Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 3
2. Обзор литературы 10
2.1. Соматическая полиплоидия как способ тканевого роста 10
2.2. Нервная система гастропод 14
2.2.1. Происхождение нервной системы моллюсков 14
2.2.2. Особенности строения и развития нервной системы гастропод 17
2.2.3. Соматическая полиплоидия в нервной системе гастропод 23
3. Материал и методы 33
4. Результаты 40
4.1. Морфологическая характеристика ганглиев и нейронов ЦНС улитки янтарки 40
4.2. Динамика синтеза ДНК в процессе постнатального роста нейронов улитки янтарки 49
4.3. Митоз и эндомитоз в постнатальном развитии нейронов ЦНС улитки янтарки 60
4.4. Скрининг ЦНС пульмонат на проявление соматической полиплоидии 77
5. Обсуждение 96
5.1 Морфология ганглиев и нейронов 96
5.2. Специфика ганглиев по проявлению полиплоидии 98
5.3. Возможность размножения клеток в ЦНС 102
5.4. Возрастная динамика нейрогенеза 104
5.5. Механизмы полиплоидизации нейронов 107
5.6. Проявление полиплоидии в ЦНС представителей подкласса Pulmonata 109
Выводы 113
- Нервная система гастропод
- Динамика синтеза ДНК в процессе постнатального роста нейронов улитки янтарки
- Скрининг ЦНС пульмонат на проявление соматической полиплоидии
- Специфика ганглиев по проявлению полиплоидии
Введение к работе
Актуальность проблемы
Под соматической полиплоидией в широком смысле понимают кратное умножение числа геномов в соматических клетках, развивающихся из диплоидной зиготы. Полиплоидные клетки обнаружены в тканях организмов всех типов многоклеточных животных, у многих простейших, а также у растений (Бродский, Урываева, 1974, 1981). Подобная широта распространения полиплоидии позволяет судить о ней как об общебиологическом явлении. В тканях, претерпевающих большую функциональную нагрузку, наряду с необязательными, факультативными проявлениями полиплоидии обнаружена и облигатная полиплоидия, когда переход на полиплоидные циклы становится важным или даже единственным механизмом постнатального роста органов.
К концу XX века вопрос о причинности соматической полиплоидии вышел за рамки проблемы клеточной пролиферации и дифференцировки (Бродский, Урываева, 1981). Полиплоидия соматических клеток рассматривается также как особая стратегия тканевого роста, суть которой состоит в олигомеризации диплоидных клеточных клонов со всеми вытекающими свойствами олигомерных систем (Анисимов, 19996, 1999в). Этот подход позволил в значительной степени приблизится к пониманию биологического смысла, функциональной значимости и закономерности возникновения полиплоидных гистогенезов.
Важную роль в понимании сущности явления полиплоидии сыграли сравнительные исследования гистогенезов у моллюсков класса Gastropoda (Анисимов, 1999в, 1999г; Зюмченко, Анисимов, 2001, 2002). У брюхоногих моллюсков полиплоидные клетки встречаются в самых различных тканях -от эпителиальных до нервных. Поражает и разнообразие уровней плоидности клеток - от умеренных (4с-64с) в слюнных железах (Swift, 1953; Schreiber, Schreiber, 1964; Зюмченко, Анисимов, 2001, 2002) до гигантских (130000с-260000с) в нейронах (обзоры: Бродский, Урываева, 1981; Gillette, 1991; Bulloch, Ridgway, 1995; Анисимов, 1999а).
Другим значимым результатом исследований полиплоидных гистогенезов гастропод стала "реанимация" классического эндомитоза как реального механизма эндорепродукции клеток. До сих пор под эндомитозом или эндомитотической полиплоидией часто понимали разные по своей цитологической сущности процессы и явления. Со временем термин "эндомитотическая полиплоидия" вообще потерял свой истинный смысл, определенный еще Гейтлером (Geitler, 1953); сомнительным стало не только широкое распространение эндомитоза, но и возможность существования данного механизма вообще. Возвращение в цитологию понятия эндомитоза связано с исследованиями полиплоидии в тканях улитки янтарки (Анисимов 1999в, 1999г).
Следует, однако, отметить, что исследования распространения полиплоидии у гастропод, как и работы по механизмам полиплоидизации у янтарки, проводились в основном на эпителиальных железистых тканях (белковая, предстательная, слюнные железы). Большинство исследований нервной системы брюхоногих моллюсков только констатируют факт присутствия полиплоидных клеток (Cook, 1966; Bullock, Horridge, 1965; Gillette, 1991; Bulloch, Ridgway, 1995), а в ряде случаев о полиплоидии приходится судить лишь по косвенным морфологическим данным.
Таким образом, на сегодняшний день в изучении полиплоидных нервных клеток гастропод существует много вопросов. Не ясна специфика отдельных ганглиев центральной нервной системы по проявлению полиплоидии нейронов. Малочисленны и противоречивы данные о возрастной динамике полиплоидизации. Достоверные цитологические данные об уровнях плоидности нейронов брюхоногих моллюсков (по содержанию ДНК или числу хромосом) имеются лишь для нескольких видов легочных (родов Helix, Lymnaea, Planorbis и др.) и заднежаберных моллюсков (родов Aplysia, Tritonia); у переднежаберных моллюсков полиплоидные нейроны не обнаружены (Gillette, 1991; Анисимов, 1999а). Практически не изучены механизмы умножения геномов в нейронах. Высказано предположение о скрытой политенности хромосом этих клеток (Бродский, Урываева, 1981; D Amato, 1989), но оно не имеет пока реальных оснований. Решение вопроса о механизмах эндорепродукции нейронов требует чёткого видения возрастной динамики роста и дифференцировки полиплоидизирующихся клеток, поскольку в ряде случаев возможна морфологическая имитация эндомитозов интерфазными
хромоцентрическими ядрами вне эндоцикла, в том числе ядрами с высокой транскрипционной активностью (см.: Анисимов, 1999а). Нет также общего понимания функциональных аспектов полиплоидии нейронов, причин и биологического смысла этого явления у гастропод.
Настоящая работа направлена на решение этих вопросов. В качестве модельного объекта в изучении онтогенетических проявлений полиплоидии нейронов используется улитка янтарка Succinea lauta. Данная улитка является удобным объектом исследования, так как имеет короткий (полуторагодичный) жизненный цикл (Анисимов, 1986) и представляет массовый вид на территории южного Приморья. Филогенетические аспекты распространения полиплоидии в центральной нервной системе показаны на сравнительном материале у представителей подкласса Pulmonata класса Gastropoda.
Цели и задачи работы
Основная цель работы состояла в выявлении онтогенетических и филогенетических закономерностей возникновения соматической полиплоидии в центральной нервной системе легочных брюхоногих моллюсков (Gastropoda, Pulmonata), а также в установлении возможной роли полиплоидии в нейрогенезах гастропод.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи: 1) изучить строение центральной нервной системы янтарки Succinea lauta; 2) определить морфологические характеристики и степень плоидности нервных клеток разных ганглиев; 3) выявить онтогенетические изменения классов плоидности ядер у разных возрастных групп янтарок; 4) изучить возрастную динамику синтеза ДІЖ в ядрах нейронов янтарки и оценить изменения ростовых потенций нейронов при изменении условий обитания; 5) установить механизмы умножения генома в нервных клетках янтарки; 6) определить уровни плоидности в нейронах ЦНС у представителей разных видов легочных брюхоногих моллюсков; 7) с учетом собственных и литературных данных выявить филогенетический аспект распространения полиплоидии в ЦНС представителей разных классов гастропод (переднежаберные, заднежаберные, легочные) и объяснить роль соматической полиплоидии в эволюционных перестройках класса Gastropoda.
Научная новизна
Впервые методом цитофотометрии ДНК определены уровни плоидности и установлена специфичность распределения полиплоидных нейронов в центральной нервной системе у 13 видов из 6 семейств 2 отрядов подкласса легочных брюхоногих моллюсков. Установлено, что полиплоидизация от 4с до максимальных видоспецифичных уровней плоидности, достигающих тысяч гаплоидных единиц, является нормальным способом роста нервных клеток легочных гастропод; экстремальные значения ДНК закономерно регистрируются в висцеральном комплексе ганглиев.
У улитки янтарки {Succinea lauta) изучена возрастная динамика содержания ДНК и включения Н-тимидина в нейронах ЦНС. Показана закономерная полиплоидизация нейронов в течение постнатального онтогенеза при общем снижении темпов их роста у половозрелых и стареющих особей. Установлены также механизмы полиплоидизации нейронов. При изучении на давленых препаратах структуры хроматина и
хромосом в норме и в условиях летней спячки, с использованием методов тимидиновой авторадиографии и цитофотометрии ДНК, выявлен эндомитоз как реальный механизм полиплоидизации нейронов, в том числе самых крупных (гигантских); исключена возможность скрытой политенизации хромосом в ЦНС янтарки. Показано, что переход от митоза к эндомитозу осуществляется после одного-двух циклов полиплоидизирующего (реституционного) митоза.
Выявлены филогенетические закономерности возникновения и степени проявления соматической полиплоидии в нейронах гастропод, дана оценка стратегии полиплоидизации нейронов на фоне общих эволюционных перестроек гастропод: переход к общей асимметрии сомы, концентрации и централизации ЦНС.
Теоретическое и практическое значение работы
Выяснены цитологические механизмы роста, онтогенетическая динамика и филогенетические закономерности возникновения гигантских нейронов ЦНС легочных брюхоногих моллюсков. Решение этих задач вносит существенный вклад в понимание проблемы соматической полиплоидии, в объяснение механизмов, причин и биологического смысла этого цитологического феномена.
Фактические результаты работы, а также сформулированные филогенетические закономерности могут быть включены в университетские курсы и учебные пособия по цитологии, гистологии, биологии развития, зоологии и др. Закономерность проявления соматической полиплоидии в ЦНС эвтиневральных форм, т.е. у видов линии Opisthobranchia-Pulmonata, может служить дополнительным критерием в решении спорных вопросов филогении и систематики гастропод. Отработанная методика введения и регистрации включения радиоактивного предшественника синтеза ДНК 3Н-тимидина обеспечивает адекватную оценку ростовых потенций нейронов в ЦНС моллюсков, что может быль использовано в дальнейших научных исследованиях, при изготовлении учебных препаратов, и при патогистологическом анализе. Результаты работы уже используются в лекциях по цитологии и гистологии, а также на лабораторных занятиях по курсам цитофотометрии и авторадиографии (разделы большого практикума) для студентов-цитологов ДВГУ.
Апробация работы
Основные результаты были представлены на IV(XIII) Малакологическом совещании (С.-Петербург, 1998), на Всероссийском совещании по изучению моллюсков Дальнего Востока России (Владивосток, 1998), на Международном симпозиуме по изучению Восточно-Азиатских
маргинальных морей (Фукуока, Япония, 1999), на II Региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии студентов, аспирантов и молодых ученых (Владивосток, 1999), на VI Восточно-Европейской международной конференции по нейробиологии беспозвоночных (Москва-Пущино, 2000), на Всероссийском симпозиуме "Клеточная биология на пороге 21 века" (Санкт-Петербург, 2000), на Конференции научно-образовательного центра (НОЦ) ДВГУ (Владивосток, 2002).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Нейроны ЦНС улитки янтарки Succinea lauta являются полиплоидными. Совместно с диплоидной глией, они формируют гетероплоидную совокупность клеток, в которой представлены все классы плоидности от 2с до 163 84с ДНК.
2. Полиплоидизация и рост нейронов не прекращаются на протяжении всего постнатального развития янтарки, хотя темпы полиплоидизации постепенно снижаются у половозрелых и стареющих животных. Механизмом полиплоидизации выступает эндомитоз. Переход от обычного митоза к эндомитозу идет через полиплоидизирующий (реституционный) митоз. 3. Полиплоидизация является нормальным способом роста нервных клеток всех исследованных легочных гастропод, причем у всех видов максимальные видоспецифичные уровни плоидности нейронов характерны для висцерального комплекса ганглиев.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ, из которых 3 журнальные статьи и 8 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, который включает 155 наименований (из них - 98 иностранных авторов). Диссертация проиллюстрирована 31 рисунком и 5 таблицами.
Благодарности
Выражаю глубокую признательность своему научному руководителю - профессору А.П. Анисимову за неоценимую помощь при выполнении работы. Благодарю также всех сотрудников кафедры клеточной биологии ДВГУ за моральную поддержку и помощь, студентов-дипломников, принимавших участие в выполнении данной темы - Н. Кобзарь, Н. Штин и других. Отдельная благодарность А.В. Чернышеву и Л.А. Прозоровой за помощь в сборе материала и определении ряда видов. Некоторые материалы были привезены из различных поездок и экспедиций Б.В. Бодровым и Д.А. Анисимовым, за что выражаю им глубокую благодарность.
Работа выполнена при финансовой поддержке фонда US CRDF (грант № REC-003), Министерства образования РФ (проект № 97-0-10. 0-43) и ФЦП "Интеграция" (проект № 837).
Нервная система гастропод
В науке XX века вопрос о формировании нервного аппарата моллюсков решался в непосредственной связи с проблемой происхождения данной группы животных. На сегодняшний день существует две основные гипотезы возникновения моллюсков. Гипотеза турбеллярного происхождения выводит моллюсков и их нервный аппарат от низших червей - турбеллярий. Общий план ЦНС гастропод подобен таковому у турбеллярий и представляет собой решетку меридиональных стволов и кольцевых комиссур, располагающихся радиально-симметрично вокруг первичной оси тела. Рейзингер в 1925 году дал такому строению нервного аппарата название "ортогон" (Беклемишев, 1964; Reisinger, 1972; Haszpruner, 1996). Так как значительная часть нервного аппарата у большинства таксонов гастропод находится в вентральной части тела, Ульрих (Ulrich, 1951) охарактеризовал такой план строения нервной системы как "гастроневральный". На своих оральных концах вокруг первичной оси тела ортогон впадает в циркумбластопоральное сплетение. У моллюсков оно формируется за счет производных эктодермы. В частности из теменной пластинки (поверхностного ресничного органа трохофоры), четырех радиальных зачатков мозга и нескольких зачатков, связанных с различными органами чувств, развиваются церебральные ганглии (Беклемишев, 1964; Миничев, 1975; Догель, 1981). В дальнейшем нервный аппарат моллюсков развивается в результате дифференциации циркумбластопорального сплетения предков (Миничев, 1975). Дополнительными постулатами гипотезы турбеллярного происхождения являются также амерность (несегментированность) тела моллюсков и отсутствие у них вторичной полости тела (Salvini-Plawen, 1972). К концу XX века гипотеза турбеллярного происхождения моллюсков стала особенно популярна благодаря многочисленным трудам Сальвини-Плавена. Он смог при помощи компьютерного обеспечения систематизировать апомофные (характеризующие происхождение) и плезиоморфные (наследуемые) черты в общей классификации моллюсков, базируясь на анатомических, гистологических, ультраструктурных и экологических характеристиках различных тканей и органных систем (Salvini-Plawen, Steiner, 1996). Другая гипотеза - гипотеза аннелидного происхождения моллюсков -опирается на сходство брюшной нервной цепочки аннелид и продольных стволов центральной нервной системы моллюсков. Аннелиды не обладают ортогональной нервной системой.
Их нервная система - "ортогоноид" (Миничев, 1975) - образуется в результате объединения брюшных нервных стволов и сегментарных нервов с вторичными продольными периферическими нервами. Данная гипотеза апеллирует к тому факту, что моллюски являются амерными лишь в том смысле, что они обладают несегментированным целомом. Однако, определенная метамерия у наиболее примитивных моллюсков (хитонов, соленогастров) в общих чертах сходна с метамерией олигомерных аннелид: она затрагивает в основном эктодермальные производные, в том числе и нервную систему. Общим является и то, что в обоих случаях имеет место метамерия упорядочения, далеко не очень полная и совершенная, охватывающая немногие отдельные аппараты и системы органов (Беклемишев, 1964). Существует также принципиальное сходство в личиночном развитии у аннелид и моллюсков (трохофорная личинка, метаморфоз и т.п.). Кроме того, из всего личиночного нервного аппарата и у взрослых аннелид, и у 16 моллюсков остаются лишь церебральные ганглии, окологлоточные коннективы и продольные нервные стволы туловища (Беклемишев, 1964). Педальные стволы моллюсков соответствуют брюшным (коннективным) стволам аннелид, в обоих случаях они формируются из самостоятельных эктодермальных зачатков, позднее соединясь с церебральными центрами (Миничев, 1975). Однако, по мнению Хажпрунера (Haszprunar, 1996), бесспорное турбеллярное родство в организации ЦНС демонстрируют именно церебральные ганглии, развивающиеся из апикальной части эмбрионально- личиночной нервной системы, или из эктодермальных плакод. В t противоположность им, вентрально расположенная ганглионарная масса закладывается из атриального эпителия (первичная ротовая полость) в ходе метаморфоза. Развитие висцерально расположенных ганглиев и вентральных нервных трактов варьирует у представителей разных семейств и может начинаться от различных нервных плексусов, формирование нервных стволов неопределенно. Под большим вопросом оказываются" утверждения соответствия вентрального нервного тракта как турбеллярной, так и аннелидной гипотезам гомологичности ЦНС (Mamkaev, Konitova,/ 1972; Rieger et al., 1991; Haszprunar, 1996). По мнению Миничева (1975), с позиций какой-либо из упомянутых гипотез трудно полностью объяснить происхождение нервной системы моллюсков. Автор считает, что обе выдвинутые гипотезы справедливы и лишь совместно дают полную картину возникновения нервного кольца моллюсков. Такое предположение позволяет представить исходный тип нервного аппарата в виде недифференцированного кольца, которое в дальнейшем расщепляется на 2 пары стволов. Дальнейшее формирование нервного аппарата идет параллельно с развитием основных особенностей типа Mollusca в результате разновременной дифференциации циркумбластопорального кольца предков. Как считает Миничев (1975), этапы дифференцировки происходили в тот период, когда кольцо имело пластичный, морфологически неустановившийся характер. Доказательствами высоких потенций нервного аппарата к перестройкам у трохофорных животных (в том числе и моллюсков) являются неоднократное формирование ортогоноида у аннелид и артропод, а также вторичных нервных центров (ринофоральных, половых) у гастропод. 2.2.2. Особенности строения и развития нервной системы гастропод Традиционно брюхоногих моллюсков (Gastropoda) подразделяют на три подкласса: переднежаберных (Prosobranchia), заднежаберных (Opisthobranchia) и легочных (Pulmonata) (Hyman, 1967; Властов, Матекин, 1988; Barnes, Harrison, 1994; Bulloch, Ridgway, 1995). Переднежаберные и заднежаберные моллюски представлены преимущественно морскими формами, легочные обитают на суше или в пресных водоемах. Гастроподы имеют общие черты в организации нервной системы. Как уже упоминалось, нервные ганглии брюхоногих моллюсков возникают в ходе эмбрионального развития из независимых разрастаний эктодермы, однако, периферические элементы, в частности обнаруженные в пищеварительной системе, могут иметь и энтодермальное происхождение (Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1995).
Даже у наиболее примитивных переднежаберных моллюсков центральный отдел нервной системы значительно удален от поверхностных покровов и имеет ганглионарно-стволовое строение. Общая стратегия эволюции нервной системы в пределах класса - централизация нервной системы; у высших гастропод она проявляется в ганглионизации продольных нервных стволов и концентрации ганглиев вокруг пищевода за счет сокращения длины комиссур и коннектив (Догель, 1981). От центрального отдела отходят периферические нервы; кроме них имеются способные к самостоятельным рефлексам периферические кожные и мышечные сплетения, напоминающие диффузную нервную сеть у кишечнополостных (Беклемишев, 1964). По особенностям строения нервной системы гастроподы делятся на две большие группы. Переднежаберные моллюски относятся к стрептоневральным - Streptoneura, а заднежаберные и легочные к эвтиневральным формам - Euthyneura (Миничев, Старобогатов, 1975; Волова, и др., 1979; Bulloch, Ridgway, 1995). Представители подкласса Prosobranchia и, как считает ряд авторов, примитивные виды других подклассов брюхоногих моллюсков, относящиеся к стрептоневральным формам, характеризуются длинными плевро-висцеральными коннективами, которые перекрещиваются в виде восьмерки (рис. 1, а) (Догель, 1981; Иванов и др. 1985). Анатомически такой перекрест приводит к нарушению билатеральной симметрии нервной системы, а само явление перекреста получило название хиастоневрии. Хиастоневрия была открыта в 1850 году Лаканз-Дютье (Lacanze-Duthiers, 1859) и является следствием процессов развития, известных как торсия, когда висцеральная масса тела личинки поворачивается на 180 за счет сокращения фасционной связки в личиночной ноге (Беклемишев, 1944; Kandel, 1979; Иванова-Казас, 1995). Существует много гипотез происхождения торсии и, соответственно, хиастоневрии. Неф (Naef, 1913) выдвинул предположение о физиологическом смысле торсии, следствием которой является общая тенденция эволюционной асимметрии гастропод, с ее частным проявлением - хиастоневрией. Физиологическая торсия возникает при переходе свободно плавающих в тоще воды (подобно примитивным головоногим моллюскам) предковых форм к ползающему образу жизни и проявляется в мышечном повороте планоспиральной раковины сначала на 90, а потом и на 180 (с тем, чтобы завиток раковины не давил на голову животного).
Динамика синтеза ДНК в процессе постнатального роста нейронов улитки янтарки
По данным цитофотометрии степень полиплоидизации клеточных ядер ЦНС янтарки S. lauta варьирует от 2 до 16384с ДНК. Возрастная динамика полиплоидизации ядер нейронов различных ганглиев отображена в табл. 3 и на гистограммах (рис. 7). Диплоидные ядра принадлежат в основном клеткам нейроглии и соединительной ткани (оболочки ганглиев). Не исключено также наличие диплоидных нейронов или нейробластов, однако наш материал (давленые препараты) не позволял идентифицировать эти клетки среди глиальных и соединительнотканных элементов. Диплоидные ядра использовались нами в качестве 2с-эталона при построении гистограмм, поэтому высота диплоидных пиков (рис. 7, заштрихованные столбики) отражает не реальное количество 2с-клеток, а лишь их необходимое количество для получения статистически достоверных диплоидных пиков в гистограммах. На самом деле их доля значительно выше. Подсчёт среднего уровня плоидности нейронов (табл. 3) проводился также без учёта диплоидных компонентов. Динамика полиплоидизации и предельные значения плоидности нейронов в разных ганглиях несколько различаются, однако во всех случаях формируются растянутые ряды гетероплоидных значений массы ДНК, включающие все классы плоидности - от 2-4с самых мелких нейронов до максимальных величин в тысячи гаплоидных единиц гигантских нейронов. В церебральных ганглиях максимальная масса ДНК нейронов у сеголеток, а также мелких (неполовозрелых) годовиков не превышает 512-1024с (рис. 7, Цер, а, б), у крупных (половозрелых) особей - 2048-4096с (рис. 7, Цер, в). Степень полиплоидизации в первом случае равна 8-9 циклам эндорепродукции диплоидного ядра, во втором - 10-11. Средний уровень плоидности для данного типа ганглиев за весь исследованный возрастной период увеличивается в 4,1 раза (см. табл. 3), и это означает, что в среднем каждый нейрон проделывает два эндоцикла. В педальных ганглиях максимальные классы плоидности у сеголеток составляют 256-512с (рис. 7, Лед, а), что соответствует 7-8 циклам эндорепродукции диплоидных нейронов. Большая часть клеток имеет ядра с массой ДНК 4-8с. Это свидетельствует о более низких (по сравнению с церебральными ганглиями) темпах полиплоидизации нейронов педальных ганглиев на ранних стадиях развития янтарки. С ростом улиток возрастает и степень полиплоидизации педальных нейронов. На втором году жизни максимальные классы плоидности уже сопоставимы с таковыми в церебральных ганглиях — 512-1024с у мелких годовиков и 2048с у крупных половозрелых особей (рис. 7, Лед, б, в). В целом, у взрослых животных по сравнению с сеголетками нейроны педальных ганглиев, как и нейроны церебральных ганглиев, претерпевают дополнительно два цикла эндорепродукции - средний уровень плоидности нейронов возрастает примерно в 4 раза (точнее - в 4,2 раза; см. табл. 3).
В висцеральном комплексе ганглиев максимальные классы плоидности нейронов уже у сеголеток достигают 1024-4096с (рис. 7, ВК, а) и сравнимы с экстремальными значениями полиплоидии в нейронах церебральных и педальных ганглиев взрослых животных. У мелких годовиков гигантские нейроны висцерального комплекса полиплоидизируются до 4096-8192с (рис. 7, ВК, б), а у крупных годовиков -до 8192-16384с (рис. 7, ВК, в), то есть претерпевают 12-13 эндоциклов от начала развития. Средний уровень плоидности нейронов висцерального комплекса у крупных годовиков возрастает по сравнению с сеголетками в 5,7 раз (см. табл. 3), что обеспечивается двумя-тремя дополнительными циклами полиплоидизации. Таким образом, как максимальные, так и средние уровни плоидности нейронов в висцеральном комплексе оказываются в 4-8 раз выше, чем в церебральных и педальных ганглиях. Кроме нейронов с эуплоидными (кратными 2с) значениями массы ДНК в ЦНС янтарки имеются нейроны с промежуточными значениями. Последние преобладают у молодых, активно растущих особей, у которых гистограммы распределения ядер по массе ДНК характеризуются сглаженными пиками или даже смещением пиков на нестандартные, промежуточные позиции (рис. 7, Цер, а; Лед, а; ВК, а). Количество ядер с промежуточными значениями массы ДНК снижается с увеличением возраста животных при одновременном повышении числа высокополиплоидных ядер (рис. 7, Цер, в; Лед, в; ВК, в). Эуплоидные пики максимально выражены у половозрелых особей. Однако и у взрослых улиток часть ядер нейронов имеет промежуточные уровни плоидности, в частности те ядра, которые содержат более 256с ДНК. В целом представленные распределения ядер нейронов по массе ДНК у янтарок разных возрастных групп свидетельствуют о постнатальном росте этих клеток, а наличие ядер с промежуточными значениями ДНК у молодых и средневозрастных животных должно отражать протекающие процессы синтеза ДНК. Интересный факт обнаружен при анализе содержания ДНК в ядрах нейронов у взрослых половозрелых животных (крупных годовиков). На всех гистограммах наблюдалось характерно низкое число ядер с массой ДНК около 256с. Для большей достоверности этого факта на препаратах от висцерального комплекса ганглиев была профотометрирована дополнительная выборка ядер в диапазоне плоидности 128-1024с. Подсчёт подтвердил существование на гистограмме своеобразного провала для значений массы ДНК 256с (рис. 7, ВК, в, светлые столбики). В церебральных и педальных ганглиях количество нейронов с массой ДНК выше 256с не так велико, как в висцеральном комплексе, но и на этих гистограммах отчётливо наблюдается несоразмерно низкое количество ядер класса 256с. С целью выявления ДНК-синтетической активности клеток в ганглиях нормально растущих животных было поставлено два эксперимента. Первый эксперимент, выполненный с Н-тимидином in vitro, в итоге выявил приблизительно ту же динамику синтеза ДНК, что и второй У эксперимент — с введением Н-тимидина in vivo. Однако морфология ядер нейронов после инкубации ганглиев in vitro заметно отличалась от нормы -хромоцентрические ядра практически отсутствовали, хроматин обычно локализовался по периферии, некоторые ядра проявляли признаки дегенерации. В опытах in vivo морфология ядер нейронов не претерпевала подобных изменений: дегенерирующие ядра практически не встречались, а соотношение ядер с различной степенью компактизации хроматина соответствовало норме. Логично предположить, что введение 3Н-тимидина in vivo не только не изменяет структуру хроматина в ядрах нейронов, но и не искажает динамику синтеза ДНК, и, следовательно, является более физиологичным, чем инкубация иссечённых ганглиев in vitro. На основании изложенного для построения диаграмм были использованы данные только второго эксперимента (in vivo). Подсчёт индекса меченых ядер (ИМЯ, %) проводился у животных трёх размерно-возрастных групп, раздельно для разных ганглиев и с учётом уровней плоидности нейронов.
Для более наглядного отражения динамики полиплоидизации нейроны были сгруппированы следующим образом: I — самые мелкие нейроны с ядрами класса 2-4с (при этом исключали мелкие плотные ядра, принадлежащие клеткам соединительной ткани и нейроглии), II - мелкие нейроны классов 4-16с, III - средние нейроны классов 16-64с, IV - крупные нейроны классов 64-256с, V -гигантские нейроны с ядрами классов 512с и выше. Как видно из диаграмм (рис. 8) и усреднённых данных (табл. 4), синтез ДНК в нейронах наблюдается на протяжении всей жизни янтарок. Наиболее активно он проходит у сеголеток, где ИМЯ составляет в среднем 50,2 %. Учитывая, что 3Н-тимидин вводился однократно, такой высокий показатель ИМЯ означает, что практически все клетки в ганглиях ювенильных особей находятся в состоянии репродуктивного цикла. Затем следует постепенное снижение доли ДНК-синтезирующих ядер. Средние значения ИМЯ нейронов у мелких годовиков колеблются в пределах 24,5-47,0 %, у крупных годовиков - 4,7-8,4 %. При этом как у молодых, так и у взрослых животных не выявляется избирательности включения Н-тимидина в клетки каких-либо определённых классов плоидности. Синтез ДНК и рост равновероятно осуществляют и мелкие, и средние, и крупные, в том числе гигантские нейроны (см. рис. 8). У годовиков выявляются некоторые различия ИМЯ между типами ганглиев (см. табл. 4): более высокие значения характерны для церебральных ганглиев - 47,0 % у мелких годовиков и 8,4 % у крупных. В остальных ганглиях эти показатели ниже - 24,5 и 7,8 % в педальных; 35,7 и 4,7 % в висцеральном комплексе, соответственно. Интересно, что эти данные находятся в обратном соотношении с приростом среднего уровня плоидности: он максимален в висцеральном комплексе (х 5,7) и минимален в церебральных и педальных ганглиях (х 4,1; х 4,2) (см. табл. 4). Логично предположить возможность деления части нервных клеток или нейробластов в растущих церебральных ганглиях. Таким образом, нейроны различных ганглиев янтарки имеют несколько отличающуюся динамику синтеза ДНК, разнятся также и предельные классы плоидности у разных возрастных групп животных, однако общая картина возрастных изменений в ЦНС янтарки однозначна. Синтез ДНК и полиплоидный рост нейронов осуществляются на всех
Скрининг ЦНС пульмонат на проявление соматической полиплоидии
Как и в случае с янтаркой S. lauta, при определении плоидности нейронов у других видов улиток подсчитывали не все диплоидные ядра, а лишь те, которые попадали в поле зрения на препарате при обсчете полиплоидных ядер. Оценку средней плоидности (СП) проводили также без учета диплоидных ядер. Диплоидные клетки не учитывали ввиду невозможности достоверно отдифференцировать ядра диплоидных нейронов от ядер нейроглии. По усредненным данным от 3-5 животных строили гистограммы для каждого вида (рис. 20-31). Результаты, графически отображенные на гистограммах, в цифровом выражении приведены в таблице 5. По данным цитофотометрии, степень плоидности ядер нейронов ЦНС у всех 13 исследованных видов варьирует от 2-4с до максимальных видоспецифичных значений в сотни и тысячи гаплоидных единиц. На гистограммах выявляются спектры из мелких, средних, крупных и гигантских полиплоидных ядер. Сами же спектры довольно сильно разнятся даже у близкородственных видов. Общим моментом является кратность удвоения ДНК, ядер с промежуточными уровнями плоидности немного. Поскольку в этой части работы использовали только крупных половозрелых особей, кратность пиков гистограмм исходной величине 2с согласуется с данными по янтарке S. lauta (см. рис. 7). У янтарки такую же картину распределения полиплоидных ядер нейронов наблюдали у половозрелых особей, для которых было зарегистрировано существенное снижение темпов синтеза ДНК (см. рис. 8). У представителей сем. Lymnaidae - Lymnaea auricularia, L. koreana и L. peregra максимальные уровни плоидности ядер нейронов одинаковы и не превышают 512с-1024с ДНК. Эта степень полиплоидизации достигается за счет 8-9 циклов эндорепродукции. Средняя плоидность нейронов у L. koreana относительно невысока и составляет 37,4с. На рис. 21 видно, что большинство полиплоидных ядер нейронов у этого вида принадлежит 4с-8с-16с классам плоидности. У L. auricularia (рис. 20) и L. peregra (рис. 22) значения средней плоидности выше - 69,5с и 55,3с, соответственно. Большая часть полиплоидных клеток имеет ядра с массой 16с-32с-64с. В ЦНС L. auricularia имеется также достаточно много нейронов класса 256с, что и проявляется в незначительном повышении значения средней плоидности по сравнению с L. peregra. У Anisus subfilaris (рис. 23), представителя сем. Planorbiidae, максимальные классы плоидности равны 128с-256с, что соответствует 6-7 эндоциклам.
Средняя плоидность составляет 23,3с ДНК. Полиплоидные # ядра нейронов принадлежат в основном классам 4с-8с-16с-32с. Приведенные данные указывают на более низкую тенденцию к полиплоидизации нейронов ЦНС у A. subfilaris по сравнению с лимнеидами. У большинства представителей отр. Stylommatophora экстремальные проявления полиплоидии в нейронах несколько выше (на 1-2 эндоцикла), чем у исследованных Basommatophora. Самые высокие классы плоидности зарегистрированы у S. lauta - 8192с-163 84с и Bradybaena maacki - 4096с-8192с (табл. 5). Представитель сем. Succineidae - Oxyloma sp. (рис. 24) имеет такие же максимальные уровни плоидности нейронов, что и лимнеиды - 512с- 1024с ДНК. Сходна также и средняя плоидность - 53,9с. Однако у оксилемы на гистограмме распределения ядер нейронов по массе ДНК видны совершенно иные паттерны ведущих классов плоидности. Здесь выделяются своей многочисленностью ядра, принадлежащие 4с-8с и 32с- 64с-128с классам. Oxyloma sp. отличается и от другого представителя Л сукцениид - янтарки S. lauta (подробно охарактеризованного в главе 4.2). Средняя плоидность у янтарки очень высока и достигает 206с в церебральных, 110с в педальных и 782с в висцеральном комплексе ганглиев. Разница в достигаемой степени полиплоидизации у оксилемы и янтарки составляет 4-5 эндоциклов. У слизней сем. Lymaecidae также обнаружены видовые отличия проявления полиплоидии в ЦНС. Ядра нейронов Deroceras agreste полиплоидизируются до 1024с-2048с (рис. 25), что соответствует 9-10 циклам эндорепродукции; средняя плоидность равна 61,9с. Модальные классы плоидности принадлежат ядрам со значениями 16с-32с-62с ДНК. ЦНС Deroceras altaicum (рис. 26) отличается малым количеством высокоплоидных нейронов (см. табл. 5). Максимальная степень плоидности у D. altaicum в висцеральном комплексе ганглиев ниже, чем у D. agreste только на 1 класс и составляет 512с-1024с; нейроны педальных ганглиев полиплоидизируются в меньшей степени - до 128с-256с, а церебральных только до 32с-64с ДНК. Средняя плоидность в перечисленных группах ганглиев составила соответственно: 41,4с; 23,0с и 9,1с. Модальные значения плоидности в висцеральном комплексе ганглиев принадлежат 16с-32с-64с классам ядер, в педальных - 8с-16с, в церебральных особо выделяется только один класс - 4с. Ядра нейронов Deroceras leave (рис. 27) выстраиваются в такой же короткий ряд полиплоидных значений, как и у представителя отр. Basommatophora Anisus subfilaris - до 128с-256с ДНК. Однако средняя плоидность у D. leave приблизительно в два раза выше, чем у A. subfilaris и равна 36,3с в церебральных, 37,5с в педальных и 58,0с в висцеральном комплексе ганглиев. Значения средней плоидности нейронов D. leave также выше, чем у D. altaicum и ниже, чем у D. agreste. Пики классов полиплоидных нейронов церебральных ганглиев D. leave количественно представлены почти одинаково. В педальных ганглиях выделяются классы 16с-32с, в висцеральном комплексе ганглиев от 8с до 128с. Arion sp. (рис. 28) имеет самый длинный среди всех слизней ряд классов плоидности нейронов - до значений 2048с-4086с, что соответствует 10-11 эндоциклам, а также самую высокую среднюю плоидность в пределах семейства - 113,6с ДНК. На гистограмме выделяются пики полиплоидных ядер 4с и 16с-32с-64с. Представитель сем. Bradybaenidae - Bradybaena тааскі (рис. 29) имеет, как уже упоминалось, нейроны очень высокой степени плоидности -до 4096с-8192с ДНК. Эти нейроны обнаружены в висцеральном комплексе ганглиев улитки, значение средней плоидности в этой группе ганглиев равно 319,9с. Тем не менее, это в два раза ниже по сравнению со средней плоидностью нейронов висцерального комплекса ганглиев янтарки S. lauta, хотя максимальная степень полиплоидизации нейронов у этих двух видов различается мало. Нейроны церебральных и педальных ганглиев В. тааскі полиплоидизируются в равной степени: до 512с-1024с ДНК. Разность между экстремальными значениями плоидности нейронов этих ганглиев и нейронов висцерального комплекса составляет 3 цикла эндорепродукции.
Средняя плоидность в церебральных и педальных ганглиях относительно невелика - 38,5с и 42,1с, соответственно, поскольку в них явно преобладают нейроны средних уровней плоидности - до 64с. У Bradybaena ravida (рис. 30) максимальные зарегистрированные уровни плоидности составили 2048с-4096с, средняя плоидность -140,6с ДНК. Наибольшее число ядер принадлежит классам плоидности от 4с до 128с. Представитель сем. Hygromiidae - Cernuella sf. cisalpina (рис. 31) в церебральных ганглиях имеет гетероплоидный ряд ядер от 4с до 256с-512с, в педальных до 512с-1024с и в висцеральном комплексе до 1024с-2048с. Средняя плоидность равна 27,8с; 73,5с и 126,5с, соответственно. В церебральных ганглиях модальными являются классы 4с-8с-16с, в педальных и в висцеральном комплексе ганглиев - от 8с до 128с. На примере некоторых видов отр. Stylommatophora, у которых удалось исследовать 3 группы ганглиев (S. lauta, D. altaicum, D. leave, В. тааскі, С. sf. cisalpina), видно, что самые большие видоспецифичные значения плоидности ядер нейронов, в том числе и среднее, выявляются в висцеральном комплексе ганглиев (см. табл. 5 и рис. 20-31). Разброс значений экстремальных видоспецифичньгх уровней плоидности у изученных видов составил 6-7 циклов эндорепродукции: от \2Sc-256c у Anisus subjilaris и Deroceras leave до 8192с-163 84с у Succinea lauta. Степень полиплоидизации нейронов церебральных и педальных ганглиев разнится: у одних видов, как у Bradybaena maacki, она одинакова; у других видов отличается на 1-3 эндоцикла. Нейроны церебральных ганглиев S. lauta полиплоидизируются в большей степени, чем нейроны педальных ганглиев. На это указывает и более высокая (в два раза) средняя плоидность и разница в один класс протяженности рядов ядер. У Deroceras altaicum и Cernuella sf. cisalpina, наоборот, степень полиплоидизации нейронов педальных ганглиев выше, чем церебральных. Общим моментом является наличие у всех моллюсков в педальных ганглиях большого числа ядер \6c-32c классов, возможно специализированных как мотонейроны.
Специфика ганглиев по проявлению полиплоидии
Последующий цитофотометрический анализ содержания ДНК в нейронах S. lauta позволил установить, что ганглии нервного кольца янтарки различаются по степени проявления полиплоидии нейронов. Результаты цитофотометрии ДНК согласуются с морфометрическими данными, приведёнными в первой части работы. Церебральные ганглии, иннервирующие переднюю часть головы (зрительные и губные щупальца, ротовую область, глотку, статоцист, поверхность головы), содержат наибольшее количество мелких нейронов, в число которых входят кластерные скопления дорсальных тел и процеребрумов. Линейные размеры тел этих клеток составляют 3-40 мкм, уровень полиплоидизации не превышает 8с-16с ДНК. Нейроны размером 40-100 мкм полиплоидизируются в пределах 32с-256с, на долю этих клеток приходится менее половины от общего числа клеток ганглия. Встречающиеся ещё реже, до 5-7 штук на ганглий, крупные и отдельные гигантские нейроны достигают 180 мкм и при этом полиплоидизируются до 2048с-4096с. Л Обращает на себя внимание недостаточно большой разрыв в средней степени полиплоидизации нейронов церебральных ганглиев у сеголеток (50с) и неполовозрелых годовиков (62с). Т.е. уже у сеголеток устанавливаются пропорции плоидности нейронов, близкие к таковым у годовиков. Такое положение можно объяснить особенностями происхождения, развития и функционирования церебральных ганглиев. На примере морских гастропод показано, что эти ганглии закладываются в раннем эмбриогенезе и несут большую функциональную нагрузку уже на стадии свободноживущей трохофорной личинки у археогастропод (Moffet, 1995) и свободноживущего велигера, характерного для всех морских гастропод (Bulloch, 1985). Довольно рано устанавливаются и дефинитивные пропорции нейронов разной величины, что связано с полноценным, сбалансированным развитием всех систем органов чувств уже на планктонной стадии, например у Aplysia californica (Bulloch, 1985; Bulloch, Ridgway, 1995). Наши исследования показали, что у янтарки так же, как и у аплизии, подобные (близкие к дефинитивным) соотношения ядер разных уровней плоидности хорошо выражены уже в ЦНС самых юных сеголеток. Дополнительная полиплоидизация нейронов наблюдается у половозрелых животных, но при этом гетероплоидный паттерн мало изменяется: добавляется в среднем два эндоцикла, средний уровень плоидности возрастает в 4,1 раза.
Интересным представляется факт увеличения темпов прироста среднего уровня плоидности в церебральных ганглиях крупных половозрелых годовиков (см. табл. 3). Если у мелких годовиков прирост среднего уровня плоидности (относительно сеголеток) в церебральных ганглиях минимален и составляет xl,2 (по сравнению с педальными ганглиями - х2,4 и висцеральным комплексом - х2,8), то у крупных половозрелых годовиков он максимален - хЗ,3 (по сравнению с xl,8 и х2 в других ганглиях). По-видимому, этот опережающий рост нейронов церебральных ганглиев в период становления половой зрелости связан как с непосредственным участием данных ганглиев в иннервации дистальных отделов репродуктивной системы, так и с общими перестройками организма, направленными на созревание и функционирование половой системы. В педальных ганглиях янтарки основная масса нейронов имеет линейные размеры 40-100 мкм и массу ДНК в пределах 32с-128с. Так как педальные ганглии иннервируют в основном мышцы ноги, логично предположить, что ядра классов 32с-128с в данных ганглиях принадлежат мотонейронам. Гигантские нейроны педальных ганглиев, достигающие 300-320 мкм, содержат до 2048с ДНК; их общее число, как и в церебральных ганглиях, невелико. В ходе эмбрионального развития педальные ганглии закладываются практически одновременно с церебральными, но темпы полиплоидизации нейронов на ювенильной стадии в них отстают в два раза (у сеголеток средняя плоидность 26с по сравнению с 50с в церебральных ганглиях). В дальнейшем средний уровень плоидности педальных нейронов возрастает примерно так же, как и в церебральных ганглиях - в 4,2 раза, но не с возрастанием темпа, а, наоборот, с затуханием (х2,4, потом xl,8). Равномерная динамика полиплоидизации педальных нейронов соответствует общим ростовым процессам животного, в частности, росту мышечной массы ноги на протяжении второго лета жизни. Висцеральный комплекс ганглиев, как показано на примере Aplysia, формируется уже после вылупления в ходе личиночного развития. Начиная с метаморфозной стадии идентифицируются отдельные достаточно большие (15 мкм) нейроны (Bulloch, 1985; Moffet, 1995). У янтарки определённые соотношения будущих крупных и гигантских нейронов наблюдаются уже у сеголеток. У взрослых животных длина тел большинства крупных и гигантских нейронов колеблется в пределах 100-320 мкм, уровни плоидности - 512с-4096с. Отдельные гигантские нейроны висцерального комплекса имеют максимальные для ЦНС янтарки линейные размеры — до 380 мкм и, соответственно, максимальные значения массы ДНК - до 8192с-163 84с. Динамика полиплоидизации больше соответствует педальным ганглиям. Особо отметим, что, если в церебральных и педальных ганглиях преобладают мелкие и средние нейроны, а уровни полиплоидизации самых крупных нейронов не превышают 2048с-4096с ДНК, то в висцеральном комплексе содержится основное количество крупных и гигантских (до 16384с) нейронов всей ЦНС. Можно предположить что,.многочисленность гигантских высокоплоидных нервных клеток в висцеральном комплексе определяется функциональной спецификой его ганглиев и / или рядом макроанатомических перестроек, сопровождающих возникновение и эволюционное развитие данного комплекса в ЦНС высших гастропод.
Висцеральный комплекс Succinea lauta (как представителя отряда Stylommatophora), образован соприкасающимися париетальным, абдоминальным и паллиальным ганглиями (а также мелкими плевральными ганглиями, которые нами не исследовались ввиду того, что разрушаются при разделении нервного кольца). Ганглии висцерального комплекса обеспечивают иннервацию практически всех внутренних органов, кровеносной системы и мантии и поэтому, в отличие от специализированных церебральных и педальных ганглиев, являются полифункциональными. Их гигантские нейроны, по-видимому, не просто иннервируют разнообразные внутренние органы улитки, но координируют их развитие и нагрузку, то есть являются командными интернейронами. Известны особые свойства таких нейронов: специфическая электровозбудимость тел нейронов, генерация длительного потенциала действия, синтез больших количеств РНК и белка и некоторые другие (Шеперд, 1987). Сделано предположение, что именно гигантизм командных интернейронов, основанный на их полиплоидизации, может обеспечить такие свойства и способность координировать большие периферические области (Анисимов, 1999в). Любопытным и неожиданным результатом в нашей работе явился факт снижения числа ядер класса 256с (провал на гистограммах). Дать однозначную оценку этому явлению довольно сложно, однако можно предположить, что по этому уровню проходит качественное разделение нейронов. Тогда логично считать, что нейроны, превышающие некоторый критический уровень массы ДНК, (в нашем случае - 256с) и формируют ту особую субпопуляцию клеток, которые принято называть гигантскими нейронами. Вполне вероятна их специализация как интегрирующих интернейронов. 5.3. Возможность размножения клеток в ЦНС В нашей работе, по-видимому, впервые в ЦНС легочных моллюсков обнаружено митотическое деление клеток. Митозы, наблюдавшиеся нами в церебральных ганглиях (преимущественно в процеребрумах и дорсальных телах), могут быть равновероятно отнесены не только к делению клеток глии, но и к пролиферации самых мелких нейронов или нейробластов. Это предположение согласуется с данными Н-тимидиновой авторадиографии: наибольшая ДНК-синтетическая активность зарегистрирована в церебральных ганглиях сеголеток, у которых встречаемость митозов также наиболее частая.
