Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы
1.1 Строение миометрия. Морфо-функциональные особенности гладкой мышечной ткани матки 11
1.2 Особенности строения миометрия во время беременности и после родов 16
1.2.1 Изменение миометрия во время беременности 17
1.2.2 Изменение миометрия в послеродовом периоде 20
1.3 Влияние половых гормонов на структуру миометрия 22
1.4 Механизмы преобразований, происходящих в матке во время беременности и после родов 24
1.5 Роль коллагена в формообразовательных процессах в матке во время беременности и после родов 27
1.6 Апоптоз 34
1.6.1 Определение апоптоза и его биологическое значение 34
1.6.2 Регуляция апоптоза 37
1.6.3 Стадии апоптоза, его морфологические и биохимические проявления 40
1.6.4 Молекулярные механизмы апоптоза 42
1.6.5 Апоптоз в матке и его гормональная регуляция 45
II. Материалы и методы исследования
2.1 Объект исследования 50
2.2 Светооптический метод исследования 51
2.3 Метод электронной микроскопии 52
2.4 Метод морфометрии 52
III. Результаты исследования и их обсуждение 55
3.1 Результаты морфологического исследования миометрия животных контрольной группы 58
3.2 Данные морфологического исследования миометрия животных в процессе физиологической беременности 63
3.3 Результаты морфологического исследования миометрия животных в раннем послеродовом периоде 88
3.4 Заключение 123
Выводы 126
Приложения 128
Список литературы 133
- Особенности строения миометрия во время беременности и после родов
- Механизмы преобразований, происходящих в матке во время беременности и после родов
- Светооптический метод исследования
- Метод морфометрии
Введение к работе
Проблема нормального роста и дифференцировки клеток и тканей -одна из наиболее успешно решаемых проблем гистологии.
Согласно гистогенетической концепции (Клишов А. А., 1984) репара-тивная регенерация реализуется теми же механизмами, что и процессы физиологической регенерации.
В ряде тканей, в частности, эпителиальных (Шубникова Е. А., 1996), имеет место активное обновление клеток. Пул активно функционирующих клеток пополняется за счет деления малодифференцированных клеток и их дифференцировки, в то же время избыток клеток элиминируется. В норме эти процессы хорошо сбалансированы, и общее количество клеток поддерживается на постоянном уровне. В других тканях активное обновление может запускаться специальными факторами. Например, в интактной дефинитивной гладкомышечной ткани крайне редко удается обнаружить миоциты, находящиеся в состоянии митоза. Однако при увеличении функциональной нагрузки в ней проявляются значительные пролиферативные возможности (Данилов Р. К., Быков В. Л., 2001). Регенерация осуществляется за счет мобилизации малодифференцированных гладком ышечных клеток, обладающих способностью вступать в митотический цикл, их деления и последующей дифференцировки.
Важным компонентом этого приспособительного механизма гладкой мускулатуры на тканевом уровне является динамичное изменение структуры популяции миоцитов (соотношения различных функциональных подтипов), обусловленное их различной пролиферативной активностью и неодинаковой чувствительностью к повреждающим и, возможно, регуляторным факторам.
С позиций современных представлений о компенсаторно-приспособительных механизмах, в частности, физиологической регенерации чрезвычайно интересны примеры масштабных преобразований, происходящих в отдельном органе взрослого животного в физиологических условиях,
например, увеличение размеров матки во время беременности, а также уникально высокая скорость ее послеродовой инволюции.
Суть процессов, обеспечивающих увеличение массы матки во время беременности, изучена в ряде исследований (Schaub М. С, 1964, Woessner J. F., 1965, Halme J., Jaaskelainen M., 1970, Shaikh A. A., 1971, Kelly R. E., Ver-hage H. G., 1985, Morton A.J., Goldspink D. F., 1986, Goldspink D. F., Douglas A, J., 1988, Thilander G., Rodriguez-Martinez H., 1989, Nishinaka K., Fukuda Y., 1991, T assell W. e t a 1,, 2 000). Зна чительное количество работ, касающихся структурных изменений в матке во время беременности и после родов, посвящено изучению эндометрия (Telfer V, F., Hisaw F. L., 1957, Banon P. et al., 1964, Miyoshi K. et al., 1990, Ritter J, Philippe E., 1990, Otsuki Y., 2001). Достаточно полно изучен коллаген матки: его количественное содержание в тканях (Sharrow L. et al., 1989, Kaidi R. et al., 1991), механизмы разрушения, ферменты (Anton E. et al, 1969, GalambosJ.T. et al., 1976, Woessner J. F., 19 76, Woessner J. F., Ryan J. N.. 1980, Milwidsky A. et al., 1982, Henell F. et al, 1983, Shimizu K., 1983, Shimizu K, Maekawa K., 1983, Blair H. С et al., 1986, Shimizu K., Hokano M., 1988, Balbin M. et al., 1998, Рывняк В. В., 2001) и внутриклеточные структуры (Roth М. et al., 1981, Bienkowski R. S., 1985, Everts V. et al., 1996, Рывняк В, В., Дулгиеру О. Ф., 2003), обеспечивающие его элиминацию после родов. Инволюционные процессы в миометрии после родов изучены в значительно меньшей степени. Отдельные морфологические и биохимические исследования, касающиеся собственно миоцитов, не формируют целостного представления о процессах в миометрии, приводящих к быстрому восстановлению первоначальных (до начала беременности) размеров матки (Maibenco Н. G., 1960, Dessouky D. А., 1971, Henell F. et al., 1983, Inouye S. et al., 1983, Morton A. J., Goldspink D. F., 1986). Никто из вышеуказанных авторов не делал попытки провести морфо-функциональную классификацию миоцитов в-послеродовом миометрии, не были рассмотрены в сравнительном аспекте зоны миометрия по месту плацентации и вне его. Кроме того, вопрос
об отсутствии воспалительной реакции в связи с процессом отторжения плаценты в физиологических условиях остается до сих пор открытым, так как результаты исследований противоречивы. В некоторых из них подтверждается наличие воспаления в связи с обнаружением в тканях матки клеток воспаления (Padykula Н. А., 1976, Mackler А. М. et al., 1999, Thomson A. J. et al., 1999, Mackler A. M. et al., 2000), результаты других исследований свидетельствуют об отсутствии типичной воспалительной реакции (Maibenco Н. С, 1960, Montfort I., Perez-Tamayo R., 1961, Butterworth В. H. et al., 1991, Brandon J. M., 1994, Nilsen-Hamilton M. et al., 2003). Вместе с тем, деструкция клеток, которая имеет место при отторжении плаценты, рассматривается в качестве пускового механизма воспаления вне связи с его этиологией и механизмом, исключая апоптоз.
В связи с вышеизложенным определена цель исследования: изучить особенности структурных преобразований в миометрии крыс во время беременности и в ранний послеродовый период.
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить вероятную морфо-функциональную вариабельность миоцитов на
светооптическом и электронномикроскопическом уровнях; исследовать
динамику их соотношений в процессе беременности и в ранний послеро
довый период.
Изучить особенности клеточных преобразований миометрия до и после родов; сравнить их проявления в плацентарной и межплацентарной зонах матки.
Изучить клеточный состав инфильтрата в миометрии до и после родов.
Выяснить, сохраняются ли морфологические проявления инволютивных процессов к моменту, когда масса матки возвращается к доберемеиному уровню.
Научная новизна.
Впервые проведена морфо-функциональная классификация паренхиматозных элементов миометрия. Впервые показано, что структурные преобразования в миометрии, проявляющиеся уменьшением размеров и гибелью миоцитов, имеют место задолго до родов (по меньшей мере, в первой половине беременности). Найдены несколько ведущих клеточных механизмов, обеспечивающих уменьшение массы миометрия: клазматоз, апоптоз и дистрофические изменения миоцитов, проведен количественный анализ их соотношения. Приведены свидетельства массовой гибели глад ком ышечных клеток в послеродовый период, при этом, как показано, не происходит развития типичной воспалительной реакции. Проведен сравнительный анализ соотношения различных типов миоцитов в двух функциональных зонах миометрия во время беременности и в ранний послеродовый период. Впервые показано, что гибнущие миоциты образуют в миометрии группы («интерсти-циальные конгломераты») между пучками функционирующих клеток. Это явление имело место в дородовый период и резко увеличивалось по масштабу в послеродовый период. Получены свидетельства о том, что на момент возвращения массы матки к добеременному уровню инволютивные процессы в миометрии проявляются все еще достаточно интенсивно.
Теоретическое и практическое значение.
Данное исследование углубило понимание сути «подготовительных» процессов в дородовый и инволютивных процессов, происходящих в миометрии, в послеродовый периоды. Получены свидетельства того, что чрезвычайно активный процесс снижения массы мышечной оболочки матки является по сути физиологической атрофией органа, направленной, очевидно, на восстановление структурного гомеостаза при отмене функционального запроса на повышенную и иную, чем в норме, функцию, но реализующего это в полной мере в связи с утратой части миоцитов. Результаты работы могут быть использованы как основа для изучения процессов гомеостазирования в
физиологических условиях, изучения особенностей репаративных процессов в сочетании с физиологической атрофией органа для изучения ряда патологических состояний в процессе родов и в послеродовом периоде при повторных родах.
Положения, выносимые на защиту:
Ведущие механизмы, обеспечивающие быстрое уменьшение массы миометрия после родов, - апоптоз, клазматоз, баллонная дистрофия миоцитов. Структурные преобразования, происходящие в миометрии в первой половине беременности, имеют сходство с таковыми в период инволюции после родов.
В обеих исследованных зонах миометрия (прилежащей к плаценте и межплацентарной) во время беременности и после родов происходят сходные по проявлениям и последовательности, но различные по интенсивности структурные преобразования (апоптоз, клазматоз, баллонная дистрофия миоцитов, более выраженные в месте плацентации).
Степень васкуляризации миометрия уменьшается во время беременности и имеет сильную обратную связь с появлением вакуолизированных и дистрофически измененных миоцитов. Такие измененные гладкомышечные клетки, завершившие жизненный цикл, во время послеродовой инволюции объединяются в специфические «интерстициальные конгломераты».
Массовые повреждения миоцитов по механизму баллонной дистрофии не вызывают развития типичной воспалительной реакции, при этом инволю-тивные процессы, протекающие на момент восстановления исходной массы матки, остаются достаточно выраженными на 5-е сутки послеродового периода.
Апробация работы.
Материалы работы доложены на VII Конгрессе Ассоциации морфологов (Казань, 2004 г.), V Съезде анатомов, гистологов и эмбриологов с международным участием (Казань, 2004 г.), научной конференции «Проблемы
лимфологии и интерстициального массопереиоса» с международным участием (Новосибирск, 2004 г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 4 работы.
Объем работы.
Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 23 микрофотографии, 33 электронограммы, 11 таблиц, 21 график, 3 схемы и 4 приложения. Список литературы содержит 37 русскоязычных и 174 иностранных источника.
Особенности строения миометрия во время беременности и после родов
Матка млекопитающих представляет собой интересную модель для изучения анаболических и катаболических процессов, протекающих в тканях взрослого животного в естественных для организма (физиологических) условиях. Особенностью этого органа является то, что все изменения, происходящие в матке во время беременности и после родов, уникальны по своей интенсивности. Так, во время беременности отмечают значительное увеличение ее размеров, а после родов первоначальные размеры матки и ее функциональная активность восстанавливаются в удивительно короткий срок. При этом столь значительные преобразования имеют место в условиях, которые не являются для организма патологическими. Наиболее наглядно интенсивность данных процессов прослеживается у лабораторных животных - мышей и крыс, имеющих короткую продолжительность эмбриогенеза и период послеродовой инволюции,
Матка млекопитающих во время беременности подвергается значительным структурным изменениям. По наблюдениям Maibenco Н. С. (I960) и Woessner J. F. (1965) у крыс ее масса возрастает с 0.4 г до 2.9-4.0 г (т.е. имеет место почти 10-кратное увеличение массы органа). У мышей матка во время беременности (за 20 суток) претерпевает аналогичные по масштабу изменения, увеличиваясь с 0Л5 до 1.1 г (Nilsen-Hamilton М. et al., 2003).На 7-10 сутки беременности ГМК миометрия незначительно гипертрофированы и содержат хорошо развитый ГЭР. В межклеточном пространстве нередко отмечают явления отека.
К 16-20 суткам миоциты максимально гипертрофированы и имеют эо-зинофильно окрашенную цитоплазму. Строма выглядит более отечной, чем на ранних сроках беременности. Увеличена доля тонких эластических волокон вокруг отдельных ГМК. Кровеносные сосуды, расположенные между продольным и циркулярным слоями мышечных клеток, сильно расширены. Электронномикроскопическое исследование подтверждает значительную степень гипертрофии миоцитов. При этом в клетках присутствует хорошо выраженный опорный аппарат (микрофиламенты), а между ними располагается значительное количество эластических волокон.Процессы, происходящие в матке во время беременности, имеют определенное сходство с явлениями, присущими миоцитам матки во время эмбриогенеза. Например, у человека в конце первого триместра (12-14 недель беременности) в миометрии преобладают процессы гиперплазии ГМК. На 20-26 неделях беременности в увеличении ее массы все большую роль начинают играть процессы гипертрофии миоцитов. В этот период ГМК матки женщины представлены "синтетическими" и "промежуточными" типами. Типичные ГМК не экспрессируют антиген пролиферирующих клеток PCNA, в них в равной степени развиты синтетический аппарат и актиновые филамен-ты.. В конце беременности (35-40 недели) в миометрии преобладают ГМК"сократительного" типа, которые являются наиболее дифференцированными формами (Шубникова Е. А. и др., 2001).
Первоначальные предположения об изменении массы матки во время беременности связывали только с процессом гипертрофии без изменения количества самих миоцитов (H.G. Maibenco, 1960). Позже многие исследователи предположили, что увеличение размеров матки может происходить и за счет увеличения количества клеток — гиперплазии (Goldspink D. F., Morton A. J., 1985).По данным Brody (1958), у человека процессы гиперплазии и гипертрофии дают примерно равный вклад в увеличение размеров миометрия во время беременности. Другие исследователи (Strauss, 1969) считают, что вклад процессов гипертрофии и гиперплазии имеет отношение как 5:1.
Интересное и практически уникальное исследование, проведенное Afting E.G., Elce J.S. (1978), также свидетельствует в пользу предположения об увеличении количества клеток в миометрий во время беременности (необходимые результаты приведены в Табл. 1).лоидных и/либо о появлении в матке полиплоидных клеток, В ходе проведенного наблюдения было показано, что масса миометрия увеличилась в 7 раз, а количество ДНК (т.е., предположительно, количество клеток) выросло в 2.5 раза. Таким образом, по данным Afting Е. G., Elce J. S. (1978), за время беременности у крыс вероятный вклад процессов гипертрофии и гиперплазии в увеличение массы миометрия соотносится как 2,8:2,5.
К сожалению, другие исследователи концентрировали внимание только на цельную матку в процессе беременности и после родов, а не на ее отдельные оболочки. В работе Fang Y. P. et al. (1999) приводятся данные по массе матки мышей и росту в ней количества ДНК во время беременности. Показано, что в первой половине беременности оба показателя увеличиваются приблизительно с равной скоростью, а ближе к родам рост массы ДНК отстает от тканевого. Допуская, что все клетки сохраняют диплоидный набор генетического материала, можно заключить, что рост массы матки в первой половине беременности обусловлен в основном делением клеток, а на завершающих стадиях беременности происходит усиленный рост клеток (гипертрофия) без увеличения их количества.
В нескольких отмеченных выше экспериментах отмечен рост общего количества ДНК в тканях матки, но ни в одном из них нет морфологического подтверждения обычных митозов. Вполне возможно, это свидетельствует о том, что в тканях матки имеют место эндомитозы, приводящие не к увеличению количества клеток, а к появлению полиплоидных клеток. Таким образом, вопрос об изменении количества клеток в течение беременности остается дискуссионным.
Механизмы преобразований, происходящих в матке во время беременности и после родов
В небеременном состоянии в матке наблюдали равновесие между процессами синтеза и распада биологических молекул. Такое равновесие определяет достаточно стабильную массу органа. Во время беременности происходит сдвиг равновесия в сторону усиленного синтеза; во время инволюции, наоборот, преобладают катаболические процессы, и матка быстро теряет массу. По результатам ультрамикроскопических исследований Henell F. et al. (1983) предположили, что во время беременности масса матки возрастает за счет усиленного синтеза коллагеновых волокон и гипертрофии (возможно, и гиперплазии) миоцитов. Послеродовой инволютивный процесс также затрагивает различные тканевые компоненты: внутриклеточный материал (в первую очередь мышечные белки) и межклеточное вещество соединительной ткани. По предложению F. Henell et al. (1983) инволюция матки после родов осуществляется по меньшей мере тремя механизмами: а) гетёрофагией (фагоцитозом) коллагеновых волокон макрофагами и фибробластами; б) кринофагией - разрушением внутри фибробластов новосинтезиро ванных коллагеновых волокон, которые не успели переместиться за пределы клеток. в) аутофагией (аутолизисом) миоцитов (этот механизм наименее зна чим). Большинство имеющихся в литературе морфологических исследований, касающихся роста и послеродовой инволюции матки, посвящено синтезу и элиминации коллагена, а также изменениям, происходящим в эндометрии (Parakkal P.F., 1969, 1972, Brandes D., Anton E., 1969a, 1969b); гораздо меньше внимания уделяется миометрию, в частности, тем изменениям, которые происходят в гладкомышечных клетках (Brandes D., Anton Е., 1969b). В работе S. Inouye et al., (1983) на электронномикроскопическом уровне в послеродовом периоде описан клазматоз в гладких миоцитах.
Под этим термином понимают выпячивания периферических участков цитоплазмы (в данном случае ГМК) с низкой электронной плотностью, почти прозрачные, по направлению к окружающей соединительной ткани с последующей от-шнуровкой этих участков (Струков А. И. и др., 1990). Скопления таких цито-плазматических выпячиваний хорошо заметны в световой микроскоп. Рядом с выростами цитоплазмы обнаружены макрофаги и фибробласты, охваты вающие отделяющиеся участки ГМК. По мнению S. Inouye et al., (1983) клазматозные выпячивания являются реакцией гипертрофированных миоци-тов на резкую гипоксию из-за сужения сосудов миометрия вскоре после родов. Отрыв фрагментов цитоплазмы может приводить к уменьшению размеров миоцитов. F. Henell et al. (1983) считают, что для ГМК во время инволюции характерен аутофагоцитоз, и именно этим механизмом обеспечивается уменьшение размеров клеток. Активная аутофагия может приводить к гибели ГМК. Результаты упомянутых исследований подтверждают предположения Е. G. Afting, J. S. Elce (1978) об аутолизисе клеток, который может приводить к гибели части ГМК. W. Bush, В. Lamber (1984) выдвинули гипотезу о том, что в послеродовой инволюции матки определенную роль может играть апоптоз.
Увеличение интенсивности апоптоза связано с ростом количества клеток с признаками их терминальной дифференцировки. Используя специфический метод выявления клеток, в которых запущен апоптоз, Р. С. Leppert (1998) показал увеличение в миометрии шейки матки доли миоцитов с 12% в контроле (у небеременных животных) до 42% после родов. Одним из свидетельств в пользу участия апоптоза может являться то, что ГМК не проявляют свойств клеточного некроза или патологической деструкции - ни при морфологическом изучении (Brandes D., Anton Е., 1969, Woessner J.F., 1977), ни на биохимическом уровне (Woessner J. F., 1965). По результатам большинства работ во время инволюции в миометрии не происходит развития воспалительной реакции. Сведения о возможном участии воспалительной реакции при послеродовой инволюции очень скудны: по данным В. Н. Butterworth et al., (1991) в миометрии человека перед родами нейтрофилы отсутствуют. В аналогичном исследовании, проведенном A. J. Thomson et al. (1999), в миометрии перед родами выявляется очень мало нейтрофилов, макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, но за время родов плотность этих клеток на единицу объема миометрия вырастает в несколько раз. Тем не менее, вопрос об активном участии всех клеток воспаления на протяжении всего периода инволюции матки сохраняется в полной мере. Таким образом, к настоящему моменту выявлены несколько механизмов, предположительно обеспечивающих обратное развитие матки после родов. К ним относят аутофагоцитоз, клазматоз, апоптоз ГМК, а также внутри- и внеклеточную деградагіию коллагеиовых волокон. Однако, вклад као/сдого из перечисленных механизмов в общий прогресс инволюции остается дискуссионным вопросом.
Светооптический метод исследования
Для гистологического исследования брали звенья маточных рогов, расположенные в центре. В плацентарной области из них удаляли эмбрионы или плоды вместе с комплексом внезародышевых органов. Плацентарную и межплацентарную зоны матки в послеродовом периоде дифференцировали по наличию или отсутствию кровоизлияний в ее различных зонах. Фиксацию материала проводили в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заключали в парафин и готовили срезы толщиной 5-6 мкм (Волкова О. В., Елецкий Ю. К., 1987). Для изучения общей морфологической картины и дифференцировки соединительной и гладкомышечнои тканей применяли окраску по методу ван Гизона (Пирс Э., 1962; Лилли Р., 1969). Для изучения образцов органа в просвечивающем режиме электронного микроскопа их фиксировали в 1%-ном растворе Os04 на фосфатном буфере (рН=7.4) (Millonig G., 1961), дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон (Уикли Б., 1975; Миронов А. А. и др., 1994). Полимеризовали при комнатной температуре, затем в термостате при 60 С.
Из образцов плацентарной и межплацентарной зон матки каждого животного изготавливали по 5 блоков. Полутонкие срезы толщиной около 1 мкм получали на ультратоме LKB 8800, для ориентации на блоке и светооп-тического исследования окрашивали их 1%-ным раствором толуидинового синего в 1%-ном растворе буры при температуре 74 С (Шкурупий В. А. и др., 1984). Из этих же блоков на ультратоме LKB 8800 готовили ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм и контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата (Уикли Б., 1975) и цитратом свинца (Retinoids Е. S., 1963). Затем их напыляли углеродом путем его испарения в вакууме и изучали в электронном микроскопе JEM-1010 S. 2.4. Метод морфометрии Для объективной оценки изменений, происходящих в миоцитах во время беременности и период послеродовой инволюции, был проведен мор-фометрический анализ. В его основу были положены рекомендации и принципы, изложенные в работах отечественных и зарубежных исследователей (Автандилов Г. Г., 1980, Непомнящих Л. М. и др., 1984, Лейсли А., 1992). Используя открытую тестовую систему, состоящую из 289 регулярно расположенных точек, на парафиновых срезах миометрия при конечном увеличении в 630 раз подсчитывали объемную плотность миоцитов и интерсти-циального пространства как соотношение точек, попавших на исследуемые структуры, к общему числу точек, попавших на миометрий. В составе интер стициального пространства выделяли бесструктурную и волокнистую соединительную ткань, кровеносные сосуды и «интерстициальные вакуоли». В связи с тем, что часть миоцитов содержала внутриклеточные вакуоли, определяли объемную плотность "вакуолизированных" и неизмененных клеток.
В каждом сроке эксперимента в анализ брали не менее 70 полей зрения, результаты выражали в процентах. Поскольку миоциты миометрия во все исследованные промежутки времени имели неодинаковое строение и находились в различных функциональных состояниях, выделили 5 типов ГМК (подробное описание каждого типа представлено в главе «III. Результаты исследования и их обсуждение»). Подсчитывали их соотношение на срезах в каждом сроке для каждой зоны (плацентарной и межплацентарной). На каждую точку было проанализировано 50-70 полей зрения; в каждом поле изучали от 65 до 120 клеток в зависимости от их размеров. Общую объемную плотность миоцитов, находившихся на заключительных стадиях инволюции («интерстициальные конгломераты»), подсчитывали при помощи открытой тестовой системы из 64 точек при конечном увеличении хбЗО. Размеры миоцитов 1 типа и их ядер определяли, используя тестовую решетку из 289 точек и конечное увеличение в 630 раз, как среднее число тестовых точек, приходящихся на одну клетку и на одно ядро соответственно. При этом увеличении одна тестовая точка соответствовала площади 24,1 мкм2. Ядерно-цитоплазматические отношения в миоцитах вычисляли по методу Глаголева А. А. (1941) как отношение числа точек, приходящихся на ядра, к числу точек, попавших на цитоплазму клеток. При этом использовали вышеупомянутую тестовую решетку из 289 точек и конечное увеличение в 630 раз.
Численную плотность клеток, участвующих в развитии воспалительных реакций организма (нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов), а также апоптозных телец определяли в поле зрения при конечном увеличении в 630 раз (что соответствует площади 0,0097 мм ), затем производили пересчет на 1 мм среза миометрия. На каждый исследованный срок в анализ брали не менее 70 таких полей зрения. Для электронномикроскопического изучения миоциты и эндотелиоци-ты кровеносных и лимфатических капилляров миометрия фотографировали при увеличении в 3000 раз. Со срезов образцов тканей животного одной группы изучали не менее 30 гладко мышечных клеток. Фотографии с негативов печатали при увеличении в 8 000-12 000 раз. Полученный цифровой материал подвергали статистической обработке с помощью стандартных формул программы Microsoft Excel 98. Результаты выражали в виде X ± sx, где X - среднеарифметическое значение, sx - стан-дартная ошибка среднего. Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин определяли на основании критерия Стьюдента (Петри А., Сэбин К., 2003). Различия между средними величинами считали достоверными при уровне значимости р 0,05. Существующую вероятность достоверности различий обозначали в тексте, таблицах и на графиках следующи г ми символами
Метод морфометрии
При светооптическом исследовании миометрия было установлено, что миоциты неоднородны по своим морфологическим проявлениям и, вероятно, находятся в различных функциональных состояниях. Изучив морфологические и ультраструктурные особенности различных типов миоцитов, а также приняв во внимание данные литературы, предложили следующую морфо-функциональную классификацию для групп гладкомышечных клеток (рис. 1): Клетками 1-го типа считали миоциты с ядрами, содержащими большое количество диффузного хроматина, и неизмененной структурой цитоплазмы. Они представляют собой наиболее распространенный вид миоцитов. Приняли, что это дифференцированные, активно функционирующие ГМК. Клетки 2-го типа имели в ядре большое количество компактного хроматина и неизмененную цитоплазму. Возможно, эта группа представляет собой пул покоящихся клеток. Клетки 3-го типа независимо от состояния ядра содержали в цитоплазме многочисленные светлые вакуоли. По данным Авцына А. П. и Шахламова В. А. (1979) усиленное везикулообразование, формирование цитоплазма-тических отростков и инвагинаций плазмалеммы, а также клазмацитоз являются характерными структурными проявлениями нарушенной проницаемости плазматической мембраны или механизмов трансмембранного транспорта.
В частности, клазмацитоз - отделение части цитоплазмы наружу, которая затем отшнуровывается от клетки и реутилизируется в межклеточной среде, может быть вызван гипоксией (Inouye S. et al., 1983). Возможно, появление в цитоплазме ГМК многочисленных вакуолей, обнаруживаемых даже на светооптическом уровне, свидетельствует о развитии гидропической (вакуольной) дистрофии, связанной с нарушением содержания воды в клетке. Ее причиной могут также являться гипоксия, хо лодовые и тепловые повреждения, недостаточное питание клеток. При этом предлагаются различные механизмы образования вакуолей: поступление в клетку воды и уменьшение в ней содержания белков; нарушение выделения воды, выделяющейся в ходе биохимических реакций в клетке, из-за нехватки АТФ; нарушение процессов ионного обмена через плазматическую мембрану (Авцын А. П. и Шахламов В. А., 1979).
Для клеток 4-го типа были характерны небольшие размеры, гиперхром-ные ядра серповидной формы, оттесненные на периферию, и светлая цитоплазма, напоминающая крупную одиночную внутриклеточную вакуоль. Приведенные морфологические особенности ГМК соответствуют крайнему выражению гидропической дистрофии — баллонной дистрофии, при которой клетка превращается в огромную вакуоль, заполненную жидкостью. При этом отмечали пикноз или лизис ядра, а при электронномикро-скопическом исследовании обнаруживали полную деструкцию органелл. По существу баллонная дистрофия является выражением фокального колли квационн ого некроза клетки (Струков А. И., Серов В. В., 1985). Клетки 5-го типа имели округлую форму, мелкие размеры, гиперхромные ядра, окруженные ободком светлой цитоплазмы, и были похожи по строению на малые лимфоциты. С функциональных позиций они, вероятно, представляют собой одну из стадий апоптоза - апоптозные тельца (AT). Кроме того, клетки 4 и 5 типов зачастую образовывали четко отграниченные группы («интерстициальные конгломераты») между пучками миоцитов 1, 2 и 3 типа (рис. 2). Все вышеперечисленные виды ГМК в различном соотношении представлены в миометрии всех групп исследованных, включая контрольных (небеременных), животных. Как было отмечено в главе «Материалы и методы исследования», для оценки происходящих в миометрии процессов прослеживали динамику изменения представительства каждого типа миоцитов во время беременности и в ранний послеродовый период.
