Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Общие представления о полиплоидизации соматических клеток 7
2.2. Плацентация у различных видов млекопитающих и человека 16
2.2.1. Формирование клеточных популяций трофобласта и decidua при плацентации у грызунов 16
2.2.2. Плацентация у хищных 22
2.2.3. Роль популяций инвазивного и неинвазивного трофобласта в формировании плаценты человека... 27
2.3. Ядрышковый организатор - его локализация и функциональная организация на метафазных хромосомах и в интерфазном ядре 31
3. Материал и методы 40
3.1. Объекты изучения 40
3.2. Цитоморфологические и цитохимические методы 40
3.3. Методы цитофотометрии и анализа изображений 41
3.4. Методы иммуноцитохимии 45
3.5. Метод электронной микроскопии 46
3.6. Метод выявления активных районов ядрышкового организатора на метафазных хромосомах и в ядрышках интерфазных ядер путем окрашивания нитратом серебра 47
4. Результаты 50
4.1. Полиплоидизация при дифференцировке пролиферирующих и инвазивных клеток трофобласта различных млекопитающих и некоторых специализированных клеток плаценты 50
4.1.1. Полиплоидизация камбиальных клеточных популяций трофобласта крысы 50
4.1.1.1. Полиплоидизация клеток эктоплацентарного конуса 50
4.1.1.2. Полиплоидизация клеток трофобласта соединительной зоны плаценты 52
4.1.1.3. Полиплоидизация клеток трофобласта лабиринта крысы 65
4.1.2. Особенности умножения генома инвазивных клеток трофобласта крысы. 69
4.1.2.1. Формирование популяции третичных гигантских клеток трофобласта и их полиплоидизация 69
4.1.2.2. Изучение содержания ДНК в ядрах вторичных гигантских клеток трофобласта крысы на разных фазах цикла политенного ядра 77
4.1.3. Клетки метриальнои железы при формировании плаценты крысы и их полиплоидизация 81
4.1.4. Полиплоидизация пролиферирующих и инвазивных клеток трофобласта восточноевропейской полевки Microtus rossiaemeridionafis 85
4.1.4.1. Особенности дифференцировки и полиплоидизации клеток трофобласта соединительной зоны и лабиринта плаценты восточноевропейской полевки 85
4.1.4.2. Политения и эндомитоз в супергигантских клетках трофобласта восточноевропейской полевки 99
4.1.4.3. Количественное исследование репродукции гетерохроматизированных телец гоносомального хроматина клеток трофобласта восточноевропейской полевки 104
4.1.4.4. Содержание ДНК в ядерных фрагментах вторичных гигантских клеток трофобласта восточноевропейской полевки 116
4.1.5. Закономерности репродукции инактивированнои Х-хромосомы при политенизации обплацентарных гигантских клеток трофобласта кролика 119
4.1.6. Умножение генома клеток вневорсиночного трофобласта в плаценте человека в ходе их дифференцировки и приобретения клетками инвазивного фенотипа ..121
4.1.7. Умножение генома клеток трофобласта и железистого эпителия эндометрия в плаценте серебристо-черной лисицы 138
4.1.8. Полиплоидия и политения в клетках трофобласта норки 146
4.2. Гликоген-содержащие клетки материнского и зародышевого происхождения в плаценте крысы и восточноевропейской полевки 154
4.3. Исследование структурно-функциональных особенностей ядрышкового организатора в камбиальных и дифференцирующихся клетках трофобласта мыши и крысы 160
4.3.1. Изучение активности ядрышкообразующих районов метафазных хромосом в камбиальных клеточных популяциях трофобласта и в эмбриональных тканях мыши и крысы 160
Обсуждение ...194
Умножение генома и его возможное биологическое значение в различных популяциях клеток трофобласта грызунов, хищных и человека 194
Заключение 236
Выводы 239
Список цитированной литературы 242
- Формирование клеточных популяций трофобласта и decidua при плацентации у грызунов
- Ядрышковый организатор - его локализация и функциональная организация на метафазных хромосомах и в интерфазном ядре
- Клетки метриальнои железы при формировании плаценты крысы и их полиплоидизация
- Закономерности репродукции инактивированнои Х-хромосомы при политенизации обплацентарных гигантских клеток трофобласта кролика
Введение к работе
Трофобласт представляет собой особую популяцию клеток развивающегося зародыша млекопитающих, которые осуществляют его связь с материнским организмом, а впоследствии, становясь частью плаценты, принимают участие в выполнении многообразных ее функций. Вместе с материнскими тканями децидуализированного эндометрия, а также тканями эмбриональной сосудистой системы в сформированной плаценте производные трофобласта обеспечивают газообмен, а также снабжение зародыша минеральными и органическими веществами. Плацентарные структуры, включающие в себя трофобласт, выполняют две основные функции. Во-первых, они образуют обширную поверхность обмена веществ между зародышевой и материнской кровью («транспортный и барьерный трофобласт»). Во-вторых, клетки трофобласта тесно взаимодействуют с тканями материнского организма (путем контакта с эндометрием или инвазии в стенку матки) и продуцируют ряд гормонов, цитокинов и факторов роста, способствующих длительному совместному существованию в течение беременности полуаллогенных организмов матери и плода (Хаитов, Вербицкий, 1986), некоторые авторы определяют его как «инвазивный и эндокринный трофобласт», (Cross et al, 2003). Поэтому изучение дифференцировки и структурно-функциональной организации различных популяций клеток трофобласта в ходе установления многообразных и сложных взаимоотношений с клетками материнского организма является актуальной проблемой биологии клетки и биологии развития, включая исследования проблемы тканевой совместимости. Результаты подобных исследований могут иметь большое практическое значение, т.к. выяснение механизмов формирования таких клеточных популяций в условиях взаимодействия с полуаллогенными материнскими тканями может способствовать выяснению причин нарушений беременности и созданию методов их лечения, что представляет несомненный интерес для борьбы с бесплодием и решения других медицинских проблем.
При всем разнообразии строения плацент различных таксономических групп млекопитающих вышеупомянутые два типа популяций клеток трофобласта и образуемые ими структуры составляют основу организации плацент. Кроме того, отдельные популяции клеток трофобласта обладают значительным пролиферативным потенциалом. Они включают в себя камбиальные или стволовые клетки, способные давать начало как клеточным популяциям, осуществляющим питание и газообмен, так и инвазивным клеткам трофобласта.
Особое внимание исследователей в последние годы привлекает вопрос о соотношении способности клеток трофобласта инвазировать в стенку матки с возможностью их пролиферации или репродукции генома (Е. Zybina, Т. Zybina, 1996, Kaufmann and Castellucci, 1997, Bischof and Сатрапа, 1997, E. Zybina et al, 2000). При этом пока еще мало исследована роль различных способов клеточной репродукции и умножения генома (обычный митоз, полиплоидизирующий митоз, эндоредупликация и др.) в дифференцировке клеток трофобласта, обладающих и не обладающих способностью к инвазии в материнские ткани, и поэтому играющих различную роль в формировании плаценты. Такого рода исследование представляет несомненный интерес и в свете интенсивно развиваемой в настоящее время концепции соотношения клеточной дифференцировки и соматической полиплоидизации (Бродский, Урываева, 1981; Brodsky, Uryvaeva, 1985; Урываева, 1979, 1987; Анисимов, 1997а, б, в, г, Анисимов, Кирсанова, 2002).
Основная цель настоящей работы состояла в исследовании механизмов клеточной репродукции при дифференцировке популяций клеток трофобласта, обладающих разной степенью инвазивности, в ходе формирования плаценты млекопитающих Конкретные задачи сводились к следующему:
1. Исследовать динамику и механизмы полиплоидизации камбиальных клеточных популяций трофобласта грызунов как одного из источников клеток, способных к инвазии в decidua basalis . Оценить пролиферативную активность этих клеток в зависимости от степени их плоидности.
2. Исследовать активность ядрышкового организатора камбиальных клеток трофобласта в ходе их дифференцировки в плаценте грызунов.
3. Провести электронномикроскопическое исследование камбиальных клеток трофобласта крысы с различным направлением и степенью дифференцировки.
4. Изучить особенности деполитенизации и фрагментации инвазивных гигантских клеток трофобласта восточноевропейской полевки.
5. Изучить взаимосвязь между особенностями репродукции дифференцирующихся третичных гигантских клеток трофобласта крысы и их способностью к инвазии вглубь эндометрия.
6. Исследовать динамику и механизмы полиплоидизации клеток трофобласта в эндотелиохориальной плаценте хищных.
7. Исследовать закономерности репродукции клеток вневорсиночного трофобласта в ходе дифференцировки инвазивного фенотипа в гемохориальной плаценте человека.
Основные положения, выдвигаемые на защиту
1. Клетки камбиальных клеточных популяций трофобласта грызунов и хищных, являющиеся источником инвазивных клеток трофобласта, в ходе дифференцировки могут достигать уровня плоидности 64с. В своем жизненном цикле клетки проходят несколько этапов: вначале они делятся митозом, однако с началом полиплоидизации их способность к полному прохождению митоза снижается. Параллельно возрастает вероятность реституционных митозов, и по достижении уровней плоидности более 8с клетки полностью переходят на цикл эндоредупликации.
2. Смена способов репродукции камбиальных клеток трофобласта сопровождается • их разнонаправленной дифференцировкой, проявлением которой являются изменения активности и структурно-функциональной организации ЯОР и приобретение клетками специфических черт ультраструктуры ядра и цитоплазмы.
3. Наиболее глубокая инвазия тканей стенки матки при нормальной беременности осуществляется клетками, обособившимися из непрерывного слоя трофобласта, при этом их плоидность (8с-64с у крысы и 2-8с у человека) не является максимальной для данного вида. Прохождение ими одного или нескольких циклов эндоредупликации с последующим полным прекращением репликативных процессов делает маловероятным возобновление пролиферации клеток трофобласта внутри аллогенных материнских тканей.
4. Видовые различия в уровнях плоидности различных популяций клеток трофобласта обусловлены как видоспецифичной степенью их инвазивности, так и пространственно-временными особенностями развития плацент млекопитающих в эмбриогенезе.
Формирование клеточных популяций трофобласта и decidua при плацентации у грызунов
Трофобласт представляет собой особую популяцию клеток развивающегося зародыша млекопитающих, которые первыми осуществляют его связь с материнским организмом, а впоследствии играют важную и, по-видимому, многообразную роль в формировании различных отделов плаценты. Обособление клеток трофобласта начинается уже во время дробления: в образовавшейся бластоцисте слой клеток, окружающих ее полость, и скопление клеток на одном из полюсов получили название трофобласта или трофэктодермы. Трофэктодерма в свою очередь подразделяется на муральный трофобласт, окружающий полость бластоцисты, и полярный трофобласт, который покрывает снаружи внутренние клеточные массы - скопление клеток, обращенное в полость бластоцисты, из которого развивается зародыш (Cardner, 1972; Johnson et al, 1981; Chavez et al, 1984; Дыбан, 1988). Процесс имплантации и динамика установления трофобластом тесных взаимоотношений с тканями матки в ходе имплантации зародыша и плацентации подробно изложена в 1-й главе монографии Е.В. Зыбиной «Цитология трофобласта» (1986). В формировании фетальной части плаценты крысы основное участие принимают клетки трофобласта, являющиеся производными эктоплацентарного конуса и хориальнои пластинки: вторичные и третичные гигантские клетки трофобласта, а также клетки камбиальных отделов плаценты - соединительной зоны и лабиринтного отдела (Bridgman, 1948; Orsini, 1954). Если при инвазии эктоплацентарного конуса вглубь decidua basalis лишь единичные вторичные гигантские клетки могли отделяться и мигрировать по межклеточным и лакунарным пространствам decidua basalis, то при дифференцировке третичных гигантских клеток трофобласта происходит массовое выселение их из эктоплацентарного конуса, а впоследствии из соединительной зоны плаценты в decidua basalis.
Обособляясь от основной популяции клеток трофобласта, они, по-видимому, мигрируют быстрее, чем вторичные гигантские клетки, и удаляются на значительное расстояние от зародышевой части плаценты. Если вначале (на 10-е сут развития) третичные гигантские клетки перемещаются в мезометральном направлении по стенкам имплантационной камеры, и в просвете кровеносных сосудов, то в последующие дни развития передвижение клеток трофобласта ограничено в основном центральным артериальным каналом (Е. Зыбина, 1986). Вполне сформированная плацента грызунов состоит из тканей зародышевого происхождения (трофобласт, мезенхима и сосуды аллантоиса) и материнского происхождения (децидуальная оболочка, в состав которой входят децидуальные и соединительнотканные клетки эндометрия, артерии, капилляры и синусоидные лакунарные пространства с материнской кровью, Mossman,-1937; Bridgman, 1948; Жемкова, 1956; Padycula, Richardson, 1963). В фетальной части плаценты располагается соединительная зона, называемая в современной литературе также спонгиотрофобластом. Соединительная зона лежит между слоем вторичных гигантских клеток и лабиринтным отделом. Внутри соединительной зоны находится система лакун с материнской кровью, ограниченных со всех сторон клетками трофобласта. Трофобласт соединительной зоны плаценты состоит из двух субпопуляций: гликогенсзых клеток и клеток трофоспонгиума (Jollie, 1965). Гликогеновые клетки получили свое название по наличию в цитоплазме большого количества гранул гликогена (glycogen cell - Bridgman, 1948); они располагаются «островками» или «гнездами», которые снаружи окружены более крупными, отростчатыми клетками трофоспонгиума (Jollie, 1965). Лабиринтный отдел расположен в глубине фетальной части плаценты. Он возникает на 12-е сут развития зародыша в результате врастания сосудов аллантоиса в хориальную пластинку (Жемкова, 1956; Dickson, Bulmer, 1960; Jollie, 1964). Так происходит формирование хориоаллантоидной плаценты с двумя кругами кровообращения - материнским и зародышевым. Плацента грызунов относится к гемохориальному типу, при котором степень контакта клеток трофобласта с материнской кровью является максимальной. Маточный эпителий, часть стромы и сосудов эндометрия деградируют под воздействием трофобласта. Излившаяся материнская кровь омывает трофобласт. Таким образом, в гемохориальной плаценте трофобласт непосредственно контактирует с кровью материнского организма. У грызунов такой непосредственный контакт осуществляется в слое вторичных гигантских клеток трофобласта, а также в соединительной зоне и в лабиринтном отделе плаценты. Здесь клетки трофобласта омываются материнской кровью, протекающей по лакунарным пространствам (Snell, 1941; Жемкова, 1956; Enders et al, 1998). В лабиринтном отделе плаценты сосуды, приносящие кровь зародыша, выстланы тремя слоями трофобласта: наружным - клеточным слоем и двумя синцитиальными, при этом внутренний синцитиальный слой прилежит непосредственно к эндотелию кровеносных сосудов (Hernandez-Verdun, Legrand, 1971; Metz, 1980; Wooding, Flint, 1994; Enders et al, 1998). Таким образом, несмотря на тесное расположение сосудов, содержащих материнскую кровь и кровь зародыша, они отделены друг от друга барьером из клеток трофобласта и эндотелия. Сосуды с кровью зародыша в лабиринте четко отличаются от лакун с материнской кровью тем, что эритроциты зародыша содержат ядра (Жемкова, 1956). Если на ранних этапах эмбрионального развития - с момента имплантации зародыша и до формирования плаценты питание осуществляется гистиотрофным путем (Amoroso, 1952; Жемкова, 1956), то в сформированной хориоаллантоиднои плаценте грызунов сильное сближение в лабиринтном отделе не смешиваемых кровеносных систем матери и плода делает возможным газообмен и снабжение зародыша минеральными и органическими веществами. С этой точки зрения некоторые авторы уподобляют ткани плаценты легким, почкам, кишечнику, печени и другим органам взрослого организма, функции которых на ранних этапах развития, по-видимому, восполняются плацентой (Padycula, Richardson, 1963). В литературе имеются данные различного характера о том, какие факторы могут влиять на формирование отделов фетальной части плаценты. Так, например, у мутантов мышей Т/+ с укороченным хвостом наблюдается замедленное развитие лабиринтного отдела плаценты из-за аномалий в системе кровообращения зародыша, препятствующих формированию системы сосудов аллантоиса в лабиринтном отделе плаценты (Kuno, 1979). При овариоэктомии на. 10-й день беременности наблюдалось замедление пролиферации, а затем - полное торможение развития, как соединительной зоны, так и лабиринтного отдела плаценты, приводящее к дегенерации всех элементов плаценты (Bulmer, Peel, 1979). Материнская часть плаценты возникает в результате быстрой пролиферации соединительнотканных клеток эндометрия и превращением слизистой оболочки матки локально в месте имплантации зародыша в децидуальную ткань. Детальное описание децидуальнои реакции и развития децидуальных оболочек дается в монографии Е.В. Зыбиной «Цитология трофобласта» (1986), и в работах В.М. Михайлова (1998, Mikhailov, 2003). Наряду с децидуальными клетками, в состав децидуальнои ткани входят клетки метриальной железы. Отличительной особенностью их морфологии является присутствие в цитоплазме большого числа специфических округлых PAS-положительных, т.е. содержащих гликоген, гранул (Bulmer et al, 1987). Они возникают при развитии децидуальнои реакции в период имплантации и плацентации зародыша у грызунов (Orsini, 1954, Е. Зыбина, 1958; Dickson, Bulmer, 1961; Pijnenborg et al, 1974) и человека (King et al, 1998). Гранулярные клетки метриальной железы (ГКМЖ) располагаются не только в слизистой, но также в мышечной и серозной оболочке стенки матки (Selye, McKeown, 1935). Они появляются в строме эндометрия в период имплантации, и их число возрастает в decidua basalis, начиная с 5 сут post coitum (рс) у мыши и с 7 сут рс у крысы (Bulmer et al, 1987). На 8 сут рс у мыши и 9 сут рс у крысы ГКМЖ начинают накапливаться в мезометральном треугольнике, располагаясь над мышечными волокнами и между ними (Bulmer et al, 1987). К 12-13 сут рс у мыши клетки мембральной железы достигают пика своего развития, будучи распределенными в строме decidua basalis и компактно располагаясь в метриальной железе (Kusakabe et al, 1999; Wang et al, 2000). ГКМЖ в decidua basalis крысы постепенно исчезают после 14 сут рс (Dikson, Bulmer 1961), но у мыши они присутствуют почти до конца беременности (Bulmer, Peel, 1987).
Ядрышковый организатор - его локализация и функциональная организация на метафазных хромосомах и в интерфазном ядре
В настоящее время ядрышко по-прежнему привлекает к себе внимание исследователей как одна из структур ядра, отражающая уровень транскрипционной активности ядрышкового организатора. Известно, что состояние компонентов ядрышка в интерфазном ядре может быть также обусловлено степенью дифференцировки. Поэтому для характеристики процесса цитодифференцировки каждого типа клеток весьма важно охарактеризовать ход изменений активности ядрышкового организатора, проявляющийся, в частности в преобразовании структурных компонентов ядрышка.
Уже в 80-90-х годах 20 века сформировалось представление об основных компонентах ядрышка и их функциональной роли, которое не утратило своего значения к настоящему времени (Mirre, Stahl, 1981; Goessens, 1984; Hernandez-Verdun, 1983, 1986, 1991; Raska etal, 1990; Raska, Dundr, 1993).
В последнее время появилось много работ относительно организации ядрышка как места экспрессии генов, кодирующих рибосомную РНК. На ультраструктурном уровне исследована локализация синтеза рРНК (Raska, Dundr, 1993; Le Pense et al, 1999; Мухарьямова, Зацепина, 2001; Смирнова и др., 2002). Применение молекулярно-биологических и иммуноцитохимических подходов привело к накоплению данных о белках, участвующих в регуляции транскрипции и процессинге рРНК (Hernandez-Verdun, 1991; Robert-Fortel et al, 1993; Garcia-Blanco et al, 1995; Weisenberger, Sheer, 1995; Jordan et al, 1996; Le Panse, 1999; Смирнова и др., 2002 и др.)
Хорошо известно, что ядрышко является местом синтеза и созревания рибосомной РНК и включает в себя множество копий рибосомных генов, а также аппарат, необходимый для транскрипции 458-предшественников рибосомной РНК и ферменты, необходимые для процессинга (Goessens, 1984; Raska et al, 1990, 1993; Hernandez-Verdun, 1991; Suja et al, 1997; Le Panse, 1999 и др.) Кластеры генов, кодирующих 18S и 28S рРНК, локализованы в определенных районах ядрышкообразующих хромосом - т. е. в т.н. районах ядрышкового организатора - ЯОР (Bush, Smetana, 1970; Goessens, 1984; Mamaev, Mamaeva, 1990; Hernandez-Verdun, 1991). Количество хромосом, в которых локализованы ЯОР, является постоянным признаком кариотипа каждого вида млекопитающих. Так, у лабораторных мышей Mus musculus рибосомные гены локализованы в ЯОР хромосом 12, 15, 16, 18 и 19 (Atwood et al, 1976; Henderson et al, 1976, 1979; Dev et al, 1977), а у лабораторных крыс Rattus norvegicus - в ЯОР хромосом 3, 11 и 12 (Капо et al, 1976; Sasaki et al, 1986). Важно отметить, что не все, а только часть ЯОР в клеточном геноме являются активными в отношении синтеза рибосомной РНК. Для выявления активных ЯОР используется метод окрашивания нитратом серебра, который позволяет визуализировать те кластеры рибосомных генов, которые были транскрипционно активными в предшествующей интерфазе (так называемые Ag-ЯОР, см. обзоры Howell, 1982; Hubbell, 1985 и др.) Так, в кариотипе некоторых линий мышей визуализируются лишь 3-4 пары хромосом с Ag-ЯОР (Мамаева, 1984). Установлено, что не только число хромосом с Ag-ЯОР, но и рисунок окрашивания района ЯОР серебром является величиной относительно постоянной для индивида и генетически детерминирован (Arruga, Monteagudo, 1989).
Комбинаторика ЯОР хромосом, имеющих разное количество копий рибосомных генов, обусловливает межиндивидуальный полиморфизм выявления активных кластеров рДНК у человека, проявляющийся как в вариабельности числа Ag-ЯОР хромосом, так и в характере окрашивания ЯОР серебром (Ляпунова и др., 1989, 1998). Уровень экспрессии рибосомных генов, локализованных в отдельных ЯОР, может варьировать от клетки к клетке (Созанский, 1983; De Сароа et al, 1991). Характер рисунка Ag-ЯОР может изменяться в зависимости от типа клеток (Pathak et al, 1979; Dumont et al, 1989), вида ткани (Mikelsaar, Schwarzacher, 1978; De Capoa et al, 1991). Значительная вариабельность числа Ag-позитивных ЯОР была обнаружена в эмбриогенезе мышей и кроликов (Martin de Leon et al, 1978; Паткин, Сорокин, 1983; Дыбан и др., 1989, Dyban et al, 1990).
Природа окрашивания серебром мест локализации ядрышкового организатора обусловлена наличием разнообразных специфичных для ядрышка кислых белков. К этим белкам относятся белки, играющие ключевую роль в транскрипции рДНК: РНК-полимераза I (Sheer, Rose, 1984; Weisenberger, Sheer, 1995), топоизомераза I (Guldner et al, 1986), транскрипционный фактор UBF (Chan et al, 1991; Roussel et al, 1993; Zatsepina et al, 1993), TATA-связывающий фактор (Jordan et al, 1996, Roussel et al, 1996). Кроме того, сюда относятся белки, участвующие в процессинге, а именно, нуклеолин и В23 (Hernandez-Verdun, 1991; Savino et al, 1999 и др.)
В последние годы удалось выяснить, что белки-компоненты аппарата транскрипции рДНК в ходе митоза остаются связанными с определенными районами ЯОР. Это РНК-полимераза I и ее транскрипционные факторы - UBF и фактор-промотор селективности или ТАТА-связывающий белок, ТВР (Roussel et al, 1996). Колокализация этих белков в клетках культуры HeLa наблюдалась с районами ЯОР определенных метафазных хромосом, а в других ЯОР подобного иммуномечения не обнаруживалось. Поскольку известно, что фактор UBF в митозе локализуется в районах ЯОР, окрашиваемых нитратом серебра (Roussel et al, 1993; Zatsepina et al, 1993), мечение определенных ЯОР серебром, по-видимому, отражает их связь с компонентами транскрипционной «машины» рДНК. Мечение клеток культуры HeLa антителами к бромуридинтрифосфату (Br-UTP) позволило выявить транскрипцию в районах ЯОР, начиная со стадии телофазы. На этой стадии выявлялось такое же количество сайтов транскрипции, как и мест локализации РНК-полимеразы I и UBF на метафазных пластинках. В телофазе сайты транскрипции, выявляемые путем мечения Br:UTP, также совпадали с местами локализации РНК-полимеразы I и UBF (Roussel et al, 1996). Таким образом, при возобновлении транскрипции в телофазе только ЯОР, связанные с транскрипционными комплексами, проявляют транскрипционную активность, и уровень ее связан с количеством компонентов транскрипционной «машины». Следовательно, ассоциация кластеров рДНК со своей транскрипционной «машиной» определяет, какие из ЯОР и в какой степени будут активными при переходе клетки из митоза в интерфазу (Roussel et al, 1996). Связь транскрипционной активности ядрышка в интерфазе с присутствием зон ядрышка, окрашенных серебром, наблюдалась во многих тканях в работах целого ряда исследователей (Howell, 1977; Raman, Sperling, 1981; Schwarzacher et al, 1978; Goessens-, Lepoint, 1982; Crocker, 1990; Mamaev, Mamaeva, 1990), хотя и не всегда обнаруживается прямая корреляция между интенсивностью окрашивания серебром и уровнем транскрипционной активности. Существуют предположения о том, что некоторые из кислых белков, обусловливающих окраску АдІМОз, поддерживают рДНК в деспирализованном состоянии (Hernandez-Verdun et al, 1984). О том, что рДНК находится именно в таком состоянии, свидетельствуют данные работы Ангелье с соавторами (Angelier et al, 1982), а также серии работ Эрнандес-Верден и Дерензини с соавторами (Hernandez-Verdun et al, 1984; Derensini et al, 1982, 1983, 1985, 1987, 1988). Визуализация транскрипционных единиц, выделенных из ядрышек ооцитов тритона с помощью метода Миллера, свидетельствует о том, что транскрипция происходит на участках рДНК, которые не имеют нуклеосомнои структуры (Angelier et al, 1982). Применение Фельгено-подобной осмий-аминной реакции на ультраструктурном уровне в сочетании с окраской AgN03, показало, что основная масса хроматина метафазных хромосом линии TG человека имеет отчетливо выявляемую нуклеосомную конфигурацию.
Клетки метриальнои железы при формировании плаценты крысы и их полиплоидизация
Для цитоспектрофотометрического исследования содержания ДНК в ядрах клеток трофобласта использовали постоянные давленые препараты. Для этого кусочки материала, фиксированного в спирт-уксусной смеси, мацерировали в 45% уксусной кислоте в течение 20 мин, помещали на предметное стекло, измельчали и покрывали покровным стеклом. Такие препараты помещали на сухой лед, и от замороженных препаратов отделяли покровные стекла. Препараты высушивали и обрабатывали по Фельгену как описано выше.
Сходный метод был использован для приготовления давленых препаратов кончиков ворсин хориона человека. Кончики ворсин, выделенные с помощью стереомикроскопа, фиксировали на предметном стекле охлажденной этанол-уксусной смесью (3:1) в течение 20 мин, и мацерировали 45%-й уксусной кислотой в течение 10 мин. Затем, не измельчая, препарат покрывали покровным стеклом и замораживали сухим льдом или жидким азотом. Высушенные препараты распластанных кончиков хориальных ворсин обрабатывали по Фельгену, либо окрашивали DAPI (10 мкг/мл, 2xSSC, в течение 5 мин).
Эталоном гаплоидного и диплоидного содержания ДНК служили результаты измерения содержания ДНК в ядрах, спермиев и лимфоцитов периферической крови. Для приготовления мазков спермиев кусочки семенников помещали в физиологический раствор, размельчали, делали мазки на стеклах и фиксировали метиловым спиртом; мазки периферической крови также фиксировали метиловым спиртом (Кудрявцева и др., 1977). Препараты спермиев и лимфоцитов обрабатывали по Фельгену при тех же условиях, что и препараты клеток плаценты.
Измерение содержания ДНК в ядрах и митотических фигурах различных клеточных популяций трофобласта крысы, кролика, восточноевропейской полевки, серебристо-черной лисицы и норки, а также содержания ДНК одновременно в ядрах и в тельцах Барра (инактивированной Х-хромосомы) гигантских клеток трофобласта кролика проводили методом абсорбционной цитофото метрии.
Для определения интегральной оптической плотности, отражающей содержание ДНК в условных единицах в ядрах и митотических фигурах, был использован автоматический анализатор изображений «Морфоквант» (К. Цейс, Йена, Германия), снабженный мини-ЭВМ. Источником монохроматического излучения служила галогеновая лампа; измерения проводили с использованием интерференционного фильтра с длиной волны 550 нм при увеличении 50х. Для цитофотометрии в каждом случае использовали по 300-600 ядер и 200-400 митотических фигур. Для определения соотношения между содержанием ДНК в ядрах и тельцах Барра гигантских клеток трофобласта кролика ядра клеток трофобласта, спермиев и лимфоцитов фотографировали в монохроматическом свете с длиной волны 546 нм на микроскопе МУФ-6 на пленку ФТ-31. Негативы с изображением ядер исследуемых клеток вместе с изображением ступенчатого ослабителя фотографировали на микрофотометре МФ-4. По результатам фотометрирования каждого из объектов определялась их средняя оптическая плотность. Для получения данных о площади ядер и телец Барра вначале производилась обрисовка их контуров при помощи фотоувеличителя при одном и том же увеличении (15х), затем площади всех объектов измеряли с помощью планиметра ПП-2К. Содержание ДНК в каждом ядре и в тельце Барра определялось по формуле Q = D S, где Q содержание ДНК в условных единицах, D - средняя оптическая плотность данного объекта, S - площадь объекта.
При статистической обработке количественных данных о содержании ДНК были использованы следующие методы. В большинстве случаев по результатам измерений производили построение гистограмм распределения содержания ДНК в ядрах и митотических фигурах и сопоставляли полученные данные с эталонными значениями гаплоидного и диплоидного содержания ДНК. По данным гистограмм определяли уровни плоидности ядер в данной выборке, а также процентное соотношение ядер, относящихся к каждому из классов плоидности. Митотические фигуры с содержанием ДНК 4с считали соответствующими митозам диплоидных клеток, т.к. в обычном митотическом цикле клетка входит в митоз, уже претерпев редупликацию хромосом р S-периоде. Аналогично митотические фигуры с содержанием ДНК 8с и 16с считали относящимися к митозам соответственно тетраплоидных и октаплоидных клеток. Для того чтобы определить, какие фазы митоза могут проходить клетки того или иного уровня плоидности, общую гистограмму для всех митотических фигур разбивали по фазам митоза. По этим данным вычисляли процентное соотношение митотических фигур четырех видов: а) диплоидные (4с) профазы и метафазы, б) диплоидные (4с) анафазы и телофазы, в) полиплоидные (8с, 16с) профазы и метафазы, г) полиплоидные (8с, 16с) анафазы и телофазы. Это позволяло определить, насколько изменяется соотношение клеток на ранних и поздних фазах митоза при полиплоидизации. Для оценки пропорциональности содержания ДНК в ядрах трофобласта и тельцах Барра вычисляли отношение содержания ДНК в целых ядрах клеток трофобласта к содержанию ДНК в тельцах Барра тех же ядер. Для этого также вычисляли коэффициент корреляции и коэффициент ранговой корреляции между содержанием ДНК в ядре и в тельце Барра (Лакин, 1973). Коэффициент ранговой корреляции вычисляли по формуле:
Закономерности репродукции инактивированнои Х-хромосомы при политенизации обплацентарных гигантских клеток трофобласта кролика
В обплацентарной зоне слизистой оболочки матки на стороне, противоположной плаценте у зародышей кролика встречается большое количество гигантских клеток трофобласта (Жемкова, 1956). Эти клетки обособляются из абэмбриональной части бластоцисты и инвазируют вглубь слизистой оболочки матки. Отдельные клетки обплацентарного трофобласта или их скопления располагаются в строме эндометрия обособленно от плаценты, оставаясь жизнеспособными в течение большей части беременности.
Согласно данным цитофотометрического определения содержания ДНК, степень плоидности ядер обплацентарных гигантских клеток трофобласта (ГКТ) кролика составляла 16с-256с. Было проведено одновременное определение содержания ДНК в ядре и в тельцах Барра (ТБ). Результаты такого исследования свидетельствуют о том, что на всех уровнях плоидности в гигантском ядре сохранялось единственное ТБ, размеры которого и содержание в нем ДНК возрастало с увеличением уровня плоидности. Аналогично тому, как была определена степень плоидности ядер, определялась «степень плоидности» ТБ. Под «степенью плоидности» в данном случае понимается кратность содержания ДНК в ТБ полиплоидного ядра содержанию ДНК в ТБ диплоидного ядра. Предполагая, что самый низкий класс плоидности исследованных ГКТ (16с) содержит 16 инактивированных X-хромосом, для ТБ можно выделить те же классы «плоидности», что и для целых ядер, т.е. 16с, 32с, 64с, 128с и 256с. Распределение ТБ по степени «плоидности» почти полностью совпадало с распределением по уровням плоидности целых ядер (рис. 38). Это свидетельствует в пользу достаточно точного соответствия между прохождением циклов удвоения ДНК в ядре и отдельно в инактивированнной Х-хромосоме.
Коэффициент корреляции между содержанием ДНК в ядре и в ТБ в обплацентарных ГКТ кролика (г = 0,48 + 0,06) и коэффициент ранговой корреляции Спирмена (р = 0,51 + 0,06) свидетельствует о наличии положительной. корреляции между этими величинами. Почти полное совпадение коэффициента корреляции и коэффициента ранговой корреляции указывает на прямолинейный характер зависимости. Таким образом, как и во вторичных ГКТ крысы (Е. Зыбина и Мосьян, 1967), в обплацентарных ГКТ кролика наблюдается умножение материала инактивированной Х-хромосомы без увеличения числа ТБ. Это свидетельствует в пользу политенизации ядер обплацентарных ГКТ кролика.
Данные о полиплоидии трофобласта в плаценте человека до настоящего времени являются достаточно фрагментарными. Присутствие ядер как с диплоидным, так и полиплоидным содержанием ДНК было показано в ряде работ в клетках цитотрофобласта человека (Зуева и др., 1989; Wakuda, Yoshida, 1992; Berezowsky et al, 1995; Potgens et al, 2001). Известно, что в клетках трофобласта плаценты человека (как в норме, так и в малигнизированных опухолях) встречаются картины эндомитоза (Sarto et al, 1982; Therman, 1986). Однако, еще не было известно, в каких популяциях трофобласта плаценты человека встречается полиплоидия, и не было ничего известно о возможной корреляции между полиплоидией и инвазией трофобласта.
Целью настоящей работы было исследовать возможности полиплоидизации вневорсиночного трофобласта (ВВТ) в ходе его инвазии в эндометрий в нормальной плаценте человека в первом триместре беременности. Для точной идентификации клеток трофобласта, инвазирующих в ткани матки, цитофотометрическое измерение содержания ДНК проводилось параллельно с иммуноцитохимическим мечением цитокератина как маркера клеток трофобласта. Параллельно была оценена способность клеток трофобласта к прогрессии клеточного цикла с помощью иммуноцитохимического мечения белка Ki-67 - маркера клеток, находящихся в клеточном цикле (Starborg et al, 1996; Bridger et al, 1998).
Было проведено цитофотометрическое измерение содержания ДНК в следующих субпопуляциях клеток вневорсиночного трофобласта, соответствующих различным стадиям инвазивного пути в плаценте человека (рис. 39, 40): а) Стволовые клетки клеточных колонн (КК), прилежащие к базальной мембране и активно делящиеся митотически;
Стволовые клетки ВВТ оказались в большинстве случаев диплоидными; небольшое количество тетраплоидных клеток (13,8+2.3%) может быть отнесено к Єг-фазе. Встречаемость тетраплоидных клеток повышалась до 28,0+1,7% в проксимальной части КК, имеющей высокую пролиферативную активность. Применение критерия %2 показало, что увеличение доли тетраплоидных клеток является статистически достоверным. В дистальной части КК доля тетраплоидных клеток ВВТ (58,0+1,5%) превышает таковую диплоидных (38,1+1,5%), кроме того, появляется некоторое количество октаплоидных клеток (3.5+0.7%) и единичные клетки 16с. Митотическая активность в этой зоне прекращается. В субпопуляции клеток, прилежащих к децидуализированному эндометрию, но не инвазирующих в него, встречаемость тетраплоидных клеток оказалась наивысшей (74,7+1,7%), а доля октаплоидных клеток возрастала до 4,9+0,8%. Клетки ВВТ, инвазирующие внутрь децидуализированного эндометрия, также оказались преимущественно полиплоидными: доля октаплоидных клеток возрастала до 9,7+1,0%, появлялось уже заметное количество клеток 16с (1,4+1,0%), тем не менее на этой стадии возрастала доля диплоидных клеток - до 29,2+1,2%, и за счет этого количество полиплоидных клеток в целом уменьшалось (рис. 41 д, 42). Та же тенденция наблюдалась и в группе клеток ВВТ, инвазирующих в миометрий (рис. 41 е, 42) так что доля диплоидных клеток здесь достигала 46,0+0,9%, тем не менее и здесь полиплоидные клетки преобладали.
