Введение к работе
Актуальность проблемы. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) является актуальным направлением исследований в области клеточной биологии и регенеративной медицины. Проблема плюрипотентных клеток тесно связана с пониманием механизмов индивидуального развития и регенерации тканей. Получение новых линий иПСК из разных источников открывает широкие возможности использования их в фундаментальных и прикладных медико-биологических исследованиях. Линии иПСК могут быть использованы при моделировании многих заболеваний и тестировании новых лекарственных средств. Эффективность образования иПСК очень низка, поэтому в настоящее время идет поиск таких типов клеток, которые могут быть репрограммированы более эффективно, а полученные иПСК будут обладать способностью дифференцироваться в заданном направлении. Опубликовано большое количество работ, посвященных поиску новых типов клеток, которые можно использовать для репрограммирования. К моменту начала нашего исследования, нам не были известны опубликованные работы по репрограммированию клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека. Клетки ДП являются уникальным объектом исследований. Они играют ведущую роль в формировании волосяного фолликула и регуляции цикла его роста, а также являются резервуаром мультипотентных стволовых клеток. Мы посчитали интересным использовать клетки ДП в качестве альтернативного источника иПСК. Принимая во внимание мультипотентный статус клеток ДП, мы предположили, что эффективность репрограммирования клеток ДП, в одних и тех же условиях, будет выше, чем эффективность репрограммирования классического объекта - дермальных фибробластов. Для увеличения эффективности репрограммирования мы культивировали клетки в присутствии ингибитора гистоновых деацетилаз - вальпроевой кислоты (Medvedev et al ., 2011) в условиях физиологического уровня (5%) содержания кислорода (Warren et al., 2010).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в получении иПСК из клеток ДП фолосяного фолликула человека. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Репрограммировать клетки ДП человека посредством трансфекции генами транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Выделить репрограммированные до плюрипотентного состояния клоны иПСК - ДП.
Исследовать недифференцированный статус полученных иПСК - ДП.
Проверить плюрипотентный статус иПСК - ДП in vitro и подобрать условия для направленной дифференцировки иПСК - ДП.
Проверить плюрипотентный статус полученных иПСК - ДП в экспериментах in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые показана возможность получения иПСК из клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека при использовании лентивирусной доставки транскрипционных факторов - Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус в присутствии ингибитора гистоновых деацетилаз - вальпроевой кислоты при инкубации в условиях физиологического содержания кислорода (5%). Было определено, что эффективность репрограммирования при использовании данного подхода для клеток ДП составила 0,03%, тогда как в работе Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2012) по данной тематике эффективность составляла 0,02%. В работе впервые применен метод селекции репрограммированных клеток из культуры ДП человека, основанный на прижизненном иммуномечении против поверхностного антигена ПСК - Тга-1-60. С помощью различных методов охарактеризован плюрипотентный статус полученных иПСК - ДП. Впервые разработаны протоколы направленной дифференцировки иПСК - ДП. Показано, что полученные нами иПСК - ДП обладают способностью дифференцироваться in vitro в нейро-, остео- и гепатоцитарном направлении. Было выяснено, что полученная нами культура иПСК - ДП обладает большим потенциалом к дифференцировке в гепатоцитарном направлении, чем иПСК, полученные из фибробластов. Полученные данные свидетельствуют о преспективности использования иПСК - ДП для решения возможных медицинских задач, в том числе для тестирования лекарственных средств. Результаты, полученные в данном исследовании, могут быть полезны для оптимизации протоколов дифференцировки плюрипотентных клеток и для понимания механизмов, работающих в раннем развитии.
Апробация рботы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2010, 2011, 2012 гг.); на международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 24 мая 2012); на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2013» (Москва, 8-13 апреля 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 патент на изобретение, статей в журналах, соответствующих перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 6.
Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных результатов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 страницах, содержит 18 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 141 цитируемый источник.
