Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Экология и здоровье населения промышленного города 14
1.2. Влияние наиболее распространенных аэрополлютантов на организм человека 18
1.3. Современные представления о патогенезе бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 22
1.4. Роль фагоцитирующих клеток в формировании местного иммунитета бронхиального дерева 27
1.5. Роль фагоцитирующих клеток в патогенезе хронического воспаления при бронхообструктивных заболеваниях 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Эколого-географические особенности города Красноярска 45
2.2. Клиническая характеристика материала 52
2.3. Методы исследования 57
2.4. Статистические методы исследования 60
Глава 3. Показатели функциональной активности фагоцитов у лиц, проживающих в районах г. Красноярска с различной техногенной нагрузкой 61
3.1. Хемилюминесцентная активность фагоцитов крови и бронхиального дерева у жителей г, Красноярска 62
3.2. Функциональная активность фагоцитов крови и бронхиального дерева у жителей г. Красноярска в тесте фагоцитоза с латексом 69
3.3. Клеточный состав бронхиального смыва у пациентов с хронической обструктивной патологией легких и здоровых лиц, проживающих в разных районах г. Красноярска 71
Глава 4. Функциональная активность фагоцитирующих клеток у больных с хроническими обструктивными заболеваниями легких 79
4.1. Особенности клеточного состава бронхиальных смывов у больных с обструктивною патологией легких 79
4.2. Хемилюминесцентная активность фагоцитирующих клеток периферической крови у больных с обструктивной патологией легких 82
4.3. Хемилюминесцентная активность фагоцитирующих клеток бронхиального дерева у больных с хроническими обструктивными заболеваниями легких 86
4.4. Функциональная активность фагоцитирующих клеток у больных БА и ХОБЛ в тесте фагоцитоза с латексом 92
4.5. Особенности функциональной активности фагоцитирующих клеток бронхиального дерева у больных с различными нозологическими формами обструктивной патологии легких 95
Заключение 99
Выводы 113
Список литературы 115
- Влияние наиболее распространенных аэрополлютантов на организм человека
- Статистические методы исследования
- Функциональная активность фагоцитов крови и бронхиального дерева у жителей г. Красноярска в тесте фагоцитоза с латексом
- Хемилюминесцентная активность фагоцитирующих клеток периферической крови у больных с обструктивной патологией легких
Влияние наиболее распространенных аэрополлютантов на организм человека
Вредные вещества, попадая в организм даже в небольших количествах, нарушают его нормальную жизнедеятельность и могут привести к необратимым патологическим изменениям. Вредные вещества проникают в организм через дыхательные пути, через кожу и через пищеварительный тракт. Однако основной и наиболее опасный путь - через органы дыхания. Поверх-ность легочных альвеол - 90-100 м при их среднем растяжении. Толщина альвеолярных мембран 0,001-0,004 мм. Поэтому именно в легких имеются самые удобные условия для проникновения газов, паров и пыли в кровь [197].
Крупные промышленные предприятия краевого центра выбрасывают в атмосферу большое количество токсикантов [41]. Присутствующие в воздухе жилых территорий г. Красноярска вредные вещества в концентрациях, превышающих гигиенические нормативы, способствуют возникновению среди населения заболеваний восьми нозологических групп, в том числе онкологических заболеваний, заболеваний системы кровообращения, болезней органов дыхания, нервной системы, болезней крови и кроветворных органов [46, 59, 94]. Жители г. Красноярска испытывают максимальную нагрузку от действия вредных поллютантов через атмосферный воздух. Основные из них - формальдегид, диоксид азота, этилбензол, взвешенные вещества, оксид углерода (II) (табл. 1,2) [82].
Наиболее проблемной является ситуация с формальдегидом (CfyO, первый член гомологического ряда алифатических альдегидов, бесцветный газ с резким запахом). Это настоящий бич для воздуха практически всех городов. Источником образования формальдегида в городах главным образом является автомобильный транспорт, деревообрабатывающие предприятия, химическое производство (а предприятия именно этих отраслей промышленности сосредоточены на территории Ленинского района (рис. 3)). Негативное действие формальдегида обусловлено его высокой реакционной способностью, благодаря которой практически весь ингалируемый через дыхательные пути поллютант задерживается в легких [71]. Формальдегид оказывает общетоксическое действие на человека, обладая раздражающим воздействием и мощным аллергенным эффектом. У формальдегида также были выявлены канцерогенные и мутагенные свойства. Наибольшее число новообразований, вызываемых формальдегидом, связано с дыхательной системой человека. Наиболее часто он провоцирует развитие рака носоглотки, однако механизмы остаются неизвестными. Опасность формальдегида как генотоксического вещества не только в том, что он индуцирует соматические мутации, опасные для жизни организма, но и в том, что мутации накапливаются, передаются потомству и проявляются в последующих поколениях [3].
Оксиды азота также относятся к наиболее важным среди загрязняющих веществ, поступающих в атмосферу с антропогенными выбросами от промышленности и автотранспорта [109]. Образуются, в основном, в процессе сжигания органического топлива в виде оксидов азота, которые трансформируются в диоксид азота. Обычно одновременно рассматриваются концентрации оксида азота (N0) и диоксид азота (NO2) в атмосфере. Динамика концентраций оксидов азота в городском воздухе в течение суток тесно связана с интенсивностью солнечного излучения и движения транспорта. С нарастанием интенсивности автомобильного движения (с 6 до 8 часов утра) концентра ции первичного загрязнителя - оксида азота (N0) заметно увеличиваются. Восход солнца влечет за собой накопление в атмосфере диоксида азота (N02) вследствие фотохимического окисления оксида азота. Оксиды азота являются серьезными атмосферными загрязнителями в связи с их высокой токсичностью. При контакте оксидов азота с влажной поверхностью легких образуются HNO3 (азотная кислота) и HNO2 (азотистая кислота), поражающие ткань легких, что приводит к отеку легких и сложным рефлекторным расстройствам [176, 265, 266]. При отравлении оксидами азота в крови образуются нитраты и нитриты. Последние, действуя непосредственно на артерии, вызывают расширение сосудов и снижение кровяного давления. Попадая в кровь, нитриты препятствуют поступлению кислорода в организм, что приводит к кислородной недостаточности. П. Г. Бут с соавт. (2004) сообщают, что оксиды азота могут выступать в качестве кофактора и субстрата миело-пероксидазы, стимулируя ее активность [25]. Предположение подтверждают исследования, проведенные С. OIker с соавт. (2004), которые обнаружили, что ингаляции оксида азота у мышей повышают продукцию АФК клетками ЖБАЛ [227]. Таким образом, диоксид азота воздействует в основном на дыхательные пути и легкие, а также вызывает изменения состава крови, в частности, уменьшает содержание в крови гемоглобина, вызывает кислородное голодание тканей, обладает иммунодепрессивным свойством, оказывают провоспалительное действие [163, 266]. К числу последствий воздействия повышенных концентраций диоксида азота на население относятся: увеличение показателей общей смертности и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний; повышение частоты госпитализации по поводу обструктивных заболеваний легких, увеличение числа случаев острого инфаркта миокарда, а также повышение в общей популяции частоты симптомов заболеваний нижних и верхних дыхательных путей [93].
Статистические методы исследования
При аспирации получали 5-8 мл жидкости (бронхиальный смыв, БС). Забор БС осуществляли в сухую стерильную силиконизированную стеклянную посуду. Пластиковую посуду предпочитали исключить, так как по данным De-Solc и соавт, (1993), адгезия к пластику разнонаправленно изменяет показатели метаболического взрыва фагоцитирующих клеток [165]. По рекомендации 10. К. Дмитриева и соавт. [50] для получения суспензии клеток проводили отмывание от слизи: фильтровали через два слоя марли, для разделения клеточного и белкового компонента центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут на центрифуге ОС-6. Образовавшийся после центрифугирования супернатант удаляли, а к осадку, содержащему клеточные элементы, добавляли 3 мл раствора Хенкса. Осадок активно ресуспендировали в растворе Хенкса, избегая образования воздушных пузырьков, так как на границе раздела фаз «жидкость-воздух» происходит массовая гибель клеток. Полученную клеточную взвесь вновь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. К полученному после второго центрифугирования клеточному осадку повторно добавляли 3 мл раствора Хенкса, аккуратно ресуспендировали. Повторяли центрифугирование при 1500 об/мин в течение 10 минут. Полученный после третьего центрифугирования клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Хенкса. Общее количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Для этого к 180 мкл 3% уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим, добавляли 20 мкл клеточной взвеси. Полученной суспензией заполняли камеру Горяева и подсчитывали число лейкоцитов в 1 мл взвеси.
Жизнеспособность клеток оценивали по включению 0,1% трипано-вого синего. Количество окрашенных клеток не превышало 5%. Из полученной клеточной суспензии готовили цитологические препараты, окрашивали по методу Романовского-Гимзе. На 500 клетках мазка определяли процентное соотношение отдельных клеточных элементов (ней-трофилов, макрофагов, эозинофилов, лимфоцитов).
После определения количества клеток в суспензии концентрацию фагоцитов в суспензии доводили до 2 млн/мл раствором Хенкса. Поскольку амплитуда ХЛ-ответа нефагоцитирующих клеток крайне мала, мы пренебрегли их вкладом в ХЛ-ответ. В кюветах хемилюминометра готовили смесь для определения ХЛ-активности выделенных клеток. Реакционная смесь для хемилюминесцент-ной реакции состояла из 40 мкл пуловой донорской сыворотки группы AB„(IV), 100 мкл люминола в концентрации 10"5М, 50 мкл индуктора (для стимулированной пробы), 350 мкл раствора Хенкса и 500 мкл клеточной суспензии (конечная концентрация фагоцитов в пробе таким образом была постоянной и составляла 1 млн клеток). Оценка спонтанной и стимулированной хемилюминесценции производилась в течение 90 минут на аппаратно-программном комплексе, включающем PC-управляемый 36-канальный "Chemiluminometer 3604" (СКТБ «Наука», г. Красноярск) [107] и персональный компьютер. Определяли следующие характеристики: время выхода на максимум (Ттах) и максимальную интенсивность (Ima :) свечения клеток. В качестве индуктора дыхательного взрыва использовали опсонизированный донорской пуловой сывороткой зимозан («Sigma») в концентрации 20 мг/мл. Усиление хемилюминесценции, стимулированной зимозаном, оценивали с помощью индекса активации, являющегося соотношением Imax стимулированной пробы к Imax спонтанной пробы. Оставшуюся часть клеточной суспензии использовали для определения поглотительной активности фагоцитов в тесте фагоцитоза с латексом.
Для определения поглотительной активности фагоцитов крови и бронхиального смыва 100 мкл клеточной суспензии наносили на предметное стекло, предварительно тщательно обезжиренное в смеси Никифирова. В об разовавшуюся каплю вносили 50 мкл латексной суспензии. Диаметр латексних частиц - 1,5-1,6 мкм. Предметные стекла осторожно помещали во влажную камеру и инкубировали в термостате при 37С в течение 30 минут. По истечению времени инкубации предметные стекла аккуратно промывали физиологическим раствором, подогретым до 37С. Полученные таким образом препараты сушили на воздухе и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Время окраски не должно превышать 5 минут во избежание перекрашивания препаратов. Окрашенные препараты микроскопировали (окуляр 7, объектив 90) с использованием масляной иммерсии. В приготовленных препаратах подсчитывали процентное содержание фагоцитов, наполненных частицами латекса - фагоцитарный индекс. Результат выражали в процентах.
По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel 7,0 была сформирована база данных, на основе которой с помощью пакета прикладных программ "Statistica 7,0" производился статистический анализ. Для всех данных определяли среднее арифметическое значение (М), среднее квадратичное отклонение (s), ошибку средней арифметической (т). Проверку гипотезы о статистической достоверности различий двух выборок проводили с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [33]. Результаты статистической обработки сведены в таблицах и использованы в рисунках.
Функциональная активность фагоцитов крови и бронхиального дерева у жителей г. Красноярска в тесте фагоцитоза с латексом
Оценить поглотительную способность фагоцитирующих клеток можно с помощью теста фагоцитоза с латексными частицами. Фагоцитарный индекс (ФИ) как у фагоцитов крови, так и фагоцитов, выделенных из бронхиального смыва, у пациентов, страдающих хроническими бронхообструктивными заболеваниями ниже, чем в соответствующих контрольных группах. При сравнении ФИ бронхов у практически здоровых лиц, проживающих в разных районах г. Красноярска, было выявлено, что у жителей Советского района этот показатель достоверно превышает таковой у жителей Ленинского района города (рис. 8), в то время как ФИ крови достоверно не отличается. При сравнении ФИ крови и бронхов у пациентов, страдающих одной нозологической формой хронической бронхообструктивной патологии, но проживающих в разных районах г. Красноярска, нами установлено, что у пациентов с БА, проживающих в Ленинском районе города ФИ крови достоверно выше этого показателя, чем у жителей Советского района (рис. 9).
В ходе проведенного исследования нами были выявлены следующие особенности клеточного состава БС у здоровых жителей г. Красноярска, а также пациентов с хронической бронхообструктвной патологией, проживающих в районах города с разной степенью загрязненности воздушного бассейна.
У здоровых жителей г. Красноярска, проживающих в Советском районе города количество лейкоцитов в 1 мл бронхиального смыва достоверно превышает таковое у жителей Ленинского района (табл. 14, рис. 10).
Однако, при изучении качественного состава лейкоцитарной популяции бронхов, было выявлено достоверно повышенное количество нейтрофи-лов в бронхиальных смывах жителей Ленинского района (рис. 11). Таким образом, можно предположить, что несмотря на отсутствие достоверных отличий в функциональных характеристиках состояния фагоцитарного звена иммунной системы, у здоровых жителей г, Красноярска имеются количественные (число лейкоцитов в 1 мл бронхиального смыва) и качественные (процентное содержание нейтрофилов в бронхиальном смыве) изменения, связанные с различной техногенной нагрузкой на дыхательные пути.
Как видно из данных, представленных в таблице 14, количество лейкоцитов в 1 мл бронхиального смыва у пациентов с БА и ХОБЛ достоверно превышает таковое у здоровых лиц, проживающих в аналогичном районе. При этом содержание лейкоцитов у пациентов, страдающих БА и проживающих в Ленинском районе г. Красноярска, достоверно выше такового у жителей левобережного Советского района. Аналогичным образом этот показатель изменяется и у пациентов с ХОБЛ (рис. 12).
Хемилюминесцентная активность фагоцитирующих клеток периферической крови у больных с обструктивной патологией легких
В нашем исследовании мы проанализировали ХЛ-активность фагоцитирующих клеток в норме и при хронической обструктивной патологии легких вне зависимости от района проживания. При оценке основных показателей ХЛ-активности фагоцитирующих клеток - времени выхода на максимальное значение (Т) и максимума свечения (Imax) в двух параллельных пробах (спонтанной и стимулированной опсонизированным зимозаном), нами были выявлены следующие особенности.
При сравнении ХЛ-активности фагоцитирующих клеток периферической крови у пациентов с хронической обструктивной патологией легких и практически здоровых людей нами выявлено, что время достижения максимального значения в спонтанной и стимулированной пробе в обеих основных группах обследованных лиц достоверно не отличается (табл. 18), однако у пациентов с ХОБЛ и БА время выхода на максимум достоверно ниже, чем в группе контроля.
Исходя из полученных данных, можно предположить, что фагоциты периферической крови у пациентов с хронической обструктивной патологией легких находятся в состоянии повышенной функциональной активности (повышение спонтанного ХЛ-ответа), но не способны in vitro адекватно ответить на дополнительные стимулы (показатели стимулированного ХЛ-ответа близки к норме, а значения индекса стимуляции резко снижены). Следовательно, при дополнительной нагрузке в условиях внутренней среды организма (воздействие инфекционного агента или любого другого патогенного фактора), можно прогнозировать срыв функциональной активности фагоцитирующего звена, что в свою очередь может привести к неполноценному развитию иммунного ответа всего организма.
При анализе данных, полученных в результате исследования ХЛ-активности фагоцитирующих клеток периферической крови у пациентов с различными формами БА и с разной степенью тяжести обострения этого заболевания, мы не выявили достоверных отличий (табл. 19).
Согласно современным представлениям эффекторные клетки воспаления бронхов под влиянием этиологических факторов активируются и в сложной иерархии межклеточных взаимодействий определяют всю совокупность функциональных и морфологических проявлений хронических об-структивных болезней легких. Ключевая роль в поддержании хронического воспаления многими исследователями отводится именно фагоцитирующим клеткам. Поэтому представляется важным оценить функциональные способности фагоцитов непосредственно в очаге хронического воспаления - в нашем случае в бронхиальном дереве.
При исследовании ХЛ-активности фагоцитов бронхиального дерева мы обнаружили следующие особенности. Время достижения максимума ХЛ-активности фагоцитов в контрольной группе составляет 732,5 ± 220,1 секунд. У пациентов с хронической обструктивной патологией легких ХЛ-ответ наступает позже (табл. 20).
Интенсивность спонтанного ХЛ-ответа в контрольной группе составила 530,4 ± 95,8 усл. ед, У пациентов с ХОЗЛ этот показатель многократно повышен и составляет 3878 ± 1147 усл. ед. у пациентов с БА и 8886 ± 2672 усл. ед, -у пациентов с ХОБЛ (рис. 15). Таким образом, функциональная активность фагоцитирующих клеток в очаге хронического воспалительного процесса различной этиологии (в данном случае БА и ХОБЛ) значительно отличается, что дает дополнительные возможности для дифференциальной диагностики этих двух смежных заболеваний.
Интенсивность стимулированного ХЛ-ответа фагоцитирующих клеток бронхиального дерева также достоверно отличается в обеих исследованных группах по сравнению с контролем и при сравнении между собой. Так, если в контрольной группе показатель Imax стимулированной пробы составил 1401 ± 273 усл. ед., то в группе пациентов с БА этот же показатель составил 4804 ± 1284 усл. ед., а в группе пациентов с ХОБЛ - уже 19912 ± 4037 усл. ед. В то же время величина индекса стимуляции в контрольной группе самая высокая: 4,08 ± 1,03 (рис. 16). У пациентов с БА и ХОБЛ этот показатель достоверно снижен и составляет 2,16 ± 0,34 и 1,23 ± 0,11 соответственно, что свидетельствует о снижении функционального резерва фагоцитирующих клеток бронхиального дерева.
