Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 4
1.1. Характеристика озера Байкал 4
1.2. Метан в водоемах 8
1.2.1. Бактериальное образование метана 9
1.2.2. Другие механизмы образования метана 20
1.2.3. Изотопный состав углерода метана различного происхождения 23
1.2.4. Газогидраты - потенциальный источник метана 25
1.2.5. Газогидраты в озере Байкал 28
1.3. Окисление метана в водоемах 30
1.3.1. Интенсивность окисления метана в водоемах 30
1.3.2. Окисление метана в анаэробных условиях 32
1.4. Метанокисляющие бактерии 35
1.4.1. Биология метанотрофов 35
1.4.2. Экология метанотрофных бактерий 43
1.4.3. Молекулярно-биологические методы исследования метанотрофов 45
Глава 2. Объекты и методы исследования 49
2.1. Объекты исследования и методы отбора проб 49
2.2. Методы исследования 52
2.2.1. Методы определения физико-химических условий среды... 52
2.2.2. Методы определения интенсивностей бактериальных процессов образования и окисления метана 53
2.2.3. Выделение метанотрофных бактерий 54
2.2.4. Молекулярно-генетические методы 55
2.2.5. Статистические методы 56
Глава 3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Физико-химические условия среды обитания микроорганизмов 58
3.2. Бактериальное образование метана в донных осадках озера Байкал 63
3.3. Бактериальное окисление метана в донных осадках озера Байкал 68
3.4. Окисление метана в водной толще 75
3.5. Метанотрофные бактерии донных осадков озера Байкал 82
3.6. Взаимосвязь бактериального окисления метана и физико- химических условий среды 90
Заключение 92
Выводы 94
Список использованной литературы 95
Введение к работе
Актуальность. Бактериальное окисление метана является широко распространенным в водных экосистемах процессом, который обеспечивает возврат углерода в круговорот вещества и является основным фактором, регулирующим эмиссию метана и его концентрацию в атмосфере. Процесс осуществляет высокоспециализированная группа микроорганизмов -метанокисляющих бактерий (метанотрофов). Благодаря наличию уникальных ферментных систем, метанотрофы способны использовать метан как единственный источник углерода и энергии. Особенности окисления метана и метанотрофные сообщества пресных водоемов изучены достаточно хорошо (Lidstrom et al., 1984; Абрамочкина и др., 1987; Frenzel et al„ 1990; Buchholz et al., 1995; Costello et al., 1999; Auman et al., 2000; Гальченко, 2001; Pester et al., 2004; Bussman et al., 2004).
Озеро Байкал - уникальный пресноводный водоем, расположенный в рифтовой зоне. Низкая минерализация вод (около 100 мг/л), большие глубины, постоянно низкая температура воды в течение года, высокое содержание кислорода по всей толще воды и незначительная концентрация органического вещества (Атлас, 1993) обуславливают специфические условия для деятельности живых организмов. Существующие на дне озера локальные выходы метана, поступающего по разломам из глубинных слоев осадков, привлекают внимание исследователей к изучению особенностей биогеохимии метана в озере (Намсараев и др., 2000, 2002; Клерке и др., 2003). В осадках озера был детально изучен процесс бактериального образования метана (Намсараев и др., 1995г). Окисление метана исследовалось в донных осадках в районах выхода термальных вод и залегания газогидратов (Дагурова и др., 2004). Окисление метана в водной толще малоисследованно, практически нет работ по изучению бактерий, осуществляющих этот процесс в озера Байкал.
Цель диссертационной работы - изучение процесса окисления метана в озере Байкал и выявление аэробных бактерий, ответственных за этот
процесе.
Задачи исследования:
определить физико-химические условия среды обитания микроорганизмов;
определить интенсивность образования метана в донных осадках;
определить интенсивность окисления метана в донных осадках и водной толще;
выделить культуры метанокисляющих бактерий и определить их филогенетическое положение.
Впервые на обширном материале показано, что в водной толще и донных осадках озера Байкал протекает процесс аэробного окисления метана. Выявлено, что в осадках зоной интенсивного потребления метана является слой 0-5 см. Распределение интенсивности метанокисления в газогидратсодержащих осадках отличается от такового в других районах озера. В воде наиболее интенсивно метан окисляется в верхних (0-100 м) и придонных слоях. Впервые выделено 17 культур метанокисляющих бактерий из донных осадков и определено их филогенетическое положение. Культивируемое метанотрофное сообщество представлено в основном метанотрофными бактериями II типа. Филогенетический анализ метанотрофов по последовательности а-субъединицы мембранной метанмонооксигеназы свидетельствует о преобладании в накопительных культурах представителей рода Methylocystis.
Количественные данные по активности метанокисляющих бактерий могут быть использованы в качестве индикаторных в местах разгрузки метана, а также для мониторинга деятельности микроорганизмов. Данные о разнообразии метанокисляющих бактерий озера Байкал расширяют представления об экологии метанотрофов в природе.
Характеристика озера Байкал
Байкал - самое глубокое и самое крупное пресное озеро мира. Длина береговой линии составляет 2000 км, площадь водного зеркала 31500 км . Наибольшая глубина 1637 м, наибольшая ширина 79,5 км, длина 636 км (Атлас Байкала, 1993). Байкал - древнейший по возрасту пресноводный водоем (25 млн лет). Его происхождение связано с развитием глобальной рифтовой структуры, характеризующейся высокой сейсмической активностью. Западные берега озера практически на всем протяжении высокие, скалистые, на многих участках - обрывисто-абразионные. На восточном побережье преобладают аккумулятивные галечные и песчаные берега с террасами. В озеро впадает более 300 рек и вытекает одна Ангара.
Котловина Байкала состоит из трех впадин - Южной, Средней и Северной, разделенных друг от друга высокими подводными возвышенностями. Дно Байкала во всех трех котловинах выровнено, со слабым наклоном с западной стороны впадин, где отмечаются максимальные глубины озера (Кожов, 1962).
Озеро Байкал является димиктическим водоемом. Вертикальное перемешивание водных масс происходит дважды в год, наиболее активно - в преддедоставный период, менее активно - в период весенней гомотермии (Вотинцев, 1990). Весенняя гомотермия, при которой происходит уравнивание температуры всей толщи воды, приходится на конец июня -начало июля. С начала июля до середины или конца августа происходит летнее прогревание воды и устанавливается температурная стратификация. В это время ясно выделяется верхний слой повышенных температур (эпилимнион), нижний слой с более низкими температурами воды (гиполимнион) и промежуточный слой резкого температурного скачка -термоклин. В начале периода летнего прогревания слой температурного скачка устанавливается на глубине 2-5 м, по мере прогревания он погружается вглубь, а к осени исчезает совсем. В Северном Байкале слой температурного скачка обнаруживается на глубине 4-5 м, а в Среднем и Южном Байкале - на глубине 10-25 м. С конца августа верхний слой воды в глубоководной части начинает охлаждаться и температурная стратификация нарушается. Сезонные изменения температуры воды затрагивают водную толщу до глубин 200-300 м. Ледяной покров устанавливается в начале января и полностью разрушается во второй половине мая. Толщина льда в среднем 1 м(Кожов,1972).
Байкальская вода отличается низким содержанием минеральных (96,4 мг/л) и органических веществ. По химическому составу воды Байкала относятся к слабоминерализованным мягким водам гидрокарбонатно-кальциевого состава. Ионный состав воды стабилен в пространстве и времени, распределение ионов по глубине однородно (Вотинцев, 1961, 1985; Falkner et al, 1991). Водная толща полностью перемешивается до придонных слоев во время весеннего термобара, вследствие чего даже в придонных слоях воды концентрация кислорода не опускается ниже 6 мг/мл (Вотинцев, 1990; Shimaraev et al, 1993; Гранина и др, 2002). Прозрачность воды достигает 40 м (Атлас Байкала, 1993).
Толща осадков озера Байкал достигает 10 км в южном и центральном бассейнах и около 4 км в северном бассейне (Hutchinson et al, 1992; Кузьмин, 2000). Скорость осадконакопления оценивается К.К. Вотинцевым (1967) как 4,17 см в 1000 лет без учета взвешенного материала речного стока. Самая низкая скорость осадконакопления отмечалась на Академическом хребте -0,31 мм в год. В Северном, Среднем и Южном Байкале она составляла 0,52; 0,48 и 0,56 мм в год (Вильяме и др., 1993). Скорость осадконакопления в открытом Байкале оценивается 4,2 см в 1000 лет, в Селенгинском мелководье - 5,2 см (цит. по Намсараев, Земская, 2000). По данным японских ученых (Фуджии и др., 1994), современные скорости осадконакопления в Байкале, измеренные свинцово-цезиевым методом, равняются 0,16 мм в год в Северном Байкале, 0,6 мм в год в Среднем Байкале, 1,2-0,9 мм в год в районе дельты Селенги. По последним по времени исследованиям (Кузьмин, 2000), скорость осадконакопления изменяется от 0,12-0,2 до 0,03-0,04 мм в год. Наименьшие скорости наблюдаются в районе Академического хребта, более высокие - на Селенгино-Бугульдейской перемычке и в глубоких котловинах озера.
Современные осадки озера Байкал весьма разнообразны. Различают следующие типы осадков: камни, галечные грунты, гравийные грунты, пески, крупноалевритовые илы, мелкоалевритовые илы, слабодиатомовые мелкоалевритовые илы, глинистые илы, слабодиатомовые глинистые илы. Вдали от берегов, за пределами глубин 500-600 м, как правило, преобладают илистые грунты, обогащенные створками отмерших диатомовых водорослей. Во многих местах, особенно в районах подводных возвышенностей, на значительной глубине встречаются участки дна, усеянные грубым материалом - гравием, галькой и камнями (Кожов, 1962; Выхристюк, 1980).
В поверхностных илах озера Байкал среднее значение Eh для глубоководных районов равно +393 мВ. Благодаря насыщенности кислородом даже придонных слоев воды, донные отложения окислены на большей части поверхности дна. Низкие скорости осадконакопления и незначительный расход кислорода на распад захороненного в осадках органического вещества приводят в некоторых участках к развитию мощной окисленной зоны: редокс-граница между окисленными и восстановленными осадками нередко залегает на глубине более 10 см под поверхностью дна. В целом, мощность современной окисленной зоны колеблется в различных районах озера от миллиметров до 30 см, в отдельных случаях достигает 60-70 см (Намсараев, Земская, 2000; Гранина и др, 2002). Значения рН поровых вод осадков колеблются в пределах от 6,5 до 7,57, температура - от 3,5 до 5С.
Измерения концентрации кислорода в осадках Байкала около дельты Селенги показали, что кислород в мелководных участках обнаруживается только до 0,6-6 мм осадков. На глубине 60-84 м кислород проникает до 10,5-23 мм осадков (Martin et al., 1993). Проникновение кислорода в толщу осадков иногда превышает 40 мм, что связано со многими факторами, особенно с деятельностью аэробной и анаэробной микрофлоры, типом осадков и температурой придонной воды. При температуре 5-7С кислород обнаруживается в осадках до 23 мм, а при более высоких температурах 8,9-13,9С - до 6,5 мм (Martin et al., 1993).
Органические вещества в осадках Байкала рассеяны неравномерно. Их содержание варьирует от 0,09 до 5% сухого вещества (Выхристюк, 1977). Среднее значение органического вещества в осадках озера Байкал равно 1,9%. Значительное количество органического углерода содержится в диатомовых илах (в среднем 1,47%), очень мало - в песчаных фунтах (0,32-0,51%). В южной части Байкала содержание органического вещества несколько выше. Распределение органического вещества по площади дна Байкала отражает общие закономерности, характерные для внутренних водоемов, т.е. тяготение максимальных концентраций к центральной глубоководной зоне, минимальных - к периферическим областям. В наибольшем количестве органические вещества содержатся в бухтах, заливах, сорах, на мягких илистых фунтах (Выхристюк, 1980).
Объекты исследования и методы отбора проб
Материалы для исследований были получены в ходе экспедиций, организованных Лимнологическим институтом СО РАН на НИС «Г.Ю. Верещагин» в июне 2002 г. и августе-сентябре 2003 г., а также со льда в марте 2003 г . Схема отбора проб представлена на рис.2.1.Пробы воды и донных отложений были отобраны во всех котловинах озера на центральных станциях стандартных байкальских лимнологических разрезов (Солзан-Маритуй, Листвянка-Танхой, Анга-Сухая, Болдаково Ольхонские ворота, Ухан-Тонкий, Елохин-Давша, Котельниковский Амнундакан, Тыя-Немнянка), в районе Академического хребта и в централь v ной части Байкала. Эти районы мы в дальнейшем будем обозначать как фоно вые. Также водная толща и осадки были опробованы в местах, где по данным предыдущих исследований и в ходе наших экспедиций были выявлены различные аномалии: это район выхода гидротермальных вод (бухта Фролиха, Северный Байкал), районы нефте- и газопроявлений (мыс Толстый, Селенгин-ское мелководье и дельта Селенги, Баргузинский залив), район вентовых структур - кратер Маленький (Южный Байкал) (Кузнецов и др., 1991; Гебрук и др., 1993; Голубев, 1994; Гранина и др., 1994; Клерке, Голубев, 1994; Намса-раев и др., 19946; Гранина и др., 2000; Хлыстов и др., 2000; Гранин, Гранина, 2002; Исаев и др., 2002; Клерке и др., 2003; Хлыстов и др., 2004). Характери-етика отобранных проб представлена в таблице 2.1.
Пробы донных отложений отбирались при помощи дночерпателя и пластиковых бентосных трубок. Придонную воду сливали сифоном в стерильную посуду. Образцы ила для дальнейших исследований отбирали в стерильную стеклянную посуду и полиэтиленовые пакеты и хранили при температуре 4С. Воду отбирали батометрами и сливали сифоном в стерильную посуду. Измерение физико-химических параметров и введение радиоизотопов производили сразу после отбора. Поровые воды осадков получали центрифугированием.
Температуру измеряли с помощью ртутного термометра и электротермометра Prima (Португалия). Значения рН и Eh определяли портативными приборами РН-82 и SC-82 (Yokogawa, Япония). Содержание анионов определяли на жидкостном хроматографе «ЭнвайроХром» и «Милихром А-02», катионов - на адсорбционном и пламенном фотометрах (Руководство,.., 1977). Концентрацию метана определяли фазово-равновесным методом дегазации проб, с последующим анализом на борту судна на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором (Большаков, Егоров, 1987)2. Пробы анализировались в течение суток после отбораСкорость процессов метаногенеза и метанокисления определяли радиоизотопным методом (Романенко, Кузнецов, 1974; Беляев, Иванов, 1975; Беляев и др., 1975; Вайнштейн, Лауринавичус, 1988). Пробы осадков и воды отбирали в стерильные пенициллиновые флаконы, которые закрывали пробками и обжимали алюминиевыми крышками. Радио меченые вещества вводили с помощью шприца. При этом лишний объём воды из флакона вытесняли через иголку. Инкубацию проводили в течение 24-96 ч при температурах, близких к in situ - 4-9С. Радиоактивность меченых соеди нений была измерена на жидкостноых сцинтилляционных счётчиках RackBeta (Швеция) и Intertechnique (Франция). Скорость метаногенеза измеряли, внося во флаконы по ОД мл Ыа14НСОз, фиксировали 1 мл насыщенного раствора NaOH. Образовавшийся метан продували и сжигали до СОг при 700С, улавливая газ сцинтилляционным раствором. Для определения интенсивности окисления метана во флаконы вносили 0,1 мл 14СН4 с активностью 0,5-2 мкКи. После инкубации пробы фиксировали 1 мл NaOH, остаточный 4С02 отгоняли, затем при подкислении отдували в v сцинтилляционный раствор. Распределение углерода в продуктах метаболиз 2 Анализ поровых вод на содержание основных ионов был выполнен сотрудниками Лимнологического института СО РАН Л.П. Голобоковой, Т.П. Погодаевой. Содержание метана в воде и осадках было определено сотрудником Института океанологии РАН А.В. Егоровым. ма - биомассе, экзометаболитах и С(Э2 - учитывали по подсчёту радиоактивности в оставшейся части пробы, подкисленной концентрированной НС1 для удаления карбонатов и выдержанной под тягой в течение 30 мин. Интенсивность процессов была рассчитана по количеству образующихся меченых продуктов реакций на основании концентрации и радиоактивности вводимых исходных субстратов.
Окисление метана в водной толще
Метан, поступающий из донных отложений, подвергается окислению в водной толще. В воде большинства изученных глубоководных станций за сутки окислялось до 1,1 мкл СНЦдм"3, Скорость окисления метана в среднем составляла 0,5 мкл дм"3. Интенсивность процесса в Северном Байкале была сопоставима с таковой в Среднем и Южном Байкале. Потребление метана было повышенным в воде станций 92 (район залегания газогидратов) и 6, 14, 16 (разрезы Сухая-Анга, Котельниковский-Амнундакан, Тыя-Немнянка). Наиболее интенсивно процесс протекал в воде мелководных, приуроченных к разгрузке газов и нефти, станций (табл. 3.6).При окислении от 11,8 до 100% меченого углерода метана переходило в углекислоту. В биомассу и экзометаболиты переходило в среднем 23% углерода метана в «фоновых» районах и 32% в районах залегания газогидратов и выхода подводных термальных вод, нефти и газов. Более высокие значения ассимиляции углерода метана при окислении в районах с дополнительной разгрузкой метана, также как и в осадках, свидетельствует могут свидетельствовать о благоприятных условиях существования метанокисляющей микрофлоры. На глубоководных станциях включение углерода метана в биомассу и клеточные метаболиты наиболее активно происходило в верхних двухстах метрах водной толщи и придонных слоях, на мелководьях - по всей толще воды.
Распределение интенсивности метанокисления по глубине на глубоководных разрезах сильно варьировало.
Потребление метана было зарегистрировано на всех глубинах водной толщи. Пики метанокисления не были приурочены к определенному горизонту, а наблюдались как в поверхностных и подповерхностных (рис. 3.6б,в,д,е), так и в глубинных и придонных (рис. 3.6а,д,е ) слоях воды, или данных нами усредненный распределения мкл CH4 дм" сут" за процесс протекал с равной интенсивностью по всей толще (рис. З.бг). Насыщенность вод Байкала кислородом до придонных слоев создает благоприятные условия для протекания аэробного окисления метана по всей толще. В озерах с анаэробным гиполимнионом окисление метана сосредоточено в узкой области на границе между аэробной и анаэробной зонами (Rudd et al, 1974, 1976; Jannasch, 1975; Rudd, 1980; Дзюбан, 2002a). окисления метана по глубине. Оказалось, что наиболее интенсивно метан потребляется в верхних 100 метрах водной толщи и в придонных слоях воды. Небольшой пик наблюдается на 500 м (рис. 3.7.). Увеличение активности процесса в придонных слоях, возможно, повышенным воде вследствие его поступления из донных осадков. В некоторых морских экосистемах было выявлено повышенное окисление метана в поверхностных слоях воды. Так, в Карском море пик метанокисления приходился на глубину 15-25 м (Намсараев и др., 1995е). В водной толще у побережья Атлантического океана высочайшая скорость метанокисления наблюдалась в пикноклине на глубине 10-20 м (Kelley, 2003). И в том и другом случае, интенсивное протекание процесса происходило при максимальной концентрации метана в этих слоях воды. Ранее было показано, что в открытых частях морей и океанов поверхностные воды содержат большее количество метана, по сравнению с более глубокими слоями (Tilbrook et al, 1995; Dafher et al, 1998; Seifert et al, 1999). Увеличение концентрации метана исследователи связывают с биологической in situ продукцией, которая может осуществляться различными путями (De Angel is et al., 1994; Tilbrook et al, 1995; Dafher et al, 1998; Seifert et al, 1999; Kelley, 2003). Недавно было показано, что поверхностные воды Байкала до 200 м (также, как и морские) отличаются более высоким количеством метана (Егоров и др., 2003). Возможно, что более активное окисление метана в поверхностных слоях водной толщи озера Байкал связано с повышенной концентрацией метана в этой зоне, как это отмечено для морей и океанов.
