Содержание к диссертации
Введение
II. Обзорлиературы
II.1. Строение эндокринной части поджелудочной железы. 11
II.2. Иннервация поджелудочной железы. 16
II.2.1. Общие сведения 16
II.2.2. Структура нейроэндокринных комплексов поджелудочной железы 19
II.З. Эмбриональное развитие поджелудочной железы млекопитающих. 22
II.3.1. Развитие эндокринной части поджелудочной железы млекопитающих. 22 ~
II.3.2. Экспрессия факторов транскрипции при развитии эндокринной части поджелудочной железы млекопитающих. 29
II.3.3. Развитие нервного аппарата поджелудочной железы млекопитающих. 32
II.4. Развитие поджелудочной железы человека 35
II.4.1. Развитие эндокринной части поджелудочной железы человека 35
II.4.2. Развитие нервного аппарата поджелудочной железы человека 40 "' '-
II.5. Заключение. 42
III. Материалы и методы
Ш.1. Характеристика материала 45
III.2. Методы исследования. 46
III.2.1. Методы гистологического исследования 46
III.2.2. Методы иммуногистохимического исследования 47
III.2.3. Методы микроскопического исследования гистологических и иммуногистохимических препаратов. 49
IV. Результаты
IV.1. Иммуногистохимическое исследование развития эндокринной частипожелудочнойжелезы человека 62
IV. 1.1. Гистологическая структура поджелудочной железы плодов человека. 62
IV.1.2 . Экспрессия инсулина и глюкагони в поджелудочной железе плодов человека... 66
IV.1.3. Экспрессия белков нервной системы в эндокринных клетках при развитии поджелудочной железы человека. 75
IV.2. Развитие нервного аппарата поджелудочной железы человека 84
IV.2.1. Эксперессия SNAP-25, NCAM, периферина и нейрон-специфического р-Штубулина в структурах нервного аппарата поджелудочной железы взрослого человека. 84
IV.2.2. Эксперессия SNAP-25, NCAM, периферина и нейрон-специфического р-Штубулина в структурах нервного аппарата при развитии поджелудочной железы человека. 88
IV.2.3. Нервный аппарат панкреатических островков при развитии поджелудочной железы человека. 100
IV.3. Сравнение организации эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы человека, нутрии и монгольской песчанки 104
IV.3.1. Распределение эндокринных клеток в поджелудочной железе. 104
IV.3.2. Экспрессия белков нервной системы в эндокринных клетках поджелудочной железы 108
IV.3.3. Сравнение нервного аппарата поджелудочной железы и панкреатических островков у человека, нутрии и монгольской песчанки. 111
V. Обсуждение
V.I. Развитие эндокринной части поджелудочной железы человека 120
V.2. Экспрессия нейральных белков в эндокринных клетках поджелудочной железы. 125
V.2.I. Экспрессия SNAP-25 в эндокринных клетках поджелудочной железы 126
V.2.2. Экспрессия NACM в эндокринных клетках поджелудочной железы. 129
V.2.3. Экспрессия нейрон-специфического р-Ш тубулина в эндокринных клетках поддіселудочной железы. 132
VЗ. Нервный аппарат поджелудочной железы. 134
V.З.І.Нервньїй аппарат поджелудочной железы человека. 134
V.3.2. Развитиенервного аппарата поджелудочной железы человека 136
V.3.3. Организация нейроэндокринных комплексов. 140
VI. Выводы. 144
VII. Литература 146
- Общие сведения
- Развитие нервного аппарата поджелудочной железы млекопитающих.
- Методы иммуногистохимического исследования
- . Экспрессия инсулина и глюкагони в поджелудочной железе плодов человека...
Введение к работе
Актуальность темы
Сахарный диабет первого типа - одно из самых распространенных аутоиммунных заболеваний, приводящее к нарушениям эндокринной функции поджелудочной железы вследствие гибели инсулин-продуцирующих р-клеток (Злобина Е.Н., Дедов И.И., 1993; Один В.И., 2003; Балаболкин М.И. и соавт., 2005; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2007; Подгребельный А.Н. и соавт., 2007; Петеркова, В.А., Лаптев Д.Н., 2009). Самым эффективным современным методом коррекции углеводного обмена у больных сахарным диабетом первого типа является заместительная инсулинотерапия. Однако в настоящее время ведутся активные разработки методов трансплантации р-клеток для восстановления метаболизма у больных сахарным диабетом (Петеркова, В.А., Лаптев Д.Н., 2009). В связи с чем большое число работ посвящено строению, особенностям физиологии, а также механизмам дифференцировки р-клеток поджелудочной железы. Несмотря на большой объем накопленных данных, ряд вопросов остаются малоизученными.
Гистологические и иммуногистохимические данные свидетельствуют о том, что в поджелудочной железе млекопитающих эндокринные клетки панкреатических островков (островков Лангерганса) и структуры нервной системы (нервные волокна, тела нейронов, глиальные клетки) объединены в сложноорганизованные комплексы, которые были названы нейроинсулярными (Persson-Sjogren S. et al., 2001; Sunami E. et al., 2001). В нейроинсулярных комплексах I типа эндокринные клетки панкреатических островков интегрированы с телами нейронов и нервными волокнами, в нейроинсулярных комплексах II типа тела нейронов отсутствуют. Функциональная роль нейроинсулярных комплексов не ясна (Persson-Sjogren S. et al., 2001).
Другой интересной особенностью эндокринных клеток является их сходство по ряду биохимических и физиологических характеристик с нейронами. Известно, что в р-клетках панкреатических островков экспрессируется ряд белков, характерных для нервной системы: S-100, GFAP (glial fibrillary acidic
protein), GAD {glutamic acid decarboxylase), TH {tyrosin hydroxylase), NPY {neuropeptide Y), NSE {neuron specific enolase) и др. (Von Dorsche H.H. et al., 1989; Kim, J. et al., 1993; Teitelman G. et al., 1993; Tsui H. et al., 2003; Winer S. et al., 2003). Кроме того, при дифференцировке эндокринных клеток поджелудочной железы экспрессируется ряд факторов транскрипции, характерных для нервной системы - Ngn3 (neurogenin3), BETA2/NEUROD и др.
Во второй половине XX века разрабатывались разнообразные концепции, согласно которым сходство и интеграция нервных и эндокринных клеток в поджелудочной железе объяснялось их происхождением из одного эмбрионального зачатка - нейроэктодермы (Fujita Т., 1976; Pearse A.G.E., 1976). Однако нейроэктодермальное происхождение эндокринных клеток было опровергнуто в ряде экспериментов с использованием химерных зародышей, а также по культивированию зачатка поджелудочной железы in vitro (Slack J.M., 1995). Для понимания причин сходства и интеграции эндокринных клеток поджелудочной железы с нейронами необходимы детальные сведения об организации и морфогенезе нейроэндокринного аппарата у млекопитающих. Работы, направленные на изучение этого вопроса малочисленны и выполнены преимущественно с использованием экспериментальных животных. Данные о строении и развитии нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека единичные, поэтому проведение исследований в этой области представляется актуальным.
Необходимость изучения нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека и его морфогенеза обусловлена также существованием нейральной модели развития сахарного диабета 1-го типа. На NOD-мышах {nonobese diabetic mice) было показано, что нервный аппарат панкреатических островков является первой мишенью аутоиммунной атаки (Saravia F. and Homo-Delarche F., 2003; Tsui H. et al., 2003; Razavi R. et al., 2006). Развитие аутоиммунной реакции на Р-клетки происходит из-за их сходства по ряду экспрессируемых белков с нейронами.
Вопрос об участии структур нервной системы в патогенезе сахарного диабета 1-го типа у человека не решен. Известно, что организация эндокринной части (Brissova М. et. al., 2005; Cabrera О. et al., 2006) и, возможно, нервного аппарата поджелудочной железы человека и мышей могут значительно различаться. Поэтому необходимы сведения о строении нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека. Важное значение имеет также выявление в эндокринных клетках поджелудочной железы нейральных белков, которые могут являться мишенями для развития аутоиммунной атаки.
Цель исследования - изучение морфогенеза нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека в пре- и постнатальном онтогенезе.
Задачи исследования
Иммуногистохимическое исследование эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы у взрослого человека, нутрии и монгольской песчанки с использованием комплекса маркеров (антител к гормонам эндокринных клеток поджелудочной железы - инсулину и глюкагону и белкам нервной системы - SNAP-25, NCAM, нейрон-специфическому р-Ш тубулину и периферину);
Сравнение морфологической организации нейроэндокринных комплексов у взрослого человека, нутрии и монгольской песчанки;
Иммуногистохимическое выявление нейральных белков (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфического Р-Ш тубулина и периферина) в эндокринных клетках поджелудочной железы человека (взрослые, плоды), нутрии и монгольской песчанки;
Изучение морфогенеза панкреатических островков у плодов человека с 8-й по 40-ю недели развития с использованием гистологических и иммуногистохимических (маркирование антителами к инсулину и глюкагону) методов;
Исследование закономерностей формообразования нервного аппарата поджелудочной железы человека в плодный период (с 8-й по 40-ю недели развития) на препаратах, маркированных антителами к белкам нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфическому (3-Ш тубулину и периферину);
Анализ организации нейроэндокринных взаимодействий на разных сроках развития поджелудочной железы человека.
Положения, выносимые на защиту
Обнаружены межвидовые отличия в структуре эндокринной части поджелудочной железы, которые выражаются в формах ее организации (панкреатические островки, одиночные эндокринные клетки или небольшие их кластеры), цитоархитектонике панкреатических островков и соотношении Р- и а-клеток.
Выявлено, что организация нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы различается между исследованными видами по распределению и антигенному составу нервных волокон в нейроэндокринных комплексах, присутствию нейроэндокринных комплексов I типа, наличию взаимодействий между структурами нервного аппарата и отдельными эндокринными клетками.
Установлено, что в эндокринных клетках поджелудочной железы экспрессируются белки, характерные для нервной системы (SNAP-25, NCAM и нейрон-специфический Р-Ш тубулин).
Найдена смена форм организации эндокринной части поджелудочной железы человека в онтогенезе (внешний эпителий, панкреатические островки плащевого типа, панкреатические островки мозаичного типа), а также изменение соотношения р- и а-клеток.
Обнаружены онтогенетические изменения организации нервного аппарата поджелудочной железы человека. В плодный период нервные волокна и нервные ганглии более выражены и располагаются в ткани
железы плотнее, чем у взрослых. В поджелудочной железе плодов представлены нейроэндокринные комплексы I и II типа. У взрослого человека выявляются лишь единичные нейроэндокринные комплексы II типа.
Научная новизна
В проведенном исследовании выполнен комплексный иммуногистохимический анализ строения и развития эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы человека. При дифференцировке эндокринной части поджелудочной железы человека обнаружено изменение соотношения а- и р-клеток: на 8-10-й неделе преобладают Р-клетки, с 11-й по 18-ю недели наблюдается примерно одинаковое соотношение а- и р-клеток, с 18-й по 32-ю недели преобладают а-клетки, после 34-й недели преобладают Р-клетки. В онтогенезе поджелудочной железы человека выявлено изменение типов организации ее эндокринной части - от внешнего эпителия у ранних плодов (8-Ю недель) к островкам плащевого типа у плодов с 12-й по 32-ю недели развития и мозаичным островкам у плодов более поздних сроков развития, детей, взрослых. Полученные данные свидетельствую о том, что морфогенез панкреатических островков продолжается, по крайней мере, до 34-й недели.
В эндокринных клетках поджелудочной железы человека обнаружена иммунопозитивная реакция на белки, характерные для нервной системы (SNAP-25, NCAM и нейрон-специфический р-Ш тубулин). Наличие экспрессии SNAP-25 и нейрон-специфического Р-Ш тубулина в эндокринных клетках поджелудочной железы человека описано впервые. Проведено исследование экспрессии всех трех нейромаркеров в пренатальном онтогенезе поджелудочной железе человека. Нейрон-специфический р-Ш тубулин и NCAM обнаружены в эндокринных клетках 14-ти недельных плодов и на всех последующих сроках развития; SNAP-25 - начиная с 16-й недели развития.
Анализ нервного аппарата поджелудочной железы человека впервые выполнен с использованием комплекса маркеров, как структурных (NCAM, нейрон-специфический Р-Ш тубулин и периферии), так и функциональных (SNAP-25), что позволило предложить детальное описание организации нервного аппарата поджелудочной железы у взрослого человека и его развития в плодный период (с 8-й по 40-ю недели).
Проведено сравнение организации эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы человека с двумя видами млекопитающих. Между исследованными видами обнаружены отличия в цитоархитектонике панкреатических островков, плотности распределения структур нервного аппарата и строении нейроэндокринных комплексов.
Научно-практическая значимость
В проведенном исследовании обнаружена экспрессия ряда нейральных белков в эндокринных клетках поджелудочной железы человека, что подтверждает сходство эндокринных клеток с нейронами. Согласно нейральной модели развития сахарного диабета 1-го типа выявленные антигены (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфический В-ІІІ тубулин) могут являться мишенями для развития аутоиммунной реакции на р-клетки. Полученные данные могут служить основой для выявления аутоантител к SNAP-25, NCAM и нейрон-специфическому Р-Ш тубулину, с целью выяснения их роли в развитии сахарного диабета первого типа.
В результате исследования установлено, что нервный аппарат панкреатических островков человека отличается от других видов млекопитающих. Для взрослых характерно отсутствие нейроэндокринных комплексов первого типа; нейроэндокринные комплексы второго типа встречаются редко, в их составе выявляются лишь единичные нервные волокна. Эти различия необходимо учитывать при оценке роли нервного аппарата поджелудочной железы в патогенезе сахарного диабета 1-го типа у человека.
Полученные в результате работы данные представляют собой детальное описание формирования эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы человека в плодный период (с 8-й по 40-ю недели развития), которые подтверждают и значительно дополняют имеющиеся к настоящему моменту сведения.
Результаты диссертационного исследования «Морфогенез нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека» используются при чтении курса «физиология человека и животных» на практических занятиях на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы
Основные результаты исследования доложены и обсуждены на научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2008); IX конгрессе международной ассоциации морфологов (Бухара, 2008); международной гистологической конференции (Тюмень, 2008), межлабораторной конференции в НИИ морфологии человека РАМН (декабрь, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Общие сведения
Поджелудочная железа иннервируется волокнами симпатической и парасимпатической нервной системы (Ahren В., 2000; Gilon P. and Henquin J.-С, 2001). Большинство нервных волокон входят в поджелудочную железу вдоль сосудов. Внутри железы можно наблюдать нервные ганглии и пучки нервных волокон, которые идут отдельно или сопровождают сосуды. Нервные окончания были обнаружены на ацинарных клетках, клетках протоков и на эндокринных клетках панкреатических островков.
Тела нейронов парасимпатической системы, образующих преганглионарные нервные волокна, лежат в дорсальном моторном ядре блуждающего нерва (n.vagus X) и в двойном ядре (nucleus ambiquus) (Berthoud H.R. and Powly T.L., 1991; Chen X.H. et al., 1996; Kirsteen N. et al., 2005). Оба этих центра находятся под контролем гипоталамуса. Преганглионарные парасимпатические волокна направляются к поджелудочной железе в составе ветвей (чревной, печеночной и желудочной) блуждающего нерва (п. vagus X). В поджелудочной железе эти волокна оканчиваются на телах парасимпатических нейронов, лежащих во внутрипанкреатических ганглиях.
Преганглионарные парасимпатические волокна выделяют ацетилхолин (Ach), который связывается с никотиновыми рецепторами на мембране постганглионарных нейронов. Постганглионарные парасимпатические волокна выделяют несколько нейромедиаторов: Ach (ацетилхолин), NO (nitric oxide) и нейропептиды: VIP (vasoactive intestitinal polypeptide), GRP (gastrin-releasing peptide), PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide) (Love J.A. and Szebeni K., 1999; Ahren В., 2000; Myojin Т., 2000). Тела нейронов, образующих преганглионарные симпатические нервные волокна, локализованы в грудном и верхнем поясничном сегментах спинного мозга (Furuzawa Y., Ohmori Y. and Watanabe Т., 1996). Миелинизированные аксоны этих клеток выходят через вентральные корешки спинного мозга и направляются к паравертебральной симпатической цепочке. Преганглионарные симпатические волокна или оканчиваются на телах ганглионарных нейронов, лежащих в ганглиях паравертебральной симпатической цепочки, или проходят сквозь эту цепочку в составе п. splanchicus к чревному (celiac) и брызжеечному (mesenteric) ганглиям, и оканчиваются на нейронах, локализованных в этих ганглиях. Постганглионарные нервные волокна идут к поджелудочной железе (Ahren В., 2000; Gilon P. and Henquin J.-C, 2001). Также отмечалось наличие симпатических ганглиев в самой поджелудочной железе.
Преганглионарные волокна симпатической системы выделяют Ach. Постганглионарные волокна выделяют норадреналин, а также нейропептиды: норэпинефрин, гланин и NPY (neuropeptide Y) (Ahren В., 2000; Myojin Т. et al., 2000).
Парасимпатические и симпатические нервные окончания выявлены в панкреатических островках и принимают участие в регуляции эндокринной функции поджелудочной железы (Ahren В. et al., 1990; Sundler F. and Bottcher G.,1991; Brunicardi F.C., D.M. and Andersen D.K., 1995). Общий парасимпатичекий эффект выражается в увеличении секреции инсулина. Однако, этот эффект является результатом суммарного воздействия ряда медиаторов, выделяемых постганглионарными парасимпатическими волокнами. Кроме того, стимуляция блуждающего нерва (п. vagus) приводит к возрастанию секреции глюкагона и панкреатического полипептида (Ahren В., 2000; Gilon P. and Henquin J.-C, 2001). Общий симпатический эффект выражается в снижении концентрации инсулина в плазме (за счет повышения концентрации катехоламинов, которые ингибируют секрецию инсулина). Кроме того, стимуляция п. splanchicus приводит к возрастанию секреции глюкагона и снижению секреции соматостатина (Ahren В., 2000; Gilon P. and HenquinJ.-C.,2001).
Помимо симпатических и парасимпатических нервных волокон в панкреатических островках присутствуют окончания сенсорных нервных волокон (Bmnicardi F.C., Shavelle D.M. and Andersen D.K., 1995; Ahren В., 2000; Gilon P. and Henquin J.-C, 2001). Нейромедиаторами в сенсорных нервных волокнах служат CGRP (calcitonin gene-related peptide) и SP (substance P). Пучки сенсорных нервных волокон выходят из поджелудочной железы в составе симпатических нервов (n.splanchnicus). Тела сенсорных нейронов локализованы в ганглиях дорсальных корешков спинного мозга преимущественно на уровне нижних грудных сегментов (Furuzawa Y., Ohmori Y. and Watanabe Т., 1996; Won M.H. et al., 1998). Сенсорные нервы также вовлечены в регуляцию секреции гормонов эндокринными клетками поджелудочной железы. При химическом разрушении сенсорных нервов (обработка капсаицином) у мышей наблюдается увеличение секреции инсулина в ответ на глюкозу по сравнению с контролем. Следовательно, сенсорные волокна могут оказывать ингибирующее действие на секрецию инсулина (Karlsson S. Et al., 1994).
В поджелудочной железе, и в панкреатических островках в частности, иммуногистохимически выявляются нервные волокна, выделяющие такие нейромедиаторы как холицистокинин (ССК), 5-гидрокситриптамин (5-НТ или серотонин), метионин-энкефалин. Эти нейромедиаторы могут также влиять на уровень секреции инсулина: ССК стимулирует выделение инсулина, в то время как эффект серотонина и метионин-энкефалина зависит от концентрации медиатора (Karlsson S. and Ahren В., 1992; Peschke Е. et al., 1997).
Развитие нервного аппарата поджелудочной железы млекопитающих.
Миграция клеток нервного гребня происходит на ранних сроках развития (Kasemeier-Kulesa J.C., Kulesa P.M. and Lefcort F., 2005). Как показывают иммуногистохимические данные, в развивающемся зачатке поджелудочной железы мыши клетки, иммунореактивные к VMAT (vesicular monoamine transporter; маркер симпатических нейронов) и CGRP (маркер сенсорных нейронов), появляются на 12,5 ЭД (Burris R. and Hebrok М., 2007). Эти клетки локализованы на периферии железы, что свидетельствует о начальной стадии их миграции в поджелудочную железу на 12,5 ЭД. Сенсорные нервные волокна, иммунореактивные к CGRP, с 15,5 ЭД были хорошо развиты; VMAT-иммунореактивные нервные волокна в эмбриональной поджелудочной железе не выявляются (Burris R. and Hebrok М., 2007). Развитие нервного аппарата панкреатических островков у мышей происходит в первые недели после рождения. У новорожденных мышей эндокринная часть поджелудочной железы представлена отдельными клетками или кластерами. Среди эндокринных клеток встречаются VMAT-позитивные нейроны. Формирование типичной цитоархитектуры островков происходит в первые несколько недель после рождения. VMAT-позитивные симпатические нервные волокна и CGRP-позитивные сенсорные нервные волокна появляются в формирующихся островках уже на первой неделе после рождения, до того, как панкреатические островки окончательно сформированы. К концу второй недели жизни нервные волокна локализованы преимущественно на периферии островков, нервный аппарат панкреатических островков сходный с взрослыми особями (Burris R. and Hebrok М., 2007).
Интересные данные получены в экспериментах по иннервации панкреатических островков после химической деструкции (3-клеток. При постепенном разрушении (3-клеток и начале гипергликемии реакция на VMAT в поджелудочной железе становиться иммунонегативной. При регенерации р-клеток и восстановлении нормального уровня глюкозы, наблюдалось постепенное появление VMAT-иммунореактивных нервных волокон сначала в периваскулярных сплетениях, а затем на периферии панкреатических островков. То есть, деструкция р-клеток сопровождалась нарушениями симпатической иннервации поджелудочной железы. При этом, у животных с разрушенными Р-клетками иннервация поджелудочной железы CGRP-позитивными сенсорными волокнами была такой же как в контроле (Burris R. and Hebrok М., 2007).
Сходные данные по развитию нервного аппарата панкреатических островков в постнатальный период (первые 7-10 дней) были ранее получены с помощью гистохимических методов для монгольской песчанки (Thomas N.W. and Findlay J.A., 1978) и золотистого хомяка (Gegrell L., 1975). У монгольской песчанки развитие сети нервных волокон на периферии островков и внутри них происходит уже в постнатальный период. Островки новорожденных состоят из небольших групп клеток с гранулами, близко ассоциированных с системой протоков; никаких нервов гистохимически и на электронномикроскопическом уровне в этот период не выявляется. С 7 дня после рождения появляются нервы на периферии островков и внутри тех островков, в которых уже началась васкуляризация. Врастание капилляров и нервов в островки практически полностью завершается спустя 2 недели после рождения (Thomas and Findlay, 1978).
Формирование глиальной оболочки вокруг панкреатических островков у мышей также происходит в постнатальный период. Первые GFAP-позитивные клетки выявляются на периферии островков на 6-й день после рождения. Однако, периферическая глиальная оболочка, сходная с взрослыми животными, формируется на 2-ой неделе жизни (Burris R. and Hebrok М., 2007). Химическая деструкция Р-клеток приводит лишь к уменьшению числа GFAP-позитивных глиальных клеток, а не к полному их отсутствию, как в случае с симпатическими нервными волокнами (Burris R. and Hebrok М., 2007).
Данные по развитию нервного аппарата панкреатических островков немногочисленны. По-видимому, врастание нервных волокон в островки в постнатальный период является характерным для грызунов. Появление симпатических нервных волокон до формирования панкреатических островков, а также нарушение симпатической иннервации при деструкции р-клеток, свидетельствует о возможной необходимости структур нервного аппарата для формирования нормальной структуры островков. Тем не менее, многие вопросы, в том числе и механизм образования нейроинсулярных комплексов, остаются не исследованными. II.4.
У эмбрионов человека дорсальный вырост кишечника начинает формироваться с 26 дня после оплодотворения, несколько раньше вентрального, впоследствии он разрастается. Вентральное выпячивание поворачивается вместе с кишечником и сближается с дорсальным. Срастание двух зачатков поджелудочной железы происходит у человека к концу эмбрионального периода (56 день развития). В этот период поджелудочная железа состоит из простых столбчатых эпителиальных клеток, расположенных в мезенхимной строме. Разветвление эпителия поджелудочной железы с образованием групп клеток, объединенных системой протоков, начинается в ранний плодный период (Piper К. et al., 2004; Милованов А.П., Савельев СВ., 2006; Стрижаков А.Н., Игнатко И.В., Фрязинова Е.М., 2008; Jeon J. et al., 2009).
Как показано в иммуногистохимических исследованиях, дифференцировка четырех типов эндокринных клеток в зачатке железы человека начинается неодновременно. Данные о времени появления различных типов эндокринных клеток в зачатке поджелудочной железы несколько отличаются. По данным Piper К. и соавт. на 52 день развития (7 недель) выявляются единичные инсулин-позитивные клетки; глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид на этом сроке не выявляются (Piper К. et al., 2004). Спустя неделю, на 8-8,5 неделе развития, в зачатке поджелудочной железы обнаруживаются инсулин-, глюкагон- и соматостатин-позитивные клетки. Клетки, иммунореактивные к панкреатическому полипептиду, появляются только на 9-10-й неделе развития (Polak М. et al., 2000; Piper К. et al., 2004). В другом иммуногистохимическом исследовании первые инсулин-позитивные клетки выявлены на 8-й неделе развития, глюкагон-позитивные - на 9-й неделе развития, соматостатин-позитивные - на 10-й неделе развития (Jeon J. et al., 2009). Клетки, содержащие панкреатический полипептид обнаружены этими авторами только на 17-й неделе развития (Jeon J. et al., 2009). Несмотря на описанные различия во времени начала дифференцировки эндокринных клеток, которые могут быть объяснены разницей в использованных антителах или индивидуальной изменчивостью, последовательность появления четырех типов эндокринных клеток одинаковая. Первыми выявляются р-клетки, затем а-клетки, 8-клетки и, в последнюю очередь — РР-клетки (Polak М. et al., 2000; Piper К. et al., 2004; Jeon J. et al., 2009). Ha ранних сроках развития (с 8-й по 11-ю недели) в поджелудочной железе человека преобладают Р-клетки (Piper К. et al., 2004; Jeon J. et al., 2009).
В эндокринных клетках развивающейся поджелудочной железы человека, по крайней мере, с 7-й по 21-ю недели развития, наблюдается коэкспрессия нескольких гормонов. Большинство авторов отмечают, что таких клеток очень мало (Piper К. et al., 2004; Jeon J. et al., 2009). Локализация клеток, коэкспрессирующих несколько гормонов, в небольших кластерах может свидетельствовать о том, что они присутствуют в новообразующихся островках (Jeon J. et al., 2009).
Методы иммуногистохимического исследования
При проведении иммуногистохимических реакций депарафинированные, гидратированные срезы обрабатывали 3%-м раствором Н2О2 для блокировки эндогенной пероксидазы. В работе использовали антитела к гормонам эндокринных клеток поджелудочной железы (инсулину, глюкагону) и некоторым антигенам нервной системы (SNAP-25, NCAM, периферии, нейрон-специфический р-Ш тубулин). Характеристика примененных в работе антител и условия проведения реакций указаны в табл 3.
Негативным контролем служили реакции с .заменой первых антител раствором для разведения антител "Dako diluent" ("Dako"). Во всех случаях в негативном контроле неспецифическая реакция отсутствовала (рис. 1). Позитивным контролем во всех случаях служили реакции на образцах поджелудочной железы плодов человека поздних сроков развития (30-40 нед.) или на образцах поджелудочной железы детей и взрослых людей (рис. 2,3). В табл. 4 приведены данные о реактивности примененных в работе антител на парафиновых срезах поджелудочной железы человека (взрослые, плоды), нутрии и монгольской песчанки при фиксации материала формалином или жидкостью Буэна.
Иммуногистохимические реакции поставлены для всех исследованных образцов поджелудочной железы, кроме плодов человека №2, №3, №24 и №26, у которых на гистологических препаратах наблюдался аутолиз ткани железы. Для проведения иммуногистохимических реакций на поджелудочных железах плодов человека выбирали срезы из центральной области поджелудочной железы с максимальной площадью образца. В реакциях на инсулин и глюкагон использовали 8 серийных срезов, толщиной 10 мкм, из которых 1-ый, 2-ой, 5-ый и 6-ой маркировали антителами к инсулину, 3-ий, 4-ый, 7-ой и 8-ой — антителами к глюкагону. Для каждого из остальных исследуемых антигенов (SNAP-25, NCAM, периферии, нейрон-специфический Р-Ш тубулин) отбирали по 4 серийных среза.
Для проведения иммуногистохимических реакций на образцах поджелудочной железы взрослых людей, нутрии и монгольской песчанки выбирали по 2-4 среза с максимальной площадью образца на каждый антиген. Для исследования организации нейроэндокринных взаимодействий применяли методику двойного иммуногистохимического мечения на серийных срезах. В работе использованы две серии по 20 срезов (толщиной 10 мкм) поджелудочной железы нутрии, 2 серии по 10 срезов (толщиной 10 мкм) поджелудочной железы монгольской песчанки. Для каждого из видов одну серию срезов маркировали антителами к периферину и инсулину, другую — антителами к периферину и глюкагону. При проведении реакций на первом этапе проводили выявление периферина, согласно протоколу, описанному в табл. 3. В качестве хромогена использовали раствор DAB, содержащий 0,3% NiCb. На втором этапе в стандартной иммунопероксидазной реакции выявляли эндокринные клетки поджелудочной железы. На срезах поджелудочной железы нутрии в качестве первых антител использовали поликлональные антитела морской свинки к инсулину ("Dako", 1:150), мышиные моноклональные антитела к глюкагону ("Sigma", 1:1000), с которыми срезы инкубировали во влажной камере при температуре 8С 18-20 часов. Со вторыми антителами (HRP-anti guinea pig IgG, «Sigma», 1:400; HRP-F(ab )2 and mouse IgG, "Zymed", 1:1000) срезы инкубировали в течение 1 часа при температуре 37С. В качестве хромогена использовали раствор DAB без добавления NiCb. На срезах поджелудочной железы монгольской песчанки эндокринные клетки выявляли аналогичным способом с использованием в качестве первых антител мышиные моноклональные антитела к инсулину ("Sigma", 1:1000) и глюкагону ("Sigma", 1:1000), в качестве вторых антител (HRP-F(ab )2 anti mouse IgG, "Zymed", 1:1000).
Методы микроскопического исследования гистологических и иммуногистохимических препаратов. Все полученные препараты оценивали визуально с помощью микроскопа Leica DM2500. Видеозахват осуществляли с помощью камеры DFC290 и программы Image Scope М.
При просмотре гистологических препаратов описывали структуру поджелудочной железы всех образцов. Для плодов человека разных сроков развития отмечали степень зрелости экзокринной и эндокринной части, особенности их организации в зависимости от срока развития, характер кровоснабжения и иннервации, а также наличие или отсутствие патологий. Помимо этого на гистологических препаратах поджелудочной железы плодов человека с 14-ой по 40-ю недели развития измеряли диаметр панкреатических островков.
Измерение диаметра островков проводили в программе Image Scope М, с использованием функции «измеритель расстояний». Для измерений выбирали 10 срезов (толщина 10 мкм) из центральной области поджелудочной железы, каждый из которых находился на расстоянии 90 мкм от соседних срезов. На каждом из 10 срезов измеряли максимальный диаметр 10 панкреатических островков (всего по 100 островков для каждого образца). Данные вносили в таблицу в программе Microsoft Exel и вычисляли среднее значение для каждого плода.
При оценке иммуногистохимических препаратов отмечали наличие или отсутствие специфической иммунопозитивной реакции, распределение иммунореактивного материала в ткани железы, распределение иммунореактивного материала внутри клеток (ядерная или цитоплазматическая локализация). Для оценки динамики развития эндокринной части поджелудочной железы в программе Image Scope М вычисляли «коэффициент заполненности» (Кз) ткани железы Р-(КзР) и а-клетками (Кза). Этот параметр вычисляется программой автоматически и представляет собой отношение суммарной площади окрашенного материала в кадре к общей площади кадра.
На ранних сроках развития (8-12 недель) Кз вычисляли для каждой области, содержащей окрашенный материал, на всех срезах (4 среза на инсулин и 4 среза на глюкагон). Начиная с 14-ой недели развития выбирали по 10 произвольных областей на каждом из срезов (4 среза на инсулин и 4 среза на глюкагон). Для каждой области вычисляли Кз: по 40 значений Кз3 и 40 значений Кза для каждого образца. Данные вносили в таблицу Microsoft Exel и вычисляли среднее значение Кз3 и Кза для каждого образца.
Для оценки интенсивности реакции на белки нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфический Р-Ш тубулин) в эндокринных клетках на разных сроках развития поджелудочной железы человека ввели численные обозначения интенсивности: 0 - реакция иммунонегативная; 1 - иммунопозитивная реакция, интенсивность очень слабая; 2 - иммунопозитивная реакция, интенсивность реакции в эндокринных клетках несколько слабее, чем в структурах нервной системы; 3 - иммунопозитивная реакция, интенсивность реакции в эндокринных клетках такая же, как и в структурах нервной системы.
. Экспрессия инсулина и глюкагони в поджелудочной железе плодов человека...
Эндокринные клетки (р- и а-) выявляются в зачатке поджелудочной железы начиная с 8-й недели развития. У четырех 8-ми недельных плодов (№10, №18, №42, №43) и одного 9-ти недельного (№17) позитивная реакция на инсулин и глюкагон обнаружена в единичных эпителиальных клетках протоков в центральной области тела железы (рис. 6А, Б). Среднее значение коэффициента заполненности Р-клетками (КзР) составляет 0,004, а-клетками (Кза) - 0,001 (табл. 5), то есть на сроке 8-9 недель в зачатке поджелудочной железы преобладают р-клетки. На этом сроке р-клетки располагаются поодиночке или небольшими группами (рис. 6А); а-клетки располагаются преимущественно поодиночке (рис. 6Б).
В поджелудочной железе плодов №41 (8 недель) и №40 (9 недель) эндокринная часть поджелудочной железы была более дифференцирована, чем у остальных плодов тех же сроков развития. Эндокринные клетки у плодов №40 и №41 более многочисленны. Коэффициент заполненности Р-клетками (КзР) составляет 0,009 и 0,061, а-клетками (Кза) - 0,005 и 0,038 для плодов №40 и №41 соответственно (табл. 5). Кроме того, у этих плодов присутствуют крупные кластеры эндокринных клеток.
К 10-11-й (№15) неделе количество эндокринных клеток резко возрастает. Соотношение Р" и а-клеток изменяется (КзР=0,018, Кза=0,012) (табл. 5). Клетки, содержащие инсулин, располагаются поодиночке или образуют кластеры неправильной формы, которые локализованы преимущественно в центральной области тела поджелудочной железы (рис. 6В). Глюкагон-содержащие клетки располагаются преимущественно поодиночке (рис. 6Г). В головке поджелудочной железы на 10-11-й неделе выявлены только одиночные эндокринные клетки. К 12-ой неделе (№16) становится выраженной цитоархитектура кластеров: с центральным расположением р-клеток и периферическим - а-клеток (рис. 6Д, Е). Подобные кластеры присутствуют в центральной области тела, а также в головке развивающейся поджелудочной железы. В периферических областях развивающейся поджелудочной железы выявляются преимущественно одиночные эндокринные клетки и их небольшие кластеры.
На сроке 12 недель КзР составляет 0,037, Кза - 0,039, то есть количество Р- и а-клеток примерно одинаковое (табл. 5). Анализ смежных срезов показал, что на 12-й неделе развития в поджелудочной железе выявляются различные типы кластеров эндокринных клеток. Наиболее многочисленны кластеры в которых преобладают (3-клетки. Однако встречаются кластеры с равным соотношением р- и а-клеток, или с преобладанием а-клеток (рис. 6Д, Е). На 11-12-ой неделях развития кластеры эндокринных клеток тесно ассоциированы с формирующимися протоками поджелудочной железы.
У одного 12-ти недельного плода (№44) степень развития эндокринной части поджелудочной железы была значительно выше, чем у плода №16 (12 недель). Общее количество эндокринных клеток (Кзр=0,071, Кза=0,054) у плода №44 было высоким (табл. 5). Кроме того, в поджелудочной железе у этого плода выявлены крупные, хорошо развитые панкреатические островки. По количеству и степени развития эндокринной части поджелудочная железа плода №44 соответствовала не 12-ти, а 16-ти недельному возрасту (плоды №23 и №30).
Hal4-ой неделе развития (плоды №5, №12, №13) в поджелудочной железе эндокринные клетки образуют панкреатические островки или располагаются поодиночке и в небольших группах среди ацинусов. Как и на 12-ой неделе, панкреатические островки локализованы в центральной области железы, а одиночные эндокринные клетки и их небольшие группы - преимущественно на периферии. Внутри панкреатических островков Р-клетки располагаются в центре, а-клетки - на периферии. Среди панкреатических островков выявляются островки с преобладанием Р-клеток, с одинаковым соотношением Р и а-клеток и с преобладанием а-клеток. Среднее значение Кзр составляет 0,046, Кза - 0,060 (табл. 5), то есть в поджелудочной железе 14-ти недельных плодов преобладают а-клетки. Организация эндокринной части поджелудочной железы у 16-ти (№23, №30) и 17-ти (№6, №8) недельных плодов сходна с таковой 14-ти недельных плодов. На этих сроках в поджелудочной железе количество Р- и а-клеток либо одинаковое, либо а-клетки преобладают (табл. 5). В поджелудочных железах плодов №7 (17,5 нед.), №4 (17-18 нед.), №9 (18 нед.) позитивная реакция на инсулин и глюкагон отсутствовала, при наличии реакции в позитивных контролях.
Начиная с 18-й недели развития и по 32-ю неделю развития у всех исследованных плодов в поджелудочной железе преобладают а-клетки (табл. 5, рис. 8). На этих сроках в большинстве панкреатических островков соотношение 3- и а-клеток примерно одинаковое. Однако встречаются кластеры с преобладанием либо р , либо а-клеток (рис. 7А-Е). В панкреатических островках Р-клетки занимают центральное положение, а а-клетки образуют кольцо, часто незамкнутое, вокруг ядра из Р-клеток (рис. 7А-Е).
После 34-ой недели развития организация эндокринной части поджелудочной железы плодов сходна с взрослыми людьми. В поджелудочной железе всех плодов с 34-й по 40-ю недели развития преобладают Р-клетки (табл. 5, рис. 8). В большинстве панкреатических островков преобладают р-клетки. Однако также встречаются островки с одинаковым соотношением Р- и а-клеток или с преобладанием а-клеток (рис. 7Ж, 3). Как и на предыдущих сроках развития, в панкреатических островках р-клетки занимают центральное положение, а а-образуют кольцо на периферии (рис. 7Ж, 3) — панкреатические островки плащевого типа. Кроме того, после 34-ой недели развития в поджелудочной железе появляются островки с мозаичным распределением Р- и а-клеток (рис, 7 Ж, 3). В образцах поджелудочной железы детей (3 мес, 4г. 9 мес.) и взрослых людей (все случаи) выявляются преимущественно панкреатические островки с мозаичным распределением р и а-клеток (рис. 8). В большинстве островков преобладают р-клетки. Однако в поджелудочной железе детей присутствовали островки с примерно одинаковым соотношением Р- и а-клеток (рис. 8 А, Б).
Дифференцировка эндокринной части при развитии поджелудочной железы человека происходит неравномерно. С 8-й по 12-ю недели развития количество эндокринных клеток резко возрастает: КзР составляет 0,004 на 8-й неделе, 0, 037 на 12-й неделе; Кза составляет 0,001 на 8-й неделе, 0, 039 на 12-й неделе. На этих сроках изменяется и соотношение двух типов эндокринных клеток — на 8-9-й неделе в поджелудочной железе преобладают Р-клетки, с 12-й по 18-ю недели соотношение Р" и а-клеток одинаковое или а-клетки преобладают. Для всех плодов с 18-й по 32-ю недели развития характерно преобладание в поджелудочной железе а-клеток. На поздних сроках развития (34-40 недель) в поджелудочной железе преобладают р-клетки. Цитоархитектура панкреатических островков плодов человека и взрослых людей различная. В панкреатических островках поджелудочной железы плодов человека Р-клетки занимают центральное положение, а а-клетки периферическое (плащевые островки). Для взрослого человека характерно мозаичное распределение Р- и а-клеток в островках.
