантами возрастало. Необходимы были специфические методы их индикации. Именно тогда пришлось обратиться к накопленному опыту в области биологической защиты. Было показано, что серологические реакции, визуализация которых основана на эффекте агглютинации, являются наиболее удобными для проведения мониторинга окружающей среды на присутствие определенного биологического компонента в ней. Распространение получили тест-системы, работающие по принципу реакции агглютинации, в которых в качестве носителей биолигандов использовали эритроциты. Однако при их использовании трудно было выполнить основное условие: носитель должен был быть инертным в серологической реакции. Такое условие не всегда может быть соблюдено, поскольку на эритроцитах имеются антигенные детерминанты, к которым в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела.
Это обстоятельство побудило исследователей перейти на синтетические носители, где иммунологический феномен неспецифической агглютинации полностью исключается. Кроме того, использование функциональных полимерных носителей позволило расширить варианты иммобилизации биолигандов на поверхности полимерных микросфер за счет ковалентного связывания функциональных групп полимера и биолиганда.
До настоящего времени не было проведено достаточно глубоких исследований фундаментального характера, позволяющих представить физико-химические процессы, протекающие на поверхности носителя, на всех
этапах приготовления диапюстикума и при выполнении непосредственно серологической реакции. Это в свою очередь не позволяет выдвигать четкие требования к параметрам полимерных микросфер, пригодных для создания диагностикума. В связи с этим подбор таких полимерных суспензий до настоящего времени осуществляется эмпирически.
В настоящей работе сделана попытка подойти к проблеме конструирования антительных диагностикумов, предназначенных для решения различных экологических задач, с позиций изучения состояния межфазного слоя полимерных микросфер на всех стадиях получения тест-систем, начиная с исходной суспензии.
Важным вопросом в этой проблеме до настоящего времени остается продукция токсина популяцией С. tetani, находящейся в различных экологических нишах. Создание антительного диагностикума в этой ситуации позволило бы решить вопрос о контроле токсинопродукции в динамике технологического процесса и выборе приемов его оптимизации.
Не менее важным вопросом, в решении которого антительный диагностикум мог бы выступать в роли инструмента, является формирование уропатогенных вариантов кишечной палочки.
Исходя из этого, целью настоящей работы было: Создание антительных тест-систем для мониторинга биополлютантов и Tamm-Horsfall протеина.
Основные задачи исследования.
1.Выбрать способ иммобилизации антител различной специфичности на поверхность полимерных микросфер.
2.0ценить изменение коллоидно-химических свойств исходных полимерных суспензий и тест-систем в процессе их создания.
3. Изучить влияние состава биолигандов на чувствительность и специфичность реакции латексной агглютинации.
Научная новизна.
В целях решения проблемы охраны безопасности жизнедеятельности человека созданы новые тест-системы для обнаружения столбнячного и дифтерийного токсина, являющихся причиной тяжелых заболеваний и высокочувствительная тест-система для определения Tamm-Horsfall протеина, позволяющая выявлять механизмы формирования уропатогенной популяции микробов из кишечного биоценоза.
Впервые прослежено изменение коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в процессе получения тест-систем (^-потенциал, диаметр, распределение частиц по размерам, параметры изотерм двумерного давления 2D пленок) и показано, что качество полученных тест-систем существенно зависит от времени хранения полимерной суспензии и от чистоты биолиганда.
Сопоставительный анализ различных способов иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер показал, что чувствительность антительных тест-систем, полученных при связывании биолигандов с полимерными микросферами через спейсор, протеин А, выше, чем при непосредственном связывании функциональных групп полимера и биолиганда.
Установлено, что при создании тест-систем на стадии иммобилизации биолиганда необходимо использовать сыворотки и иммунореагенты, не содержащие примесей поверхностно- активных веществ.
Впервые было проведено методом Ленгмюра систематическое исследование поверхностных свойств полимерных микросфер (исходных и на различных стадиях производства тест-систем), и показана их зависимость от времени хранения полимерных микросфер и чистоты биолиганда.
Практическая значимость.
1. Сформулированы требования к полимерным суспензиям и к
сывороткам биолигандов для получения эффективных тест-систем.
Показано, что антительные тест-системы для определения столбнячного и дифтерийного токсинов и Tamm-Horsfall протеина обладают высокой диагностической эффективностью.
Составлен лабораторный регламент получения тест-систем.
Положения, выносимые на защиту.
Результат исследования коллоидно-химических свойств полимерных суспензий, полученных затравочной полимеризацией стирола, стиролсульфоната натрия и акролеина, и их изменение на всех стадиях получения тест-систем и в процессе хранения.
Влияние способа иммобилизации на чувствительность тест-систем.
Зависимость чувствительности тест-систем от чистоты биопрепарата.
Лабораторный регламент получения тест-систем для определения Tamm-Horsfall протеина, столбнячного и дифтерийного токсина.
Полимерные микросферы как носители биолигандов
Радикальная гетерофазная полимеризация является наиболее распространенным способом получения полимерных суспензий, широко используемых в медицине, биологии и биотехнологии [1-12].
Основными требованиями, которые в этом случае должны удовлетворять полимерные частицы - это биологическая, химическая и коллоидная устойчивость в физиологических жидкостях, узкое распределение частиц по размерам, возможность образования прочной связи между функциональными группами биолигандов и полимера частиц суспензий.
Носители биолигандов могут быть разделены на две большие группы. Одна из них представляет собой биодеградируемые объекты- бактерии, липосомы, химически модифицированные эритроциты, крахмальные шарики и др., а другая недеградируемые — активированный уголь, коллоидное золото, эмульсии парафинового масла, покрытого альбумином, полимерные микросферы, стеклянные шарики.
Каждая из этих групп характеризуется специфическими свойствами, определяющими область их применения. Следует отметить, что биодеградируемые носители, как правило, имеют природное происхождение и трудно поддаются контролю, в то время как синтетические объекты стабильны и являются контролируемыми, т.е. могут быть охарактеризованы по заряду, химическому строению, гидрофильно-липофильному балансу и т.д.
Среди синтетических носителей особенно перспективны полимерные микросферы, которые могут быть синтезированы с узким распределением по размерам в широком интервале диаметров, что важно для получения высокочувствительных диагностических тест-систем. Однородность частиц по размерам дает определенное преимущество для использования их в диагностических реакциях, так как позволяет достаточно точно определить площадь поверхности носителя белковых молекул и установить степень ее покрытия антигеном или антителом. Кроме того, она обусловливает сходный характер их поведения во время биохимической реакции, что облегчает "прочтение" результатов реакции.
Основными требованиями к полимерным суспензиям, используемым в биотехнологии, являются:
-Монодисперсность полимерных микросфер (однородность по заданному размеру). К полимерным суспензиям с узким распределением частиц по размерам (РЧР) относят суспензии, содержащие частицы полимера строго сферической формы, при чем отклонение диаметров частиц от среднего значения составляет 1-3% для частиц с диаметром 0.1-10 мкм и 10-30% для частиц с диаметром менее О.Обмкм и более 10 мкм [13-15].
В зависимости от метода учета иммунохимических реакций применяются монодисперсные микросферы с размерами от 0.1 до 10.0 мкм. При использовании в качестве методов учета спектрофотометри и, турбодиметрии, нефелометрии требуются частицы с размерами 0.1- О.Змкм, которые не оседают длительное время и позволяют получать линейные калибровочные зависимости для количественной оценки результатов исследования.
Диаметр частиц для иммунохроматографических и фильтрационных методов анализа определяется размером пор используемых мембран и фильтров.
Постановка иммунохимической реакции в капле на предметном стекле с визуальным учетом результата анализа возможна при размере полимерных частиц 0.5-5 мкм. Крупные частицы диаметром 2-10 мкм, соизмеримы с клетками, в частности с форменными элементами крови (тромбоциты, эритроциты, лимфоциты), позволяют моделировать иммунологические процессы с их участием, а также проводить визуальный учет результатов иммунохимического анализа по оседанию частиц в лунках иммунологических планшетов [13-15].
Наиболее широко используются монодисперсные частицы субмикронного размера, поскольку их суспензии седиментационно устойчивы.
-Полимерные микросферы должны содержать на поверхности функциональные группы. Наличие поверхностных функциональных групп [13,15] необходимо для гидрофилизации поверхности, что должно способствовать уменьшению неспецифического взаимодействия полимерной подложки иммунореагента с биолигандом. При ионизации этих групп образуется поверхностный заряд частиц, который способствует повышению агрегативной устойчивости полимерных суспензий. Функциональные группы на поверхности полимерных микросфер позволяют также осуществить ковалептное связывание биолигандов. В частности, они обеспечивают прочное присоединение к микросферам небольших пептидов, лекарственных веществ, гормонов и нуклеотидов, которые не могут быть связаны адсорбционно из-за слабой гидрофобности.
- К частицам, используемым в иммунохимических реакциях, результат которых определяется по скорости оседания агрегатов полимерных частиц, могут предъявляться специальные требования, связанные с плотностью полимера. Так, частицы полиметилметакрилата (р=1Л9г/см3) или полиакролеина (р=1.30 г/см3) оседают в водной среде значительно быстрее, чем частицы полистирола (р=1.06 г/см ).
При определении результатов оптическими методами [16] требуются частицы с меньшей величиной показателя преломления (nD). Так, частицы поливинилнафталина (nD=1.6S) или полистирола (nD=1.59) [16,17] сильнее рассеивают свет, по сравнению с микросферами полибутилметакрилата (nD = 1.43) и полиметилметакрилата (nD=1.49) [18].
Получение полимерных суспензий в реакторе
Раствор карбодиимида в концентрации 1мг/мл готовили в дистиллированной воде. Полимерную суспензию разводили дистиллированной водой до концентрации 0,5%. Смешивали равные объемы 0,5% полимерной суспензии и раствора карбодиимида. Полученную суспензию инкубировали в течение ЗОминут при комнатной температуре. От избытка карбодиимида полимерные микросферы отмывали дистиллированной водой, трижды центрифугируя суспензию при 4000об/мин по 15мин. Суспензию разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до 0,5% по сухому остатку.
2.2.3. Ковалентная связывание биолигандов с функциональными группами полимера, расположенными на поверхности полимерных микросфер.
0,5% полимерную суспензию в ФСБ смешивали с равным объемом раствора биолиганда (с различной концентрацией). Полученную суспензию инкубировали в течение шести часов при температуре 37,2С. Несвязавшийся биолиганд отмывали фосфатно-солевым буфером (рН=7,2), трижды центрифугируя суспензию при 4000об/мин по 15мин. Суспензию разводили ФСБ до 0,1% по сухому остатку.
Раствор протеина A S. Aureus (штамма cowan 1) различной концентрации готовили в ФСБ, с добавлением 0Д5М хлорида натрия. Полимерную суспензию разводили ФСБ до концентрации 0,5%, Смешивали равные объемы 0,5% полимерной суспензии и раствора белка А. Полученную суспензию инкубировали в течение 12 часов при температуре 37,2"С. От избытка белка полимерные микросферы отмывали ФСБ (рН=7,2), трижды центрифугируя суспензию при 4000об/мин по 15мин. Суспензию разводили ФСБ до 0,1% по сухому остатку.
В реакции латексной агглютинации определяли сенсибилизирующую дозу иммунной сыворотки по предельному разведению, при котором не происходит агрегации частиц. К определенному объему 0,1% полимерной суспензии, частицы которой предварительно были модифицированы протеином А» добавляли равный объем сыворотки в субагглютинационном титре и систему выдерживали в течении 2 часов при 37С. Через два часа модифицированные полимерные микросферы отмывали от неприсоединившихся к ним сывороточным антителам, центрифугируя раствор дважды по 15 мин при 4000 об/мин, и фосфатно-солевым буфером (рН=7,2) полимерную суспензию разводили до концентрации - 0,1% по сухому веществу..
Интересное исследование, имевшее целью изучить монослои Ленгмюра, состоящие из магнитных наночастиц, было представлено в работе [132]. В качестве объекта были взяты частицы магнетита (y-Fe203). Для изменения гидрофильно-липофильных свойств данной системы использовали модификатор поверхности твердых частиц - лауриновую кислоту. Для исследования были использованы монодисперсные частицы с диаметрами: 7.5, 11 и 15.5 нм. Для более маленьких частиц изотермы обнаруживают плато нулевого давления, за которым следует резкое увеличение давления, когда А/А0 = 1 (где А0 - это площадь, приходящаяся на частицу, в идеальной плотно-упакованной решетке). Для более крупных частиц монослои менее сжимаемые, и изотермы стремятся к более высоким площадям. Электронная микроскопия нанесенных монослоев обнаруживает, что плотные, круглые, компактные участки образуются из наиболее маленьких частиц, тогда как наиболее крупные частицы организуются в длинные цепи. В этой системе притяжение между частицами состоит из взаимодействия Ван-дер-Ваальса и анизотропного магнитного дипольного взаимодействия, оба этих взаимодействия увеличиваются с размером частиц. Тогда, на первый взгляд, неожиданно наблюдать, что пленка из маленьких частиц, как, оказывается, является более сжимаемой, чем пленка из более крупных частиц, так как последние образуют системы с более высоким притяжением и, таким образом, должны бы быть более сжимаемые. Очевидное противоречие рассеивается, если рассматривают, что изотермы отражают поведение областей частиц и не отражают поведение отдельных частиц. Это изменяет ход зависимости, определяемой отношением величин магнитного и Ван-дер-Ваальсового взаимодействий 1 для частиц больших, чем 12 нм диаметром. Когда диполь-дипольные взаимодействия достаточно сильны, образуются сцепленные и более легко сжимаемые агрегаты с выстроенными линейно диполями, как и предполагалось. В противном случае, образуются более компактные агрегаты при доминировании изотропных взаимодействий. Аналогичное поведение можно ожидать и для поли стирол ьных частиц.
Подход к строению нанесенных пленок микрочастиц па межфазной границе с точки зрения теории фракталов был рассмотрен в работах [133,134]. В качестве объекта исследования были взяты монодисперсные силикатные частицы с диаметром 2 мкм. Их поведение изучалось на различных поверхностях раздела фаз жидкость/пар. В первом исследовании частицы были алкоксилированы посредством октанола или октадеканола, и их поведение на поверхности толуол/воздух наблюдалось с помощью видео-увеличивающей микроскопии и анализов снимков.
Выбор не содержащей воду жидкой фазы сводит к минимуму влияние электростатического воздействия, а алкильное покрытие позволяет коротко-диапазонным взаимодействиям частиц изменяться двумя способами: 1) изменением диапазона действия стерического отталкивания посредством изменения толщины покрытия и 2) контролем величины взаимодействия Ван-дер-Ваальса через изменения угла смачивания.
Непосредственно после распространения частицы образуют 2D пленку с существенным жидкокристаллическим порядком, со склонностью к образованию гексагональной упаковки. Со временем частицы начинают диффундировать на более дальние расстояния, и начинают формироваться кластеры. Они растут в размерах до тех пор, пока окончательно не образуется сетка больших частиц. В работе [134] силикатные частицы, подвергнутые реакции или с октан - или с октадецилтрихлорсиланом, исследовали на поверхностях или бензола, толуола, 1,4-диоксина, 2-метоксиэтанола и 1,2-дихлорэтана, или воды. Как результат различных контактных углов для разных жидкостей, было найдено, что размер гексагонально упорядоченных областей частиц (или плотность упаковки) уменьшается экспоненциально с увеличением энергии притяжения между частицами при контакте посредством увеличения контактного угла, измеренного в жидкости.
В открытой печати существует небольшое количество публикаций посвященных изучению поведения микрочастиц на легкоподвижных границах раздела фаз. Большинство из них описывают свойства микрочастиц различных оксидов, и только небольшая часть посвящена изучению полимерных микросфер. Большинство методологических подходов и математический аппарат описания свойств микрочастиц на границе раздела фаз выполняется для всех систем в независимости от их химической природы.
Реакция латексной агглютинации
В два ряда 96-луночной планшеты вносили 0,1% раствор альбумина в ФСБ. В первую лунку каждого ряда вносили 25мкл антигена и титровали его с шагом 2 до Юлунки планшета, оставляя 11 и 12 лунку только с раствором альбумина как контроль. Во все лунки первого ряда вносили по 25мкл сыворотки, а во все лунки второго ряда вносили по 25мкл раствора альбумина. Во все лунки планшета добавляли по 25мкл 0,1 % антительного диагностикума. Планшет встряхивали и оставляли при комнатной температуре. Реакцию учитывали через 12 часов. Антиген связывался специфическими антителами сыворотки, и титр реакции латексной агглютинации уменьшался. Метод фотон-корреляционной спектроскопии позволяет быстро и достаточно точно определять значение коэффициента трансляционной диффузии макромолекулярных частиц (Dt). Благодаря этому величину Dt можно использовать для определения структурных особенностей растворенных макромолекул в сочетании с данными независимых термодинамических и гидродинамических измерений [135,136].
Рассеяние света любым веществом происходит из-за возникновения микроскопических тепловых флуктуации показателя преломления 6 „ (г, t). В растворах высокомолекулярных соединений основной вклад в 5 й (г, t) дают флуктуации концентраций компонентов бс (г, t), обусловленные броуновским движением. В обычной схеме опыта интенсивность рассеянного света пропорциональна среднему значению квадрата флуктуации показателя преломления среды. Разность интенсивностей света, рассеянного раствором и растворителем, поэтому пропорциональна среднему значению квадрата флуктуации концентрации растворенного вещества.
Экспериментально определяется автокорреляционная функция интенсивности рассеянного света:
СС2 (т) = і (т)і(ЬНг) описывающая динамическое поведение рассеянного света (і) которая, определяется динамикой рассеивающих центров, т.е. характеристической связью величины і в момент времени t с ее величиной для более позднего момента времени t+т. Используя G(2)(T), можно рассчитать Dt.
В работе измерения методом фотон-корреляциошюй спектроскопии на фотометре рассеянного света КМХ-б/ДС фирмы "Milton Roy" и гониометре SP-81 ALV с источником света He-Ne лазер, длина волны света Х, = 633 нм. Автокорреляционная функция флуктуации интенсивностей рассеянного света определялась с помощью цифрового коррелометра "1096 Flangley Ford". Используя полученные значения коэффициента трансляционной диффузии рассчитывался их средний гидродинамический радиус в предположении, что эти частицы имеют сферическую форму, т.е. справедливо уравнение Стокса:
R = kT7(67rnD(0
Значения радиуса R микросферы, определенные методом фотон-корреляционной спектроскопии, как правило, на несколько процентов больше, чем значения радиусов, полученные другими методами. Это связано с тем, что, во-первых, внешняя поверхность микросферы может быть покрыта одним или более мономолекулярными слоями молекул растворителя, это может давать отклонения в 0,3-0,6 им. Во-вторых, различие с данными электронной микроскопии обусловлено возможной деформацией частиц в процессе приготовления образца для этого метода. В-третьих, метод фотон-корреляционной спектроскопии позволяет определить размер частиц с большой точностью, а ошибка в расчете R может возникать при использовании уравнения Стокса для систем с анизометричными частицами. Качественное сравнение методов определения размеров микросфер и их комплексов, приведенное в табл.1, дает возможность утверждать, что выбранный метод фотон-корреляционной спектроскопии является наиболее предпочтительным. Сравнение различных методов измерения радиусов микросфер.
