Введение к работе
Актуальность темы исследования. Устойчивость клеток опухолей к различным антинеолластическии препаратам существенно снижает эффективность современных курсов химиотерапевтического лечения. Линии клеток, устойчивые к противоопухолевым препаратам, получаемые и исследуемые in vitro, служат адекватной и удобной моделью для понимания механизма лекарственной резистентности клеток.
Особенности фенотипа клеток с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) во многих чертах охарактеризованы и главной является снижение накопления ими различных химиопреларатов Clnaba е.'а.,1979; Skovagaard,IJiXaen,1982), обусловленное присутствием в устойчивых клетках трансмембранного белка, называемого Р-гликопротеином (Ling е.а.,1974), осуществляющего активное выведение ксенобиотиков. В связи с этим вопрос о регуляции функциональной активности Р-гликопротеина, наряду с вопросами о регуляции его експрессии и механизмах самого транспортного процесса, становится одним из наиболее важных для углубленного понимания феномена ИЛУ.
Существенными чертами фенотипа клеток, проявляющих МЛУ, оказываются также изменения активности ферментов системы дето-ксикации (Cowan е.а.,1986), внутриклеточного распределения хи-миопрепаратов (Supino е.а.,1986), а также изменение влияния противоопухолевых препаратов на свои мишени (Glisson е.а.,1986; Capranioo е.а.,1986; Potmeail е.а.,1988). В то же время показана .принципиальная возможность реверсии устойчивости опухолевых клеток под влиянием различных агентов (Tsuruo е.а.,1983; Ramu е.а.,1984). Принято считать, что они влияют на транспортную функции Р-гликопротеяна и задерживают выведение химиопре-ларатов. Большинство этих агентов влияет и на фосфолилид-Са -зависимую прогешкиназу С (Ж С), однако роль этого фермента в обеспечении ИЛУ окончательно не выяснена.
Известно, что обработка чувствительных и устойчивых вариантов клеток форболовыи эфиром приводит к увеличению их резистентности (Ferguson е.а.,1987; Pine е.а.,1988),чго связано С усиленным ФосФооптированием Р-гликопротеина по остаткам серина,
возможно в результате активности ПК С (Hamada е.а.,1987). Исследование профилей фосфорилирования белков из устойчивых вариантов клеток выявило увеличенное фосфорилирование не только Р-гликопротеина (Marsh,Center,1935), НО И увеличение степени фосфорилирования многих других белков клеток (Fine е.а.,1985, 1986).
Изучение ПК С з клетках с ГМУ может внести значительный вклад в понимание механизмов регуляции такого феномена как МЛУ, а также многих других процессов, в которых участвует ПК С. В ходе дальнейших исследований в этом направлении должен расшириться перечень субстратов ПК С в сопоставлении с их функциональной характеристикой. К различным физиологическим функциям, регуляция которых осуществляется при участии ПК С, включающим экспрессию некоторых генов, секрецию, экзоцитоз, модуляцию ионной проницаемости и взаимодействие разнообразных ли-гандов со своими рецепторами, вероятно, будет относиться и обеспечение устойчивого фенотипа трансформированных клеток.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании роли ПК С в обеспечении МЛУ, а также в попытке идентификации возможных субстратов для этого фермента. Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи:
-
Провести сравнительный анализ активности, свойств и субклеточного распределения ПК G в клетках с ГМУ и их чувствительных аналогах.
-
Исследовать влияние селективного агента бромистого этвдия на активность ПК С в устойчивых к нему сублиниях клеток.
-
Изучить участие ПК С в транспорте и накоплении селективного агента бромистого этидия и флуоресцентного красителя Хехст 33 342.
Научная новизна полученных результатов. Работа содержит новые данные, касающиеся возможной экспрессии дополнительных изозимов ПК С в клеткахсМЛУ по сравнению с их чувствительныгли аналогами.
Комплексное применение методов ионообменной хроматографии
и проточной цитофлуорииетрии позволило показать, что феномен ' МЛУ включает в себя изменение не только активности ПК С, но и изменение спектра изозимов фермента, что значительно расширяет современные представления о функционировании этого, одного из наиболее существенных для жизнедеятельности клетки фермента.
Впервые показана возможность существования дополнительной компоненты, помимо ускоренного выведения токсических веществ, в механизме МЛУ, которая касается изменения доступности хроматина для ДЖ-тропных препаратов, модулируемой фосфорилировави-ем.
Практическое значение работы. Изучение ПК С-зависимого фосфорилирования в клетках с МЛУ представляет,не только большой научный интерес для исследования новых аспектов данной проблемы, но и имеет непосредственное отношение к проблеме хи-шотерапни опухолей в клинике. В опухолях пациентов, прошедших и непрошедших курс химиотерапии, часто встречаются варианты клеток с перекрестной устойчивостью к различным противоопухолевым препаратам. Выполненная работа создает новые возможности для поиска средств решения такой важной онкологической проблемы как МЯУ. Некоторые из препаратов, обладающих способностью повышать чувствительность устойчивых вариантов клеток к антя-неодяастическим средствам, уже используются з клиниках. Однако они характеризуются высокой токсичностью (как, например, вера-панки), что препятствует их эффективному применения.
Повышенная чувствительность устойчивых вариантов клеток к ингибиторам ПК С, обнаруженная в данной работе, такае может привлечь внимание онкологое. Наибольший интерес могут представлять результаты, продемонстрировавшие усиление цитотоксиче-ского действия селективного агента для устойчивых вариантов клеток в присутствии ингибитора ПК С трифторперазина - химис-тералєБТЯческого средства, относящегося к группе нейролептиков или "больших транквилизаторов", применяющегося в клинике с 50-х годов.
Выполненная работа позволяет считать механизм МЛУ комплексным, реализующимся на нескольких различных уровнях, каждый из которых может тлеть свои способы купирования.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород,1986), Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград, 1988), Конференции молодых ученых, посвященной 30-ле-тив ИНЦ (Ленинград,1989), а также неоднократно на семинарах в Институте цитологии АН СССР.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Объем работы. Диссертация изложена на lit стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 255" публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 8 таблицами.
