Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Регуляторные пептиды как особый класс биологически активных веществ 19
1.2. Участие опиоидных пептидов в процессах поддержания тканевого гомеостаза 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Характеристика исследуемых веществ 35
2.2. Характеристика исследуемых клеточных популяций 36
2.3. Методика проведения экспериментов 38
2.4. Метод индометацин-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка 41
2.5. Метод этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка 43
2.6. Определение площади поражения слизистой оболочки желудка 45
2.7. Гистологическая обработка экспериментального материала 46
2.8. Метод авторадиографии 46
2.9. Иммуногистохимический метод определения уровня экспрессии Ki-67 49
2.10. Иммуногистохимический метод детекции апоптоза 50
2.11. Определение гистамина флюориметрическим методом 51
2.12. Хемилюминесцентный анализ 52
2.13. Статистическая обработка экспериментальных данных 52
ГЛАВА 3. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях 54
3.1. Состояние вопроса 54
3.1.1. Участие синтетического лиганда опиоидных рецепторов даларгина в регуляции физиологических процессов 54
3.1.2. Участие даларгина в регуляции тканевого гомеостаза 61
3.2. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в
слизистой оболочке желудка белых крыс 64
3.2.1. Влияние пятикратного введения лей-энкефалина Tyr–Gly–Gly–Phe–
Leu на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс 65
3.2.2. Влияние пятикратного введения [D-Аla]2-лей-энкефалина Tyr–D-
Ala–Gly–Phe–Leu на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс 66
3.2.3. Влияние пятикратного введения НАЛЭ Phe – D – Ala – Gly – Phe – Leu – Arg на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс 66
3.2.4. Влияние пятикратного введения даларгина Tyr – D-Ala – Gly – Phe – Leu – Arg на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс 68
3.3. Влияние даларгина на фоне блокады NOS на синтез ДНК в СОЖ белых крыс 68
3.4. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободно- радикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс 69
3.4.1. Влияние лей-энкефалина Tyr – Gly – Gly – Phe - Leu на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс 69
3.4.2. Влияние [D-Аla]2-лей-энкефалина Tyr–D–Ala–Gly–Phe–Leu на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс 70
3.4.3. Влияние НАЛЭ Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg на процессы свободно-радикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс 72
3.4.4. Влияние даларгина Tyr – D-Ala – Gly – Phe – Leu – Arg на
процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка
белых крыс 73
3.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободно-
радикального окисления в сыворотке крови белых крыс 73
ГЛАВА 4. Влияние опиоидных пептидов на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в условиях патологии 82
4.1. Состояние вопроса 82
4.2. Механизмы поддержания тканевого гомеостаза при НПВП- гастропатиях 84
4.2.1. Участие центрального звена интегративных систем в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВП- гастропатиях 84
4.2.2. Участие местных факторов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях 85
4.2.3. Состояние свободнорадикальных процессов при НПВП-гастропатиях 90
4.3. Механизмы нарушения тканевого гомеостаза под влиянием этанола 92
4.4. Современные направления профилактики гастропатий 9797
4.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в условиях патологии 100100
4.5.1. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцируемого индометацином 100
4.5.2. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших индометацин 112
4.5.3. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на свободнорадикальный статус в слизистой оболочке желудка и крови животных, получавших индометацин 114
4.5.4. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших индометацин на фоне блокады NOS 121
4.5.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на концентрацию гистамина в тканях желудка белых мышей, получавших индометацин 123
4.6. Влияние даларгина на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом 125
4.6.1. Влияние даларгина на процессы пролиферации слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом 125
4.6.2. Влияние даларгина на процессы апоптоза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом 132
4.7. Влияние даларгина на тканевой гомеостаз на модели этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка 134
4.7.1. Влияние даларгина на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцируемого этанолом 135
4.7.2. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол 138
4.7.3. Влияние даларгина на свободнорадикальный статус в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол 139
Глава 5. Влияние ренин-ангиотензиновой системы на процессы синтеза днк и свободнорадикальное окисление в слизистой оболочке желудка 142
5.1. Состояние вопроса 142
5.1.1. Система ренин-ангиотензина, ее участие в морфогенетических процессах 142
5.2. Влияние ангиотензина II на состояние тканевого гомеостаза в различных клеточных популяциях белых крыс 153
5.2.1. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка белых крыс 154
5.2.1.1. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка половозрелых белых крыс 154
5.2.1.2. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы в эпителиоцитах желудка новорожденных белых крыс 155
5.3.1. Влияние эналаприла на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях 159
5.3.1.1. Влияние эналаприла на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка в физиологических условиях 159
5.3.1.2. Влияние эналаприла на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка животных в физиологических условиях 160
5.4.1. Влияние эналаприла на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при этанол-индуцированном повреждении слизистой оболочки желудка 161
5.4.1.1. Влияние эналаприла на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцированного этанолом 161
5.4.1.2. Влияние блокады NOS на площадь повреждения слизистой болочки желудка, индуцированного этанолом, у животных, получавших эналаприл 165
5.4.2. Влияние эналаприла на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол 167
5.4.3.1. Влияние эналаприла на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол 168
5.4.3.2. Влияние блокады NOS на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка у животных, получавших этанол на фоне введения эналаприла 171
5.5. Влияние ингибиторов АПФ на процессы пролиферации у больных с хроническим гастритом, сочетающимся с артериальной гипертонией 172
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов исследования 180
Выводы 194
Список литературы 196
- Методика проведения экспериментов
- Участие синтетического лиганда опиоидных рецепторов даларгина в регуляции физиологических процессов
- Участие местных факторов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях
- Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка половозрелых белых крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы. Широкое внедрение в клиническую практику эндоскопических методов исследования выявило значительную распространенность эрозивно-язвенных поражений верхних отделов пищеварительного тракта (Белова Е.В., 2004). Независимо от этиологии, нарушение целостности слизистой оболочки желудка (СОЖ) возникает вследствие дисбаланса факторов агрессии и факторов защиты. Если в отношении язвенной болезни терапевтические подходы разработаны на уровне стандартных рекомендаций, подкрепленных огромным клиническим опытом, то в отношении симптоматических гастропатий такого значительного опыта не существует. Очевидно, что задачей терапии должно быть комплексное повышение устойчивости СОЖ к повреждающим факторам - развитие адаптивной цитопротекции (Jones M.K. et al., 2010). Сложность механизмов нарушения целостности СОЖ определяет либо неизбежность полипрагмазии, либо необходимость поиска новых комплексных лекарственных средств, обеспечивающих поддержание целостности СОЖ. Такие лекарственные средства должны обладать цитопротективным и антиоксидантным действием, модулировать процессы регенерации, улучшать микроциркуляцию, нормализовывать вегетативный баланс организма, оказывать седативное влияние на ЦНС. Подобным комплексным воздействием на организм обладают некоторые регуляторные пептиды (РП) (Каменский А.А., 2010; Wu G. et al., 2011).
В последние годы достигнут значительный прогресс в исследовании внутриклеточных и тканевых механизмов поддержания тканевого гомеостаза. Достаточное внимание уделялось оценке РП, имеющих отношение к факторам, точкой приложения которых является гастроинтестинальный тракт – гастрину (Singh N. et al., 2012), соматостатину (Tarnawski A.S., Ahluwalia A., 2012), трефоиловым пептидам (Hernndez C. et al., 2009), а также факторам роста – эпидермальному (Maity B. et al., 2008), трансформирующему (Jainu M. et al., 2010), инсулиноподобному (Zhao J. et al., 2009).
Хорошо известна высокая эффективность синтетического аналога лей-энкефалина – даларгина – в комплексной терапии язвенной болезни (Алексеенко С.А., Тимошин С.С., 1996). Проведенное нами ранее клинико-экспериментальное исследование выявило выраженное позитивное влияние даларгина на течение гастропатии, индуцированной приемом нестероидных противовоспалительных препаратов (Болоняева Н.А., Животова Е.Ю. и др., 2005). Изучению участия опиоидных пептидов в регуляции функционирования гастроинтестинального тракта посвящены многочисленные исследования, однако механизмы защитного действия пептидов на эпителий слизистой оболочки желудка остаются невыясненными (Булгаков С.А., Белоусова Е.Л., 2011).
Кроме того, недостаточно изучены участие и характер действия в механизмах цитопротекции и процессах свободнорадикального окисления олигопептидов, на первый взгляд не имеющих прямого отношения к регуляции тканевого гомеостаза желудка, таких как компоненты ренин-ангиотензиновой системы.
В последние годы происходит переосмысление роли свободнорадикальных процессов в поддержании структурного гомеостаза. Соотношение физиологической и патологической компоненты в реализации эффектов активных кислородных метаболитов в каждой исследовательской ситуации решается индивидуально (Меньщикова Е.Б. и др., 2008).
Таким образом, анализ литературы и результаты проведенных нами предварительных исследований позволяют предполагать участие ряда РП в поддержании тканевого гомеостаза СОЖ. Высокая клиническая и социальная значимость проблемы поражения СОЖ, а также перспектива широкого внедрения препаратов на базе различных семейств РП в медицинскую практику, определили выбор темы данного исследования.
Цель исследования. Изучение характера и закономерностей влияния регуляторных пептидов из семейства опиоидных пептидов и компонентов ренин-ангиотензиновой системы на поддержание тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях и в условиях патологии.
Задачи исследования.
-
Изучить взаимосвязь между структурой и характером влияния лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК слизистой оболочки желудка у лабораторных животных в физиологических условиях.
-
Изучить взаимосвязь между структурой и характером влияния лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка у лабораторных животных в физиологических условиях и в условиях эрозивно-язвенного процесса.
-
Изучить характер влияния исследуемых аналогов лей-энкефалина на пролиферативный потенциал слизистой оболочки желудка при индуцированном индометацином эрозивно-язвенном поражении.
-
Исследовать участие системы NOS-NO в реализации протективного действия олигопептидов при индуцируемом индометацином эрозивно-язвенном процессе СОЖ.
-
Оценить общность механизмов гастропротекции даларгина при этанол- и индометацин-индуцированном эрозивно-язвенном процессе.
-
Изучить влияние даларгина на процессы пролиферации и апоптоза в слизистой оболочке желудка больных остеоартрозом при НПВП-гастропатиях.
-
Изучить характер влияния на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка компонентов системы ренин-ангиотензина в физиологических условиях.
-
Изучить характер влияния на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка компонентов системы ренин-ангиотензина в условиях патологии.
Научная новизна
1. Впервые проанализирована зависимость между структурой ряда химических аналогов лей-энкефалина и их влиянием на процессы пролиферации в слизистой оболочке желудка.
2. Впервые показано, что высокая биологическая активность аналога лей-энкефалина – даларгина по отношению к слизистой оболочке желудка определяется сочетанием ряда факторов: повышенной устойчивостью к действию эндопептидаз (наличие D-Ala2), сродством к опиатным рецепторам (наличие Tyr), активацией системы NOS-NO (отличительный фактор – присутствие Arg).
3. Впервые на основании собственных данных, а также работ, выполненных в лаборатории, установлено, что наличие в структуре опиоидного пептида молекулы аргинина существенно увеличивает цитопротективные свойства.
4. Впервые показано, что нормализация процессов пролиферации и регенерации слизистой оболочки желудка под воздействием даларгина обусловлена сочетанием активации синтеза ДНК, ослаблением процессов апоптоза и оптимизацией свободнорадикального статуса в слизистой оболочке желудка.
5. Впервые показано, что ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл осуществляет свое протективное действие по отношению к слизистой оболочке желудка за счет способности нивелировать проявления оксидативного стресса, активировать систему NOS-NO и нормализовывать синтез ДНК в слизистой оболочке желудка.
Теоретическая и практическая значимость. Экспериментальные сведения о способности даларгина оказывать протективное действие при приеме НПВП получили дальнейшее развитие в клинической практике как метод профилактики и лечения нарушений целостности слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях.
Экспериментальные данные о способности эналаприла оказывать нормализующее действие на синтез ДНК позволяют рекомендовать ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента как оптимальное средство в комплексном лечении больных с артериальной гипертонией и сопутствующим хроническим гастритом.
Установленные закономерности влияния регуляторных пептидов на состояние тканевого гомеостаза СОЖ в физиологических условиях и при патологии могут использоваться при планировании направленного синтеза пептидов, обладающих цитопротективными свойствами.
Полученные экспериментальные данные могут быть использованы при подготовке лекционного материала по специальностям: патологическая анатомия, патологическая физиология, фармакология в ВУЗах медицинского и биологического направлений.
Внедрение полученных результатов. Полученные данные о характере влияния аналогов лей-энкефалина и компонентов системы ангиотензина II на состояние тканевого гомеостаза внедрены в курс лекций на кафедре патологической физиологии и клинической фармакологии КБОУ ДПО «Институт повышения квалификации сотрудников здравоохранения» (г. Хабаровск). Применение нестероидных противовоспалительных препаратов при лечении больных остеоартрозом в ГБУЗ «Консультативно-диагностический центр» «Вивея», ГБУЗ «Краевая Клиническая больница № 2» (г. Хабаровск) осуществляется с учетом данных нами рекомендаций по использованию даларгина для коррекции НПВП-гастропатий. Комплексное лечение больных артериальной гипертонией, сочетающейся с хроническим гастритом, в ГБУЗ «Краевая Клиническая больница № 2» проводится с использованием ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом и достаточным объемом выполненных наблюдений с использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных.
Основные положения диссертации представлены на VI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России (г. Саратов, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (г. Новосибирск, 2009), итоговой научно-практической конференции ДВГМУ (г. Хабаровск, 2010); XI международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (г. Санкт-Петербург, 2011); научно-практической конференции ДВГМУ (г. Хабаровск, 2012); XII международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (г. Санкт-Петербург, 2012), научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии в Хабаровском крае» (г. Хабаровск, 2012), IV Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (г. Санкт-Петербург, 2012).
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ (из них 19 – в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ; 2 публикации в международных журналах; 4 – в сборниках российских конференций с международным участием; 2 – в сборниках научных трудов).
Личный вклад автора. Планирование экспериментов, анализ материалов, использованных в диссертационной работе, написание статей, написание диссертационной работы выполнены автором лично. Все эксперименты, включая уход за животными, введение исследуемых веществ, морфометрическая оценка повреждения СОЖ, изготовление препаратов для авторадиографического исследования, подготовка проб для оценки процессов свободнорадикального окисления, обработка полученных результатов выполнены автором лично или при консультативном участии д.м.н. Флейшман М.Ю. (иммуногистохимические исследования: определение экспрессии антигена Ki-67, реакции апоптоза для TUNEL меченых клеток), к.м.н. Евсеева А.Н. (описание гистоморфологической картины поражения СОЖ); д.м.н. Лебедько О.А. (метод хемилюминесценции). Клиническая часть работы (наблюдение, углубленное обследование пациентов, включая фиброэзофагогастродуоденоскопию с прицельной биопсией СОЖ) осуществлялась врачами ГБУЗ «Консультативно-диагностический центр» «Вивея» (к.м.н. Болоняевой Н.А.) и НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Хабаровск - 1 ОАО «РЖД» (к.м.н. Авиловой А.А.). Автором (при консультативном участии д.м.н. Флейшман М.Ю.) проводилось иммуногистохимическое исследование биоптатов СОЖ наблюдаемых пациентов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 276 страницах машинописного текста и состоит из оглавления, списка сокращений, введения, 6 основных глав, выводов и списка литературы, включающего ссылки на публикации 185 отечественных и 489 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 39 рисунками.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Высокая морфогенетическая активность даларгина обусловлена способностью стимулировать синтез ДНК, оптимизировать состояние свободнорадикального окисления, активировать систему NOS-NO и ослаблять процессы апоптоза.
-
Благодаря высокой морфогенетической активности даларгин уменьшает эрозивно-язвенные поражения в желудке, индуцированные нестероидными противовоспалительными препаратами и этанолом.
-
Восстановление тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка ингибиторами АПФ обусловлено их способностью нормализовать синтез ДНК, оптимизировать процессы СРО и активировать систему NOS-NO.
Методика проведения экспериментов
Опиоидные механизмы обеспечивают контроль пищедобывательного поведения и потребления жидкости [421, 425].
Эндогенные опиоиды являются составной частью интегративной нейроиммуноэндокринной системы, что определяет их участие в иммуно-воспалительных реакциях [364].
Модулирующее влияние опиоидов на систему дыхания обеспечивается вовлечением как центральных (nucleus Tractus solitarius), так и периферических механизмов [197, 292]. В реализации опиоид индуцированной респираторной депрессии [630] участвуют различные типы рецепторов [381], стимуляция которых может определять снижение частоты дыхания (в связи с увеличением времени вдоха) и возникновение кашлевого рефлекса [472]. Наряду с этим, данные литературы свидетельствуют о стимулирующем влиянии на респираторные процессы агонистов - и 1-опиоидных рецепторов [558]. Энкефалины, динорфины и эндорфины обнаружены в клетках сердца [244]. Идентификация в органах сердечно-сосудистой системы опиоидных рецепторов и наличие на вегетативных и соматических нейронах специализированных сайтов для «связывания» опиоидов позволяет говорить об опиоидной регуляции сосудистого тонуса, частоты и силы сердечных сокращений [244, 393]. Центральная опиоидэргическая активация сопровождается снижением тонического влияния симпатической нервной системы [506]. Внутривенное введение производных эндоморфина вызывает гипотонию и брадикардию у наркотизированных крыс [291].
Регуляция моторной и секреторной активности желудочно-кишечного тракта обеспечивается функционированием энтеральной нервной системы, образованной совокупностью нейронов межмышечного и подслизистого сплетений, структуры которых экспрессируют опиоидные пептиды [350]. Наличие локальной опиоидной системы объясняет функциональную лабильность дигестивного тракта под влиянием экзогенных опиоидных аналгетиков. Мет-энкефалин, лей-энкефалин, -эндорфин, динорфин экспрессируются как кишечными нейронами, так и эндокринными клетками слизистой оболочки [384, 633]. Причем данная экспрессия имеет место на протяжении всей пищеварительной трубки, вплоть до ее дистальных отделов [350, 385, 633].
Опиоидные -, - и -подтипы рецепторов локализованы во всех отделах пищеварительного тракта млекопитающих, но их относительное распределение изменяется в зависимости от слоя и отдела [384, 633]. В межмышечном и подслизистом сплетениях тонкого и толстого кишечника широко представлены -опоидные рецепторы [446], однако наибольшую плотность в кишечнике человека (межмышечное, подслизистое сплетения, иммунные клетки собственной пластинки слизистой) имеют -рецепторы [633]. Изменение активности различных субпопуляций рецепторов определяет эффекты опиоидных пептидов в отношении функциональных ответов желудочно-кишечного тракта. Так, введение 1-(Lys7-dermorphin), 2-(Trp4-Asn7-dermorphin) и 2-(D-Ala2-deltorphin II) – агонистов опиоидных рецепторов показало, что угнетение желудочной секреции и опорожнение желудка обеспечены 2-типом [398]. Активация -опиоидных рецепторов медиальной порции ядра солитарного тракта снижает моторную активность желудка и уменьшает внутрижелудочное давление [465]. Прекращение пропульсивной моторики, изменение баланса жидкости и электролитов в ЖКТ как эффект агонистов опиоидных рецепторов на перистальтику тонкого кишечника, является результатом прерывания нейрононейрональной и нейроноэффекторной трансмиссии в структурах энтерального сплетения [384, 571].
Следует подчеркнуть, что эффекты опиодных пептидов определяются не только вовлечением различных субпопуляций рецепторов. Необходимо учитывать видовые реакции желудочно-кишечного тракта и способ введения пептидов. Так, селективные агонисты -опиоидных рецепторов при внутрицеребральном, интратекальном, подкожном и внутривенном введении у крыс или мышей уменьшают желудочно-кишечного моторику и транзиторные функции, ингибируют желудочную секрецию и подавляют экспериментально-вызванную диарею. Селективные агонисты -рецепторов, напротив, ослабляют транзиторную функцию ЖКТ только при интратекальном введении. При внутрицеребральном и подкожном введениях -агонисты также не изменяют секреторную функцию желудка, однако демонстрируют антидиаррейные эффекты. При интрацеребральном введении -агонисты не влияют на транзиторные функции гастроинтестинального тракта у крыс и мышей, не изменяют секреторную активность у крыс, но проявляют антидиаррейные эффекты у мышей. Однако агонист -опиоидных рецепторов при периферическом введении способен индуцировать повышение желудочной секреции [539]. При исследовании изолированной ткани из тонкого кишечника человека показано, что -, - и -рецепторы участвуют в опиоиод-индуцированной блокаде мышечной активности [384]. Локализация опиоидных рецепторов и их эндогенных пептидных лигандов в пищеварительной трубке и их роль в координации моторики и секреции подтверждает важное значение опиоидных рецепторов в поддержании гомеостаза желудочно-кишечного тракта [629]. Несмотря на эти многочисленные данные, участие опиоидных пептидов в становлении тканевого гомеостаза изучено недостаточно.
Участие синтетического лиганда опиоидных рецепторов даларгина в регуляции физиологических процессов
Способность даларгина принимать участие в коррекции различных патологических состояний, по-видимому, складывается из нескольких механизмов. Даларгин, как и другие опиоидные пептиды, стимулирует процессы пролиферации в различных клеточных популяциях. Пептид является преимущественным агонистом -рецепторов и одновременно проявляет низкую -активность [87]. В то же время аминокислота аргинин, присутствующая в шестом положении, может обеспечить у пептида сродство к -рецепторам [177].
Даларгин оценивается как универсальный регулятор пролиферативных процессов. Анализ литературы показал, что в подавляющем большинстве исследований пептид демонстрирует качества стимулятора синтеза ДНК.
Даларгин активизирует процессы регенерации в костной ткани [60], в эксперименте повышает регенераторную способность тканей, значительно уменьшая среднюю продолжительность полного заживления [131] и ускоряя контракцию ран на всех сроках исследования [40]. Пептид заметно сокращает воспалительную фазу раннего заживления кожных ран за счет стимуляции репаративных процессов (способствует более раннему переходу к пролиферативной фазе). Очевидно, обладая триггерным механизмом действия, он индуцирует каскад воспалительно-репаративных реакций, сокращая сроки всех фаз заживления раны [40]. Даларгин ускоряет пролиферацию с увеличением числа митозов фибробластов, стимулируя рост сосудистых элементов, созревание грануляционной ткани и эпителизацию дефекта [126]. Наличие стимулирующего эффекта при местном и системном воздействии пептида можно рассматривать как доказательство прямого действия лигандов опиоидных рецепторов на клеточное деление [135].
Пептид оказывает различное влияние на процессы синтеза ДНК при стрессорном воздействии. В условиях острого стресса он активирует синтез ДНК, а при повторных воздействиях препятствует активации. Облегчая течение стресса, даларгин препятствует угнетению синтеза ДНК при остром стрессорном воздействии и предотвращает убыль клеточной популяции, обусловливающей компенсаторную стимуляцию в условиях повторного стресса [166].
Подтверждением цитопротективных свойств даларгина при стрессе является его способность нормализовать скорость вертикальной миграции клеток эпителия роговицы [166], а также предотвращать повышение уровня аберенатных митозов [58].
Стимуляция пролиферативных процессов в различных эпителиальных тканях половозрелых крыс в широком диапазоне доз подтверждается работами, выполненными в ЦНИЛ ДВГМУ [137, 148]. Свое стимулирующее влияние на клеточное деление даларгин осуществляет через специфические опиатные рецепторы [135, 177]. В пользу рецепторного характера действия препарата свидетельствует тот факт, что эффект стимуляции клеточного деления достигается в низких дозах [135], а антагонист опиатных рецепторов налоксон устраняет действие пептида [175]. Способность даларгина стимулировать процессы клеточного деления наряду с его антистрессорными свойствами [20, 122] помогает понять его механизм цитопротекторного действия [58].
Однако в работах [36, 54] показано, что однократное введение пептида в дозах 10 и 100 мкг/кг вызывает угнетение синтеза ДНК в миокарде и достоверное снижение концентрации цАМФ в тканях сердца новорожденных белых крыс [36, 54], а увеличение кратности введения не оказывает влияния на активность ДНК-синтетических процессов [109]. Отсутствие стимулирующего эффекта пептида имеет место в гепатоцитах новорожденных животных [54]. В эпителиальных тканях (роговицы, языка, желудка) новорожденных животных даларгин проявил стимулирующие свойства, однако эффекты пептида в отношении ДНК-синтетических процессов были менее выражены, чем в аналогичных тканях половозрелых крыс [54]. Таким образом, можно предположить, что влияние даларгина на процессы синтеза ДНК определяется типом ткани и имеет онтогенетические особенности.
В настоящее время недостаточно изучен ряд механизмов действия даларгина [15]. Так, на момент создания даларгина не были известны высокая биологическая активность аргинина и его способность активировать систему NOS-NO.
В связи с этим целью настоящего исследования было выяснение зависимости между структурными изменениями аналогов лей-энкефалина и их влияния в физиологических условиях на синтез ДНК и свободнорадикальное окисление в слизистой оболочке желудка.
Участие местных факторов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях
Морфологические изменения слизистой оболочки желудка у больных, принимающих диклофенак с даларгином, свидетельствуют о снижении выраженности воспалительной реакции, по сравнению с группой больных, получавших только диклофенак. Это проявлялось уменьшением инфильтрации мононуклеарами (лимфоциты, макрофаги, плазматические клетки) собственной пластинки слизистой оболочки. В просвете желудочных ямок и желез, между эпителиальными клетками, в строме определялость незначительное количество нейтрофильных лейкоцитов. Отмечены дистрофические изменения в обкладочных и главных клетках.
При коррекции даларгином в антральном отделе СОЖ обнаруживался очаговый склероз стромы. В гастробиоптатах больных, получавших диклофенак на фоне даларгина, были выявлены признаки, характеризующие процесс репаративной регенерации (рис. 30).
Гастробиоптаты антрального отдела желудка больных, получавших диклофенак на фоне лечения даларгином (репаративные изменения): а) сближение желез с формированием участков расположения по типу «спина к спине», окруженные круглоклеточными инфильтратами, б) углубление ямок, в) рассеянная инфильтрация стромы воспалительно-клеточным инфильтратом. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 21х10
Выявлялись воспалительные инфильтраты с примесью полиморфноклеточных эозинофилов; сближением желез с формированием участков расположения по типу «спина к спине», окруженных круглоклеточными инфильтратами. Наблюдалось углубление ямок с умеренно выраженной мукоидизацией, рассеянная инфильтрация стромы воспалительно-клеточным инфильтратом, значительное количество межэпителиальных лейкоцитов (рис. 31). Кроме того, в ряде гастробиоптатов репаративные изменения характеризовались наличием умеренного периваскулярного и перигландулярного склероза с сужением просвета сосудов (рис. 30, рис. 31, рис. 32). Только в единичных гастробиоптах выявлены признаки гемореологических нарушений в микроциркуляторном русле в виде полнокровия сосудов, стазов.
Гастробиоптаты антрального отдела желудка больных, получавших диклофенак на фоне лечения даларгином (репаративные изменения). Прослойки соединительной ткани между железами в собственной пластинке слизистой. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 21х10
Гастробиоптаты антрального отдела желудка больных, получавших диклофенак на фоне лечения даларгином (репаративные изменения): а) поля зрелой соединительной ткани, б) расширение просветов сосудов с их запустеванием, в) перигландулярный склероз. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 21х10
Таким образом, в гастробиоптатах у больных, принимающих только диклофенак, воспалительная инфильтрация распространялась на всю толщу собственной пластики СОЖ, отмечалось умеренное и выраженное фиброзирование собственной пластинки, имели место признаки острых эрозий, а также участки атрофии желез.
У больных, получавших диклофенак на фоне приема даларгина, морфологические изменения носили менее выраженный характер: слабая инфильтрация мононуклеарами СОЖ при наличии слабой активности воспалительного процесса, очаговый фиброз стромы. Лимфоидные фолликулы, очаги кишечной метаплазии не регистрировались.
Описание патоморфологической картины слизистой оболочки желудка больных осуществлялось при консультативном участии заведующего кафедрой патологической анатомии к.м.н., доцента А.Н. Евсеева
Помимо ослабления воспалительных реакций, сочетанная терапия «Диклофенак+даларгин» по сравнению с монотерапией «Диклофенак» сопровождалась достоверным уменьшением степени поражения СОЖ, по данным эндоскопического исследования. В то время как у больных, получавших монотерапию диклофенаком, эндоскопический показатель поражения СОЖ по A. Euler [188] составил 6,67±0,67, в группе сочетанного приема диклофенака и даларгина этот показатель был достоверно меньше – 2,91±0,51 (р 0,05) [142].
По данным, полученным в лаборатории ранее, в неизмененной слизистой оболочке желудка индекс метки Ki-67 составил 15,75±2,64%. После 28-дневного курса лечения диклофенаком статистически значимых изменений показателей регенераторного потенциала не наблюдалось. Индекс метки Ki-67 в группе пациентов, страдающих остеоартрозом, до приема диклофенака составил 29,97±2,95%, после курса лечения – 26,88±3,06%. Пролиферативная активность эпителия слизистой оболочки желудка у пациентов, принимавших диклофенак и даларгин, достоверно увеличивалась: индекс метки Ki-67 до приема препарата составил 27,52+1,38%, после курса лечения диклофенаком и даларгином – 32,99+1,43% (табл. 10).
Влияние даларгина на процессы апоптоза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом
Детекция апоптоза у больных группы сочетанной терапии «Диклофенак+даларгин» по сравнению с монотерапией «Диклофенаком» свидетельствовала, что применение даларгина снижает уровень процесса программированной клеточной гибели. В то время как у больных, получавших диклофенак 28 дней, выраженность апоптоза составила 2,82±0,51 баллов, при коррекции НПВП-гастропатии даларгином этот показатель уменьшился до 1,5±0,15 баллов (р 0,05) (табл. 11).
Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка половозрелых белых крыс
Третий сигнальный путь реализации митогенного эффекта лигандов опиоидных рецепторов связан с вовлечением системы NOS-NO и опосредован G-PI3K-Akt-NOS-NO сигнальным каскадом (путем), где Akt стимулирует активность эндотелиальной NOS [538]. Стимуляция образования NO под влиянием опиатов не ограничивается эндотелием. Она имеет место в легочной ткани [426]. NOS зависимая индукция образования NO при введении морфина в лейкоцитах продемонстрирована в работе K.J. Mantione et al. [2008] [329]. Напомним, что в наших исследованиях с даларгином, а также в работах, выполненных совместно с М.Ю. Флейшман по анализу гастропротективного действия дерморфина, установлено, что эффективны оказываются только аргинин-содержащие опиоиды, такие как седатин (H-Argyr-D-Ala-Phe-Gly-OH). У безаргининовых аналогов эффект выпадает или минимизируется [141]. Одним из возможных объяснений данному факту может быть взаимодействие аргининсодержащих опиоидных пептидов с 3 рецепторами [669]. При этом утрата аргинина ведет к потере возможности взаимодействовать с 3 рецепторами. Другим возможным механизмом образования NO является его синтез из молекулы аргинина, отделяющейся от даларгина в ходе метаболизма последнего [82].
NO-синтаза объединяет в себе 3 изофермента: нейрональную (nNOS), эндотелиальную (eNOS) и макрофагальную (iNOS) формы. Оксид азота является одним из самых мощных вазодилитаторов, и именно он опосредует гастропротективный эффект опиоидов [141]. Согласно общепринятой точке зрения одним из основных механизмов его (NO) защитного действия является улучшение кровообращения.
При этом следует отметить, что стимуляция пролиферативных процессов под влиянием даларгина происходит и без улучшения местного кровообращения. В пользу этого свидетельствуют эксперименты, 0 выполненные в нашей лаборатории на культуре фибробластов, где внесение даларгина в культуру фибробластов стимулировало синтез ДНК [154]. Аппликация даларгина на бессосудистую роговицу также стимулировало пролиферативные процессы [135].
Особо следует подчеркнуть важное значение стабильности свободнорадикального статуса для реализации физиологических эффектов NO. При понижении уровня антиоксидантной защиты NO метаболизирует в пероксинитрит – ONOO– – чрезвычайно токсический фактор, являющийся индуктором апоптоза. Увеличение концентрации супероксида О2– в 10 раз приводит к росту содержания пероксинитрита в 100 раз [504]. При введении даларгина имеет место и повышение емкости антиоксидантного буфера и снижение образования супероксида [100]. Это может служить объяснением механизмов оптимизации микроциркуляции под влиянием даларгина [159], которое в сочетании с перистальтическим волнообразным действием NO на гладкомышечные клетки сосудов оптимизирует локальную микроциркуляцию [169]. На первый взгляд, вазодилатационный эффект аргинина можно воспроизвести введением самой аминокислоты. Однако для получения вазодилитационного эффекта аргинина при введении его per os необходимо несколько граммов вещества [169].
Присутствие аргинина в молекуле опиоидных пептидов позволяет ему целенаправленно (за счет усиленной экспрессии опиоидных рецепторов в очаге повреждения) транспортироватьcя в зону повреждения и именно здесь оптимизировать микроциркуляцию.
При индометацин-индуцированном повреждении желудка белых мышей Swiss степень повреждения коррелирует с редукцией аргиназной активности и экспрессии eNOS при одновременном повышении экспрессии iNOS, тотальной активности NOS, генерации NO и соотношения про/антивоспалительных цитокинов. Присутствие аргинина обеспечивает смещение соотношений iNOS/NO и аргиназа/полиамин, повышает аргиназную активность и экспрессию eNOS на фоне редукции экспрессии iNOS, тотальной активности NOS и уровня NO [488].
Структурно-функциональная организация клеток, органов и организма в целом, согласно представлениям А.М. Уголева [80], подразумевает возможность разделения любого физиологического процесса (в том числе и специализированного) на цепь последовательных событий, которые, в свою очередь, можно рассматривать как совокупность простых операций и элементарных функций. Реализация этих элементарных функций осуществляется при непосредственном участии ограниченного числа функциональных блоков. Структурная детализация функциональных блоков предусматривает наличие в их составе молекул или надмолекулярных комплексов, несколько самостоятельных взаимосвязанных молекул либо части (участка) молекулы. Сочетание функциональных блоков и их универсальность обеспечивает высокую специализацию и эффективность выполняемых организмом и/или его составляющими функций, которые могут иметь как общий, так и специфический характер [80].
![Структурно-функциональная организация слизистой оболочки желудка у больных бронхиальной астмой различного генеза [Электронный ресурс]](/i/i/4395/203167.png "Структурно-функциональная организация слизистой оболочки желудка у больных бронхиальной астмой различного генеза [Электронный ресурс] Носенко Ксения Александровна")
