Содержание к диссертации
Введение 3
Обзор литературы 7
I Организация внутренней защитной системы (ВЗС) моллюсков 7
Клеточные элементы гемолимфы моллюсков 7
Морфология гемоцитов 7
Двустворчатые моллюски (Bivalvia) 7
Брюхоногие моллюски (Gastropoda) 13
Функции гемоцитов 17
Изменения характеристик популяции клеток гемолимфы под воздействием различных факторов 24
Гуморальные факторы гемолимфы моллюсков 29
Пектины, вовлеченные в реализацию защитных реакций 29
Антибактериальные факторы 30
Цитотоксические факторы 31
Факторы «свертывания» плазмы 32
Цитокиноподобные медиаторы защитных реакций 32
Медиаторы стрессового ответа 34
II Иммунологические аспекты взаимоотношений в системе моллюск-партениты трематод 36
Специфичность в системе моллюск-трематода 37
Проблема резистентности и чувствительности моллюсков к заражению трематодами 42
Стратегии, используемые трематодами для воздействия на ВЗС моллюсков 48
Пассивные стратегии взаимодействия с ВЗС хозяина 49
Извращение защитных реакций хозяина 51
Модуляция активности ВЗС хозяина 52
Изменения характеристик популяции клеток гемолимфы хозяина 52
Изменение адгезионной способности клеток гемолимфы 54
Изменения фагоцитарной активности гемоцитов 55
Модуляция других проявлений функциональной активности гемоцитов 57
Механизмы воздействия СЭ-продуктов трематод на клетки гемолимфы моллюсков 57
Прямое воздействие 57
Воздействие, опосредованное через нейрогуморальную систему 58
Влияние заражения трематодами на активность гуморальных факторов ВЗС моллюска 60
Материалы и методы 64
Объекты исследования 64
Сбор и содержание моллюсков. Получение гемолимфы 65
Морфо-функциональная характеристика гемоцитов 66
Приготовление монослоев гемоцитов 66
Исследование морфологии гемоцитов 66
Цитохимические исследования 67
Мониторинг клеточного состава гемолимфы L. littorea 68
Исследование поверхностных маркеров гемоцитов L. littorea и M.edulis 68
Исследование пролиферативной активности и гистогенеза клеток гемолимфы L. Littorea 70
Исследование фагоцитарной активности гемоцитов in vitro 72
НСТ-тест 73
Исследование клеточной цитотоксичности 75
Исследование клиренса бактерий 76
Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea 76
Исследование гуморальных факторов гемолимфы L.littorea 77
Реакция агглютинации 78
Реакция гемолиза 78
Культивирование in vitro партенит трематод 79
Исследование углеводных детерминант поверхности Himasthla elongata на разных стадиях
жизненного цикла 79
Экспериментальная индукция изменения концентрации гемоцитов и клеточного состава
гемолимфы 80
Комментарий к методам статистического анализа 81
Результаты 82
Особенности методик получения гемолимфы и манипуляций с гемоцитами L. littorea 82
Характеристика основных элементов гемолимфы L.littorea 83
Клеточные элементы гемолимфы 83
Морфология гемоцитов L. littorea 83
Сезонная динамика клеточного состава гемолимфы L. littorea 87
Исследование поверхностных маркеров гемоцитов литторины 88
Исследование гистогенеза клеток гемолимфы 88
Функциональные характеристики гемоцитов L. littorea 92
Фагоцитарная активность 92
Синтез ферментов 92
Продукция активных форм кислорода 94
Цитотоксичность 95
Клиренс чужеродного материала 95
Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea 97
Гуморальные факторы гемолимфы L. littorea: сравнительная характеристика 99
Белковый состав плазмы 99
Агглютинины 101
Низины 103
Исследование основных механизмов воздействия партенит трематод на активность ВЗС
LlTTORINA LITTOREA 104
Морфологическая организация мантии вокруг дочерних спороцист R. parvicaudata. 104
Влияние заражения Н. elongata на характеристики гемолимфы L. littorea 106
Белковый состав плазмы 106
Клеточный состав гемолимфы 108
Сравнительная характеристика функциональной активности гемоцитов незараженных
L. littorea и моллюсков зараженных Н. elongata 108
Фагоцитарная активность 108
Синтез активных кислородных радикалов 109
Цитотоксические свойства гемоцитов 109
Анализ зависимости между клеточным составом гемолимфы L. littorea и интегральной
активностью ВЗС моллюска 109
Влияние СЭ-продуктов партенит трематод на активность гемоцитов моллюсков in vitro 110
Искусственная индукция изменений клеточного состава гемолимфы 114
Сравнительный анализ поверхностных углеводных структур Н. elongata и гемоцитов
МОЛЛЮСКОВ L. LITTOREA И М. EDULIS 116
Обсуждение 119
Особенности методики получения гемолимфы L. littorea 119
Морфология и гистогенетические отношения клеток гемолимфы L. littorea 120
Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea 127
Функциональные характеристики гемоцитов L. littorea. 129
Гуморальные факторы гемолимфы L. littorea 134
Изменение морфо-функциональных характеристик гемоцитов L. littorea при заражении моллюсков партенитами трематод 140
Выводы: 150
Список литературы 152
Введение к работе
Исследование эволюции тканей внутренней среды, обеспечивающих реализацию
защитных реакций, является одной из центральных проблем сравнительной гистологии. Согласно представлениям И.И.Мечникова, эта группа тканей является одной из наиболее эволюционно древних, и на самых ранних этапах эволюции многоклеточных организмов осуществляла трофические функции. В дальнейшем основной функцией указанной разновидности тканей внутренней среды стало поддержание гомеостаза организма посредством распознавания и элиминации структур (клеток и тканей), несущих признаки генетической чужеродности.
Рассматриваемая группа тканей внутренней среды представлена в той или иной степени у всех многоклеточных животных. Однако, максимальная специализация клеточных элементов этих тканей и формирование иммунной системы, представленной обособленными органами лимфо-миелоидного комплекса, наблюдается только у высших хордовых. В то же время, для комплекса тканей внутренней среды, выполняющих аналогичные функции, у другой, гораздо более многочисленной группы животных -беспозвоночных характерно небольшое разнообразие клеточных элементов и меньшая степень их специализации для выполнения тех или иных функций по сравнению с клетками крови позвоночных животных. В целом, основные защитные реакции, осуществляемые тканями внутренней среды беспозвоночных, сходные реакциями врожденного иммунитета позвоночных животных. В то же время, реакций адаптивного иммунитета у представителей Invertebrata не выявлено. Реализация защитных реакций у этих животных не сопровождается продукцией антител и формированием иммунологической памяти. Также у беспозвоночных отсутствует механизм реаранжировки генов, обеспечивающий широкое разнообразие специфичностей иммуноглобулинов различных классов и рецепторов Т-клеток у млекопитающих.
По сравнению с огромным объемом данных о морфологических, физиологических и биохимических аспектах функционирования иммунной системы позвоночных животных, и в особенности млекопитающих, сведения о защитных реакциях беспозвоночных представляются скудными и фрагментарными. Наибольшее количество данных о механизмах реализации защитных функций тканями внутренней среды этих животных получено при исследовании представителей типа Arthropoda. В то же время, другие таксономические группы, имеющие важное значение для познания путей и закономерностей эволюции Metazoa, в том числе моллюски, остаются относительно неизученными в этом плане. Сказанное относится и к качественной, и к количественной характеристикам имеющихся в нашем распоряжении данных. Подавляющая часть работ, посвященных защитным реакциям тканей внутренней среды представителей типа Mollusca, ограничивается морфологическим описанием основных клеточных элементов этих тканей - гемоцитов (амебоцитов). Одновременно с этим, практически все сведения, затрагивающие вопросы о механизмах реализации этими клетками своих функций, получены при изучении представителей всего лишь нескольких видов, имеющих медицинское (Biomphalaria, Bulinus, Lymnaea) или экономическое значение (мидии, устрицы). Однако, данные о механизмах осуществления внутренних защитных реакций у других представителей этого таксона, в том числе наиболее архаичных морских Prosobranchia, отсутствуют.
Тип Mollusca является вторым по численности среди таксонов этого ранга внутри беспозвоночных животных, уступая только типу Arthropoda. На сегодняшний день существует около 130 000 видов моллюсков, среди которых есть пресноводные, морские и наземные организмы (Kaestner, 1993). Очевидно, одним из факторов, способствующих биологическому прогрессу этой группы беспозвоночных, явилось формирование у моллюсков ряда эффективных адаптации, направленных на предотвращение заражения паразитическими организмами.
Среди внешних защитных барьеров, препятствующих проникновению патогенов в организм моллюсков, следует отметить раковину, имеющуюся у подавляющего большинства представителей этого типа, а также слизистый секрет покровного эпителия животных, содержащий ряд веществ токсичных для микроорганизмов. Постоянная смена секрета на покровах моллюсков, осуществляемая за счет секреторной активности как клеток эпителия, так и специализированных железистых образований (например, гипобранхиальная железа переднежаберных моллюсков), способна предотвратить прикрепление патогенных микроорганизмов к мягким тканям животных и снизить вероятность заражения.
В то же время, центральной системой, обеспечивающей контроль за постоянством внутренней среды организма моллюсков посредством распознавания «не-своего» и элиминации потенциальных патогенов, является внутренняя защитная система (ВЗС), формируемая элементами одной из тканей внутренней среды - гемолимфы. Основными компонентами этой ткани являются клетки - гемоциты (амебоциты), взвешенные в жидком межклеточном веществе - плазме. Функции этой ткани аналогичны таковым крови позвоночных животных - она осуществляет функцию газообмена, трофические и защитные функции. ВЗС моллюсков включает два рода защитных механизмов — клеточные и гуморальные. Клеточные элементы ВЗС представлены подвижными (циркулирующими) и прикрепленными (тканевыми) клетками, способными к фагоцитозу, инкапсуляции, синтезу активных форм кислорода, внутриклеточному разрушению фагоцитированного материала при помощи гидролитических ферментов. Гуморальные факторы ВЗС моллюсков — соединения, присутствующие в плазме гемолимфы, обладают чаще всего агглютинирующей, опсонизирующей и литической активностями по отношению к патогенным организмам.
Помимо неполноты и фрагментарности данных относительно механизмов функционирования ВЗС моллюсков, необходимо отметить и слабую разработанность методологии исследования защитных реакций беспозвоночных в целом и моллюсков в частности. Очевиден тот факт, что исследование механизмов, лежащих в основе реализации защитных функций тканями внутренней среды, невозможно без анализа особенностей ответа эффекторных клеток на контакт с патогеном. При этом, наиболее адекватных результатов можно ожидать при использовании в экспериментальных исследованиях паразитических организмов, являющихся природными патогенами для изучаемой группы животных. Действительно, анализ взаимных адаптации паразита и хозяина может пролить свет как на тонкие механизмы функционирования эффекторных клеток тканей внутренней среды моллюсков, так и на стратегии, используемые паразитом для регуляции активности клеточных и гуморальных защитных факторов хозяина. Такой подход к изучению защитных функций тканей внутренней среды представляется нам более продуктивным по сравнению с исследованием реакций амебоцитов на контакт с «искусственными» патогенами (эритроцитами, некоторыми видами бактерий и грибов, не характерных для местообитаний изучаемых животных), традиционно и широко используемым в практике иммунологических исследований.
В связи с этим, определенное внимание в данной работе уделяется анализу особенностей функционирования ВЗС моллюсков при заражении трематодами. Трематоды представляют собой группу паразитических червей со сложным жизненным циклом и являются наиболее распространенными патогенами для брюхоногих, и в частности переднежаберных моллюсков. Изучение взаимодействий между партнерами в этой паразито-хозяинной системы, являющейся одной из древнейших среди многоклеточных, способно чрезвычайно расширить возможности для анализа механизмов реализации защитных функций тканями внутренней среды моллюсков, а также путей, используемых трематодами для предотвращения распознавания и уничтожения в организме хозяина. Однако на сегодняшний день спектр исследованных в этом отношении паразит-хозяинных систем чрезвычайно узок и включает только несколько комбинаций трематоды-легочные моллюски, тогда как наиболее эволюционно древние системы прозобранхии-трематоды до сих пор не попадали в поле зрения исследователей.
Вышеизложенные обстоятельства обусловили выбор объекта для исследований — морского переднежаберного моллюска Littorina littorea. На этот вид замыкается несколько паразитарных систем, что делает его подходящим для проведения сравнительных исследований морфо-функциональных особенностей ВЗС моллюсков в норме и при заражении различными видами паразитических организмов.
Целями настоящей работы являлись:
- морфо-функциональная характеристика клеточных элементов и оценка активности некоторых гуморальных факторов гемолимфы морского переднежаберного моллюска Littorina littorea;
- сравнительная характеристика некоторых морфологических и функциональных параметров внутренней защитной системы у незараженных моллюсков и особей, зараженных Himasthla elongata (Trematoda: Echinostomatidae) и Renicola parvicaudata (Trematoda: Renicolidae).
Соответственно были определены следующие задачи исследования:
- исследование морфологической организации гемоцитов L. littorea и параметров популяции клеток гемолимфы (гемограммы) у интактных моллюсков и животных после инъекции ряда факторов, а также особей зараженных Н. elongata или R. parvicaudata;
- анализ гистогенетических взаимоотношений между гемоцитами различных субпопуляций;
- изучение основных проявлений функциональной активности гемоцитов (адгезия, фагоцитоз, выработка активных радикалов кислорода, продукция цитотоксических факторов) незараженных L. littorea и моллюсков, зараженных Н. elongata;
- исследование основных групп гуморальных защитных факторов L. littorea (агглютинины, лизины, опсонины);
- изучение влияния секреторно-экскреторных продуктов трематод на фагоцитарную активность гемоцитов моллюсков in vitro;
- сравнительное исследование углеводных детерминант поверхности трематод Н. elongata на разных стадиях жизненного цикла и гликокаликса гемоцитов моллюсков L. littorea и Mytilus edulis (Bivalvia, Eulamellibranchia).
