Введение к работе
Актуальность проблеми. Современные биотехнология и биомедицина нуждаются в новых методах культивирования клеток. Одним из наиболе перспективных способов подготовки клеток для их практического использования является технология иммобилизации клеток в полимерные гели, среда которых основное место занимают полисахариды. Иммобилизация клеток позволяет увеличивать удельный выход продукта в биореакторе, создавать различные системы перфузии и перемешивания, снижать расходы на очистку конечного продукта, создавать системы, основанные на совместном культивировании нескольких штаммов клеток, повышать устойчивость клеточных популяций, экспрессирующих плазмиды, и генетических штаммов. При медицинском приложении иммобилизация обеспечивает изоляцию пересадочного материала от иммунной системы.
В организме" многоклеточных животных ткани сформированы из клеток, связанных между собой с помощью межклеточных контактов, а также с помощью находящегося между ними матрикса из гликопроте-инов и протеогликанов. Протеогликаны и их полисахаридные части -гликозаминогликаны - оказывают существенен влияние на клетки. Многочисленные свидетельства роли полисахаридов животных в регуляции Функционирования клеток позволяют предположить, что иммобилизация в гели растительных полисахаридов будет оказывать регуляторное влияние на клетки. Вместе с тем, данные о Функционировании клеток в гранулах из полисахаридов являются весьма немногочисленными и нечеткими. Вследствие этого актуальной является задача изучения воздействия на клетки полисахаридов различного происхождения в двух аспектах: как биоактивных веществ в культуре клеток и как матрицы, внутри которой заключены клетки.
Цель и задачи исследования. Цзлью работы явилось исследование Функциональных свойств клеток животных, заключенных в гранулы растительных полисахаридов и изучение влияния полисахаридов, используемых при иммобилизации, на свойства клеток в монослоиноя культуре. При этом решались следующие задачи:
-
анализ способности полисахаридов поддерживать диФФеренцировку клеток на примере первичной культуры гепатоцитов крысы;
-
изучение влияния полисахаридов на характеристики пролиферации клеток в монослойной культуре на примере первичной культурл Фибробластов человека и культур трансформированных Фибробластов;
3) оптимизация методики включения жизнеспособных клеток в полимерный гель кальций-связывающих полисахаридов и термолабильных полисахаридов; 4) исследование ростовых свойств и функциональной активности иммобилизованных делящихся клеток-продуцентов на примере клеток, гибридомы; 5) изучение Функционирования иммобилизованных клеток при органотипической иммобилизации на примере Фрагментов семенников человеческих плодов.
Научная новизна. В данной работе впервые обнаружено, что альгинат способен влиять на ростовые свойства клеток и на их Функциональную активность не только при иммобилизации внутрь альгинатных гранул, но и в виде добавки в среду культивирования, клеток. Показано, что альгинат способен: снижать индекс включения тимидина в первичных культурах фибробластов человека и эффективность клонирования трансформированных Фибробластов; стабилизировать Функцию Ферментов детоксикации дифференцированных гепато-цигов крыс в первичной культуре. Обнаружено также, что полисахариды различного происхождения в той или иной степени проявляют аналогичную альгинату способность влиять на культивируемые клетки. При культивировании в гранулах обнаружено повышенное содержание ДНК в ядрах клеток гибридомы при сохранении жизнеспособности и секреции моноклональных антител в течение длительного срока. Показана лучшая сохранность структуры и более высокая секреторная активность Фрагментов семенных канальцев эмбрионов человека в гранулах по сравнению со свободной культурой.
Практическая ценность. Создана установка для быстрого получения больших количеств гранул с иммобилизованными клетками. Усовершенствована методика получения гранул, ориентированная на клетки животных. Показана возможность использования иммобилизованных клеток гибридомы как продуцентов антител в биотехнологии. Получоны гранулы с иммобилизованными Фрагментами семенников крыс, которые могут служить в качестве трансплантатов для коррекции недостаточности мужской гормональной Функции. Совместно с Военно-медицинскоа академией и 1 С-Пб Медицинским институтом им. акад. Павлова разрабатьшаются экспериментальные модели для последующего внедрения в клиническую практику.
Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной
работе, докладывались на школе-семинаре "Иммобилизованные клетки" (Пуіщшо, 1936), Всесоюзном совощании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1987), Всесоюзном совещании "Биология клотки в культуре" (Лрпшгград, 1987), совещании "Генная и клеточная инженерия в решении Фундамонтальных проблем биотехнологи" (Тарту, 1988).
КОНфереНЦИИ "Cellular and molecular Ьавів of liver cirrosle"
(Неппвв. 1991), Седьмой международной конференции Международного
Общества ДИФФереНЦИрОВКИ "Cellular, programmes for growth, differentiation, and пеоріавіа", (Неівіпкі, 1D92)
Публикации. По томе диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах иашинопописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит источников.
