Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Евтеева Надежда Ивановна

Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области
<
Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Евтеева Надежда Ивановна. Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.16 / Евтеева Надежда Ивановна; [Место защиты: Нижегор. гос. ун-т им. Н.И. Лобачевского].- Нижний Новгород, 2009.- 161 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/747

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 10

1. Условно-патогенные бактерии в природе. Экологические аспекты 10

1.1. Сапрофитическая природа возбудителей 10

1.2. Типы природных резервуаров бактерий 13

2. Возможные резервуары энтеробактерий в природе 16

2.1. Почва как среда обитания микроорганизмов 16

2.1.1. Влияние дождевых червей (Lumbricus terrestris L.) на почву 18

2.1.2. Видовой состав бактерий кишечной группы, встречающихся в почве 20

2.2. Муравьи и их гнезда 23

2.3. Растения как резервуары энтеробактерий в окружающей среде 25

2.3.1. Формирование эпифитной микрофлоры 25

2.3.2. Источники питания эпифитной микрофлоры 26

2.3.3. Состав микроорганизмов на надземных органах растений 29

2.4. Пчелы как резервуар энтеробактерий в природе 33

ГЛАВА 2. Материалы и методы 3 5

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 59

3.1. Поиск новых резервуаров энтеробактерий в природной среде 59

3.1.1. Пейзаж энтеробактерий в составе общей микрофлоры медоносных пчел

3.1.2. Анализ энтерофлоры медоносных растений 62

3.1.2.1. Исследование энтерофлоры липы сердцевидной 63

3.1.2.2. Исследование энтерофлоры цветов малины 65

3.1.2.3. Исследование энтерофлоры цветов одуванчика 67

3.1.2.4. Исследование энтерофлоры вегетативной части кипрея узколистного 68

3.1.2.5. Исследование микрофлоры вегетативной части клевера лугового 70

3.1.2.6. Медоносные растения как резервуар энтеробактерий в природе 71

3.1.3. Исследование пейзажа энтеробактерий в компонентах муравейника 75

3.1.4. Исследование энтерофлоры содержимого кишечника дождевых червей 79

3.1.5. Природные резервуары бактерий сем. Enterobacteriaeae 83

3.2 Распространение бактерий Klebsiella sp. в исследуемых природных субстратах 88

3.3.Изучение физиоло го-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, изолированных из различных источников 92

3.3.1. Изучение адаптационных свойств 92

3.3.1.1 .Способность фиксировать атмосферный азот 92

3.3.1.2. Способность роста при высоких значениях хлористого натрия 94 в среде

313.1.2. Антагонистическая активность штаммов 95

3.3.1.2. Устойчивость штаммов к действию эфирных масел 98

3.3.2. Исследование потенциальной патогенности штаммов 100

3.3.2.1. Поиск генов, кодирующих токсины энтеробактерий 100

3.3.2.2. Изучение антибиотикорезистентности штаммов 102

3.3.2.3. Исследование гемолитической, лецитиназной, фосфатазной и ДНК-азной активностей 107

3.3.2.4. Анализ адгезивности культур к эритроцитам человека 110

3.3.2.5. Исследование лизогенности культур клебсиеллезным бактериофагом (ИмБио, Н. Новгород) 111

3.3.2.5.1. Исследование литической активности клебсиеллёзного бактериофага

в отношении штаммов, изолированных от насекомых 111

3.3.2.5.2. Лизирование бактериофагом штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из почвы 114

3.3.2.5.3. Лизирование бактериофагом штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных от растений 115

3.3.2.5.4. Исследование литической активности поливалентного бактериофага в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из организма человека 116

3.3.3. Физиолого-биохимические свойства штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из различных местообитаний 119

Заключение 123

Выводы 126

Цитированная литература 127

Приложение 144

Введение к работе

Актуальность проблемы определяется недостаточной изученностью экологии эитеробактерий, их роли в естественных экосистемах, в местах резервации, а также возможных участников циркуляции в природной среде.

Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae регулярно выделяются из почвы и воды, сохраняют жизнеспособность в широком диапазоне абиотических факторов среды, нередко обладают патогенностью для многих беспозвоночных и позвоночных животных, и человека. Способность утилизировать углеводы, спирты, аминокислоты, целый комплекс циклических органических соединений; участие в процессах нитрификации, дёнитрификации, аммонификации, азотфиксации, позволяет энтеробактериям занимать различные местообитания (Ленгелер, 2005).

Ряд авторов (Литвин, 1991, 2003; Сомов 1988; Бухарин, 1997) высказывались о принципиальном наличии у возбудителей сапронозных инфекций, к которым относятся и бактерии семейства Enterobacteriaceae, двух сред обитания - внешняя среда и организм хозяина, и, соответственно, двух экологических фаз - сапрофитической и паразитической, и двух параллельно существующих частей популяции - внеорганизменной и организменной (гостальной). Не исключено, что и переход бактерий из одной среды существования в другую (внешняя среда - организм хозяина) — тоже вынужденный ход микроорганизмов, позволяющий, в конечном счете, обеспечить их выживание как вида. В целом, следует подчеркнуть, что экология патогенных микроорганизмов в сапрофитической фазе существования изучена крайне слабо.

Сообщества микроорганизмов, в свою очередь, представляют собой составные части экологических систем, что, безусловно, определяет актуальность изучения видового разнообразия бактерий в природных местообитаниях.

5
С позиций современной экологии микроорганизмов

актуальным является не только изучение разнообразия видов бактерий, но и

физиолого-биохимических различий, определяющих внутривидовое

разнообразие штаммов из разных местообитаний (Ленгелер, 2005).

Этиологическая значимость и потенциальная патогенность энтеробактерий обуславливает необходимость более тщательного изучения биологии данной группы возбудителей: прежде всего, местообитаний во внешней среде, условий формирования симбиоценозов и длительности существования их резервуаров. Будучи весьма актуальной, с эпидемиологических позиций, проблема заслуживает целенаправленного популяционно-экологического анализа - как применительно к конкретным микроорганизмам, так и в сравнительно-экологическом аспекте.

Цель исследования.

Выявить распространение и биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях на территории Нижегородской области, а также некоторые физиолого-биохимические свойства, определяющие адаптационные возможности и потенциальную патогенность этиологически значимых представителей семейства Enterobacteriaceae (на примере Klebsiella pneumoniae).

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать биоразнообразие энтеробактерий в следующих природных объектах:

микробоценозы общественных насекомых и субстратов, с которыми они активно контактируют;

вегетативные и генеративные части некоторых медоносных растений, посещаемых пчелами;

содержимое кишечника дождевых червей как основных аккумуляторов почвенной микрофлоры.

2, Провести сравнительный анализ физиолого-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из разных местообитаний, определяющих их адаптационные возможности и потенциальную патогенность.

Научная новизна работы.

Показаны новые местообитания микроорганизмов сем.

Enterobacteriaceae в природной среде: насекомые - растения - почва.

Впервые показано, что микробоценоз медоносных пчел включает не менее 18 видов, представителей 10 родов сем. Enterobacteriaceae.

Впервые показано, что в составе микробоценозов вегетативной и генеративной частей медоносных растений обнаруживаются не менее 14 видов, представители девяти родов семейства Enterobacteriaceae.

Впервые охарактеризован состав энтерофлоры дождевых червей, включающий не менее 12 видов, представителей девяти родов сем. Enterobacteriaceae.

Впервые показана возможная резервуарная роль субстратов муравейников в отношении энтеробактерий.

Впервые показаны различия физиолого-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из резервуаров «почва-растения» и штаммов, выделенных из резервуаров «насекомые-человек», которые отличались адаптационными свойствами и параметрами, определяющими их потенциальную патогенность.

Практическая значимость работы.

Результаты исследований могут быть использованы экологами и микробиологами, зоологами, ботаниками и энтомологами, а также эпидемиологами для поиска бактерий с «непрофессиональным» паразитизмом.

7
Характеристика пейзажа общей энтерофлоры пчел будет

способствовать рациональному подбору оптимальных антимикробных

препаратов для лечения болезней этих насекомых.

Различия в литической активности клебсиеллезного бактериофага по отношению к штаммам из групп «почва-растения» и «насекомые-человек» показывают необходимость расширения пула фагов, входящих в состав препарата, за счет «природных» штаммов, с целью повышения его валентности и литической активности.

Выявленные особенности разнообразия «природных» штаммов энтеробактерий открывают новые направления исследования структуры популяций различных возбудителей сапронозов.

Полученная в ходе исследования информация о потенциальных природных резервуарах энтеробактерий может быть использована при разработке эффективных противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Полученные в ходе исследования результаты могут быть использованы при
составлении пособий по экологии потенциально-патогенных

микроорганизмов.

Положения, выносимые на защиту.

Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae являются естественными компонентами консорций: насекомые - растения — почва:

Общая микрофлора медоносных пчел включает микроорганизмы не менее 18 видов, представителей 10 родов сем. Enterobacteriaceae.

Вегетативная и генеративная части медоносных растений содержат не менее 14 видов, представителей девяти родов сем. Enterobacteriaceae.

Энтеробактерий обнаруживаются в пищеварительной системе дождевых червей и представлены бактериями девяти родов с доминированием микроорганизмов p. Klebsiella гір. Citrobacter.

8 Штаммы клебсиелл, выделенные из различных природных источников,

отличаются физиолого-биохимическими свойствами, что позволяет

объединить их в группы по местообитанию.

Апробация работы. Результаты работы представлены на VIII Всероссийском
популяционном семинаре «Популяции в пространстве и во времени»
(Н.Новгород, 2005), научной конференции «Новые технологии в
профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных
заболеваний» (Н.Новгород, 2006), на 10-й Пущинской школе-конференции
молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2006), Всероссийской
научной конференции "Современные проблемы медицинской

микробиологии" (Санкт-Петербург, 2007), XII Нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2007), III Всероссийской научной конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Йошкар-Ола, 2008), XIII Нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2008), IV международной научно-практической конференции «Научное пространство Европы -2008» (София, 2008), I Всероссийском, с международным участием конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз - Россия 2008» (Казань, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа в объеме 144 страниц (основного текста) состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, имеется приложение из 17 страниц. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 175 источников литературы (112 отечественных и 63 иностранных).

9 Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю к.б.н.

Речкину А.И. за профессиональные советы, квалифицированную помощь и поддержку при написании диссертации, а также к.б.н. Г.Н. Ладыгиной, д.м.н. Н.А. Добротиной, д.м.н. И.В. Соловьевой, к.б.н. А. Мочеловой за участие и рекомендации; зав. кафедрой и директору НИИМБРЭ, д.б.н. В.В. Новикову и декану биологического ф-та, д.б.н. А.П. Веселову за предоставление базы для исследований; специалисту-пчеловоду СВ. Адушеву за участие; к.б.н. Г.А. Кравченко за поддержку и помощь при подготовке к защите; зав. лабораторией Р.В. Власовой за поддержку; к.б.н. А. Бабаеву, к.б.н. О. Уткину, А. Нижегородцеву за помощь и советы по статистической обработке результатов; студентам Л. Касаткиной, С. Захаровой, А. Чернышовой, А. Шумилову, Ю. Камышевой за участие в экспериментах, а также А. Игнатову и своей семье за моральную и материальную поддержку.

Влияние дождевых червей (Lumbricus terrestris L.) на почву

Одни из главных утилизаторов растительного опада в средней полосе дождевые черви, в основном из семейства люмбрицид (Lumbricidae). Встречаются они практически во всех естественных и антропогенных экосистемах умеренного пояса и доминируют в них по биомассе (особенно высока их численность в лесостепи, смешанных и широколиственных лесах более 300 особей на 1 м2) (Tiunov, Scheu, 2000). Пронизывая почву ходами, дождевые черви рыхлят ее, способствуя аэрации и увлажнению на глубине, перемешивают почвенные слои, ускоряя разложение растительных остатков и повышая тем самым плодородие почвы (Edwards, 1977). Объем переносимой этими животными почвы колеблется от 2 до 250 т/га в год. Один из самых крупных видов люмбрицид средней полосы - дождевой червь (Lumbricus terrestris) - как ни странно, также находится в «группе риска». Дело в том, что особи этого вида, днем скрываясь в глубоких (до 3 м) норах, ночью выходят на поверхность почвы за пропитанием — растительным опадом (Tiunov, 2000). Отметим, что небольшую часть их диеты составляют и корни растений. Во время таких ночных путешествий некоторые особи могут преодолевать до 19 м . В разных экосистемах за несколько осенних месяцев эти дождевые черви способны унести в норы практически весь растительный опад (Тиунов, 2001). Это вовсе не означает, что люмбрициды сразу же все съедают, существенную часть пищи они запасают в норах и потребляют по мере частичного разложения растительных остатков (Tiunov, Scheu, 2000). Взаимодействия дождевых червей и микроорганизмов важны для протекания таких почвенных процессов, как разложение и трансформация растительных остатков, гумусообразование, формирование пула питательных элементов и микробных сообществ. Широкий спектр этих взаимодействий позволяет говорить о тесной связи червей и микроорганизмов. Предполагается, что грибы и бактерии являются основным источником пищи для червей (Вызов, 2005). Питаясь, дождевые черви регулируют рост почвенных микроорганизмов, выедая одни и создавая благоприятные условия для роста других микробных популяций в пищеварительном тракте и в экскрементах (Третьякова, Добровольская и др., 1996). Скорость прохождения пищи через пищеварительный тракт червей очень высока (несколько часов). Черви должны быстро убивать и переваривать потреблённые почвенные микроорганизмы. Ранее показано, что переваривание микроорганизмов в кишечнике беспозвоночных (многоножек и мокриц) начинается с быстрой гибели некоторых микробных клеток под действием специфических киллерных агентов, имеющих небелковую природу (Byzov et. al, 1998).

Выборочное питание беспозвоночных микроорганизмами - один из фундаментальных принципов зоомикробных взаимодействий (Karsten, 1995). Кроме того, селективный отбор микроорганизмов в пищеварительном тракте червей может быть значимым фактором формирования микробных сообществ в почве (Хомяков и др., 2007).

Исследовали реакцию почвенных бактерий и грибов на воздействие пищеварительной жидкости дождевого червя Lumbricus terrestris L., полученной центрифугированием нативных фрагментов пищеварительного тракта. Исследователи обнаруживали подавление роста некоторых бактерий, спор и гиф грибов после воздействия экстрактов из переднего и среднего отделов пищеварительного тракта L. terrestris. У бактерий образование микроколоний подавлялось через 20-30 с после воздействия кишечных экстрактов, что, возможно, свидетельствует о неферментативной природе воздействия (Хомяков, 2005).

Пищеварительная жидкость червей, питающихся почвой и стерильным песком, одинаково проявляла микробоцидную активность. Это свидетельствует о том, что микробоцидные агенты образуются в организме червя, а не почвенными микроорганизмами. Воздействие пищеварительной жидкости из переднего и среднего отделов избирательно по отношению к разным микроорганизмам. Из 42 штаммов почвенных бактерий 7 подвержены микробоцидному действию жидкости {Alcaligenes faecalis, Microbacterium sp., Arthrobacter sp., Bacillus megaterium 401-1, B. megaterium 413-1, Khiyvera ascorbata, Pseudomonas reactans). Остальные бактерии не погибли в пищеварительной жидкости. Кишечная жидкость из заднего отдела кишечного тракта не обладала микробоцидной активностью (Хомяков, 2007).

Не обнаружено связи между реакцией микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости и таксономическим положением микроорганизма. Обнаруженные эффекты схожи с ранее показанными для многоножек и мокриц по следующим параметрам: быстрое действие пищеварительной жидкости на микроорганизмы, избирательность в действия, проявляемая на штаммовом уровне. Избирательное воздействие пищеварительной жидкости кишечника дождевых червей на почвенные микроорганизмы имеет значение для питания животных, поддержания гомеостаза кишечного микробного сообщества и для формирования микробных сообществ в почве (Вызов, 2005).

Обстоятельную работу по распространению в почвах бактерий группы кишечной палочки проделал Конрих 1910 году, проанализировав около 550 проб, взятых из почв, разнящихся по культурному состоянию. Он показал, что почвы населённых мест обычно содержат в том или ином количестве бактерии кишечной группы. Кишечную палочку Конрих находил в удобряемых почвах, в почвах парков, дорог и т.д. До 65% почв, расположенных недалеко от местожительства людей, содержали бактерии кишечной группы. В дальнейшем было установлено, что в почве наблюдается весьма значительное разнообразие бактерий кишечной группы. Так, Стоке и Стон в 1910 году указали на более частую встречаемость в почве атипичных форм кишечной палочки. Позднее Джонсон и Левин в 1917 году, изучавшие около 400 культур бактерий группы кишечной палочки, выделенных из почвы, нашли, что более 80% из них относятся к Citrobacter freundii. Остальные штаммы по свойствам приближались к E.coli (Janssen, 2006). В 1920г. Чен Чопг-Чен и Реттер изолировали из почвы 467 культур бактерий группы кишечной палочки. Большинство из них (447) были охарактеризованы как Enterobacter aerogenes. Одновременно они изучали микронаселение фекалий человека и животных. В этом субстрате все изолированные культуры группы кишечной палочки принадлежали к Е.соИ. Таким образом, в результате исследований было установлено, что в почве преобладают иные виды бактерий кишечной группы, чем в фекалиях человека и животных (Минкевич, 1976). Совокупность имевшегося материала уже в 1917г. позволила Левину сформулировать точку зрения, по которой Е.соИ рассматривалась как кишечный микроорганизм, а Enterobacter aerogenes - как почвенный (Widmer, 1999). В результате исследований Skinner и Murray в 1966г. было установлено, что клетки Е.соИ отмирают быстрее, чем клетки Enter.aerogenes (Anderson, 1995). Данные Tonney и Noble в 1961г. показали, что Enter.aerogenes может размножаться в почве при благоприятных погодных условиях (Makeschin, 1997).

Значительное внимание видовому составу бактерий группы кишечной палочки почвы уделял Козер 1927г. В почвах глухих лесов он не редко обнаруживал бактерии кишечной группы, у которых реакция Фогес-Проскауэра была такая же, как у Е.соИ, но которые могли развиваться на нитратных средах (Jaeger, 1999). Минкевич наблюдал, что в южных почвах относительное количество цитрат-ассимилирующих разновидностей кишечной палочки значительно выше, чем в северных (табл. 1).

Исследование пейзажа энтеробактерий в компонентах муравейника

Одним из возможных резервуаров, на наш взгляд, могут служить субстраты муравейников, в состав массы которых входит растительный материал хвойных и лиственных пород, почва, останки животных и насекомых и другие субстраты. Муравейники - специфические биотопы, формирующиеся в почвенном и надпочвенном ярусах и достигающие в лесных экосистемах высокой плотности. Микроклиматические условия, устанавливающиеся в муравейниках (в особенности в крупных, с хорошо выраженными куполом и валом), поддерживаются за счет активной их регуляции и выражаются в относительном постоянстве температуры и влажности, уровень которых заметно отличается от окружающей среды (Захаров, 1980). До сих пор исследования, посвященные микрофлоре муравейников касались лишь мико- и альгофлоры (Голиченков, 2005; Коганова, Рахлеева, 2005). Условия, формирующиеся в муравейниках, позволяют предположить существование энтерофлоры. Микроорганизмы, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae характеризуются продуктами, осуществляемого ими брожения и выделяют при этом ряд органических кислот. Количественно не преобладающим, но все же, характерным продуктом бывает муравьиная кислота (Podschun, 1998). Возможно, муравьино-кислое брожение (смешанного типа) определяет, в какой-то мере, их устойчивость к конечным продуктам, позволяя существовать в муравейниках. Поиск энтеробактерий в компонентах муравейников осуществляется нами впервые.

Основная масса исследуемых компонентов муравейников представлена хвоей голосеменных деревьев, корой и растительным материалом травянистого строения. Так как именно этот материал подвергался анализу, важно иметь представления о возможной резервуарной роли растительного сырья, в первую очередь, хвойных пород. Американские исследователи изолировали энтеробактерий из коры, хвои и древесины голосеменных пород деревьев - в частности, широко выделяли бактерий .Klebsiella и р. Enterobacter (Duncan, 1972). Колиформные бактерии выделяли из сока свежесрезанной древесины, причем концентрация их была 10D-106 кл/мл, что позволяет сделать вывод о размножении данных микроорганизмов. Сканирующая электронная микроскопия позволила Bagley (1978) сделать фотографии бактериальных колоний внутри трахеид хвойных деревьев, идентифицированные микроорганизмы отнесены к видам Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freimdii и Enterobacter agglomerans, который сейчас относят к роду Envinia (Bagley, 1978). Существует несколько гипотез, объясняющих обнаружение данных бактерий внутри древесины различных пород. Эти бактерии рассматриваются как участники нормальной микрофлоры растений или попадание в растения возможно из почвы через корневую систему и поврежденные участки корней (Beattie, 1999).

В результате анализа субстратов муравейника нами изолированы бактерии родов Enterobacter, Envinia, Klebsiella, Escherichia, Providencia, Citrobacter, Serratia. Доминирующими видами в субстрате из муравейника были Enterobacter cloacae и Klebsiella pneumonia. Компоненты муравейников представляют систему с протекающими важнейшими в биогеоценотическом плане процессами, в том числе и процессом фиксации молекулярного азота, в котором энтеробактерии принимают непосредственное участие. Именно благодаря способности фиксировать атмосферный азот клебсиеллы получили широкое распространение в природе; этим объясняется их размножение и выживание в богатых источниками углерода и бедных азотом древесном материале и тканях растений, которые аккумулируются в муравейниках. Учитывая то, что в гнездах муравьев активно протекают важные в биогеоценотическом масштабе процессы, такие как гумификация, разрушение целлюлозы, азотфиксация осуществляемые микроорганизмами, условия муравейника, как среды обитания являются благоприятными (Мишустин, 1984).

Так как муравьи активно посещают растения, находящиеся вблизи муравейника и имеющие на своей поверхности тлей, то представляло интерес исследовать микрофлору поверхности листьев этих растений. На поверхности листьев с тлями нами обнаружены бактерии родов Envinia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. В результате исследования общими для растений и компонентов муравейника были бактерии p. Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Envinia. Обращает внимание обнаружение представителей одних и тех же родов в составе субстратов муравейников {Enterobacter - 44%) и эпифитной микрофлоры соседствующих растений {Enterobacter - 67%), что, скорее всего, связано с тесными трофическими взаимоотношениями в системе муравейник-растения (рис. 15).

Исследование гемолитической, лецитиназной, фосфатазной и ДНК-азной активностей

Гемолитичекая, лецитиназная, фосфатазная и ДНК-азная активности определяют потенциальную патогенность штаммов, в то же время обуславливают дополнительные ферментативные и адаптационные возможности.

Лецитиназная (лецитоветилазной) активность наблюдалась у штаммов, выделенных из почвы и растений, и составила 10% от всех тестируемых штаммов. Известно, что при совместном культивировании с другими грамотрицательными культурами увеличивается частота обнаружения лецитиназной активности.

Гемолитическую активность выявили у штамма с растений (1 культура). Гемолизины относятся к пороформирующим токсинам - они образуют каналы в мембране клеток, нарушающие вход и выход катионов через плазматическую мембрану (Жеребцова, 2007). По данным ряда исследователей, гемолитической активность у Klebsiella sp. обнаруживается достаточно редко (Иванова, 2007), этим может объясняться обнаружение данной активности только у одного из исследуемых нами штаммов. Также ранее установлено стимулирующее или ингибирующее действие на гемолитическую активность бактерий Klebsiella др.оксидов кремния, железа, кобальта и иттрия (Алексахина, 2002). В связи с загрязнением окружающей среды указанными ионами, нельзя исключать их влияния на патогенность Klebsiella sp. . Наличие гемолитической активности способствует системному распространению бактерий, повышает выживаемость в кровотоке через подавление гуморальных и клеточных факторов защиты организма, служит альтернативным механизмом захвата ионов железа из лизируемых эритроцитов.

ДНК-азная активность обнаружена у 37% штаммов, в основном, это штаммы, изолированные из почвы (кишечное содержимое дождевых червей). Дождевые черви - основные утилизаторы листового опада и перегноя в нашей области, в состав которого могут входить останки насекомых, животных, различные органические субстраты тд. В связи с этим, ДНК-азная активность представляется одной из необходимых способностей для утилизации органического вещества почвы. Аналогичная способность обнаружена у ряда штаммов, изолированных с растений, что, на наш взгляд, может объясняться циркуляцией энтеробактерий в системе почва-растения, где растения служат звеном, выносящим возбудителя из почвы (Литвин, 1997). ДНК-азная активность отмечена нами и у штаммов, изолированных от пчел. Мы связываем это с богатым в органическом плане субстратом содержимого кишечника медоносных пчел и возможностью циркуляции штаммов в системе: пчелы - медоносные растения, так как исследуемые штаммы изолированы с цветов медоносных растений. Кроме того, известно, что возбудители при смешанной инфекции чаще характеризуются ДНК-азной, гемолитической, лецитиназной и др. активностями (Габидуллин, 2006). Фосфатазная активность наблюдалась у всех групп микроорганизмов. Фосфатмобилизующие микроорганизмы играют ведущую роль в 109 формировании функциональных взаимоотношений в системе «почва микроорганизмы-растение». Специфичность распространения данной группы бактерий определяется тем, что в почвогрунтах распространены виды, использующие широкий набор минеральных субстратов для мобилизации фосфора, тогда как в прикорневой зоне пионерных растений присутствуют виды, трансформирующие органофосфатные соединения и фосфаты кальция. Лобакова (2004) утверждает, что значительное позитивное воздействие ассоциативных симбионтов на развитие растения-хозяина и симбиоз в целом происходит за счет улучшения минерального питания растений, в частности, обеспечения солями фосфора (Лобакова, 2004). Таким образом, показано, что штаммы из природных резервуаров «почва-растения» имеют более разнообразные активности, обеспечивающие по-нашему мнению, адаптацию данных микроорганизмов в природных субстратах. Наличие лецитиназной, ДНК-азной и гемолитической активностей у штаммов группы «почва-растения» свидетельствует о более высоком персистентном потенциале по сравнению со штаммами группы «насекомые-человек».

Исследование литической активности поливалентного бактериофага в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из организма человека

Анализ тестирования промышленного образца клебсиеллёзного бактериофага к штаммам, выделенным от больных с гнойно-воспалительными инфекциями, предоставленным НИИТО, показал, что, бактериофаги к штамму № 18 обладали низкой литической активностью (10" - 10" ). Таким образом, проанализировав полученные материалы с данными литературы, можно утверждать, что структура рецепторных участков может изменяться в результате наследственных изменений в бактериальной клетке, после чего специфическое взаимодействие между данным рецептором и гомологичным фагом становится уже невозможным (Тихоненко, 1968). Все. остальные из исследованных нами штаммов обладали высокой литической активностью (10"7- 10"9) (табл. 15).

Лизирование бактериофагом штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из организма человека

Высокая активность полученного нами фага зависит от выраженной специфичности бактериальной клетки, её способности связывать только определённый тип фага, на поверхности которого имеются сходные рецепторы. Вероятность развития устойчивости микробной флоры к бактериофагам крайне мала, так как происходит естественная постоянная адаптация фагов к циркулирующим штаммам бактерий за счёт обновления фаговых рас (Ефимова, 2001).

Исследование литической активности бактериофага в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, изолированных из различных источников показало, что высокая литическая активность клебсиеллёзного бактериофага отмечена по отношению к штаммам изолированным от человека и насекомых.

Для сравнения литической активности бактериофага, в качестве контроля мы выбрали группу штаммов изолированных от человека.

Статистическую обработку полученных данных проводили по

Обнаружены достоверные отличия между группами штаммов «человек» и «почва» (р=0,015), а также достоверные отличия между группами «человек» и «растения» (р=0,045).

По действию клебсиеллёзного бактериофага полученные данные объединены в 2 группы, связанные с местом изоляции штаммов:

1 группа - «почва - растения», показана низкая литическая активность (10" Ю-3);

2 группа - «человек - насекомые», для которой характерна высокая литическая активность (10" -10") бактериофага.

Такие значительные отличия в литической активности промышленного клебсиеллёзного бактериофага предполагают дальнейшее развитие работ по улучшению свойств бактериофага в отношении штаммов выделенных из природных источников.

При использовании фагов в крупных клиниках целесообразно включать в состав производственных штаммов, на которых готовятся коммерческие препараты, госпитальные штаммы возбудителей заболеваний характерных для данного стационара и «природные штаммы».

Природная среда является подходящей для размножения патогенных вариантов штаммов Klebsiella и целью нашего исследования явилась оценка потенциальной патогенносте и адаптационных возможностей клебсиелл, выделенных из различных природных субстратов.

В ходе исследования выявлено биоразнообразие адаптационных возможностей штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из различных местообитаний.

По азотфиксирующей и антагонистической активностям, устойчивости к высоким концентрациям солей исследуемые штаммы разделили в группы «почва-растения», «насекомые-человек». Штаммы Klebsiella, изолированные из местообитаний «почва-растения» оказались достоверно менее адаптированными к отсутствию источников азота и высоким концентрациям хлористого натрия.

Исследование чувствительности штаммов к действию эфирных масел показало дифференцированное действие на штаммы в группах «почва-растения», «насекомые-человек». Штаммы из группы «насекомые-человек» обладали большей устойчивостью к действию практически всех эфирных масел.

Анализ потенциальной патогенности исследуемых, штаммов клебсиелл показал возможность объединения исследуемых штаммов в группы по местообитанию: «почва-растения», «насекомые человек». Рис. 30. Гетерогенность групп штаммов «почва-растения», «насекомые-человек». ДНК-азная активность обнаруживалась достоверно чаще у штаммов из группы «почва-растения», кроме того, у штаммов этой же группы обнаружены лецитиназная и гемолитическая активности. По способности адгезироваться на эритроцитах человека исследуемые штаммы также можно разделить на 2 группы, где низкая и средняя степень адгезивности отмечена у штаммов, изолированных от насекомых. Циркуляция штаммов Klebsiella pneumoniae у медоносных пчел - в ближайшем окружении человека, в дальнейшем может привести к модификации генов, ответственных за адгезию и повысить степень проявления этого фактора патогенности. По резистентности к антибиотикам штаммы объединены в группы «почва-растения», «насекомые-человек», между которыми показаны различия в спектре резистентности (шире у штаммов группы «почва-растения») и в отношении к аминогликозидам.

Похожие диссертации на Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области