Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Обзор литературы 13
1.1. Основные механизмы канцерогенеза и опухолевой прогрессии злокачественных опухолей системы крови 13
1.1.1. Роль пролиферативной активности опухолевых клеток в развитии опухолевой прогрессии 17
1.1.2. Роль нарушения механизмов апоптоза в опухолевой прогрессии .22
1.1.3. Множественная лекарственная устойчивость и ее роль в опухолевой прогрессии злокачественных новообразований 25
1.2. Роль химиотерапии в лечении гемобластозов .30
1.2.1. Токсическое поражение ткани печени при цитостатической терапии 32
1.3. Цитохром Р450 и его роль в биотрансформации ксенобиотиков .36
1.4. Подходы к индивидуализации лечения пациентов со злокачественными новообразованиями 38
ГЛАВА 2. Материал и методы 41
2.1. Экспериментальная часть работы .41
2.1.1. Лабораторные животные и используемые опухолевые модели 41
2.1.2. Описание исходного штамма лимфосаркомы LS .42
2.2. Эксперимент №1 42
2.3. Эксперимент №2 44
2.4. Клинический материал исследования 45
2.5. Материалы, использованные в работе .46
2.5.1. Оборудование 46
2.5.2. Препараты и реактивы .46
2.5.3. Олигонуклеотиды, использованные в работе 48
2.5.4. Буферы и растворы .49
2.6. Использованные в работе методы .49
2.6.1. Получение первичной культуры клеток из опухолевого узла 49
2.6.2. Выделение суммарной клеточной РНК .50
2.6.3. Обратная транскрипция 51
2.6.4. Проведение ПЦР 51
2.6.5. Оценка эффективности ПХТ и динамика роста опухоли 52
2.6.6. Морфологические методы, используемые в работе .53
2.6.7. Статистический анализ 55
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 56
3.1. Модель экспериментальной лимфомы мышей RLS. Оценка опухолевой прогрессии у экспериментальных животных в зависимости от количества курсов ПХТ .56
3.2. Гистологическое строение перевиваемой лимфомы RLS и морфологические особенности ткани опухоли в зависимости от числа курсов ПХТ 58
3.3. Влияние ПХТ на динамику роста лимфомы мышей RLS и продолжительность жизни животных с опухолью 65
3.4. Определение уровня экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках опухоли RLS после воздействия нескольких курсов ПХТ 67
3.5. Динамика уровня экспрессии Ki-67 в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения ПХТ 70
3.6. Уровень некрозов и апоптозов в экспериментальной лимфоме RLS без лечения и после курсов ПХТ 71
3.6.1. Результаты исследования индекса мечения окрашенных caspase 3 опухолевых клеток в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ 75
3.7. Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Р-гликопротеин опухолевых клеток экспериментальной лимфомы мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ 78
3.8. Структурные изменения ткани печени и результаты исследования индекса мечения окрашенных на цитохром P450 гепатоцитов у животных с RLS до лечения и после проведения курсов
ПХТ 81 3.9. Исследование опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы у пациентов в процессе полихимиотерапии: сравнительная молекулярно-клеточная характеристика опухоли у пациентов до лечения и после курсов химиотерапии по поводу рецидивов 89
3.9.1. Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Р-гликопротеин клеток ткани опухоли пациентов с первично возникшей ДБККЛ и в группе пациентов с рецидивами ДББКЛ после проведения курсов ПХТ .96
Заключение 100
Выводы 108 литература 110
- Множественная лекарственная устойчивость и ее роль в опухолевой прогрессии злокачественных новообразований
- Получение первичной культуры клеток из опухолевого узла
- Влияние ПХТ на динамику роста лимфомы мышей RLS и продолжительность жизни животных с опухолью
- Исследование опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы у пациентов в процессе полихимиотерапии: сравнительная молекулярно-клеточная характеристика опухоли у пациентов до лечения и после курсов химиотерапии по поводу рецидивов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Основным методом лечения гемобластозов является многокурсовая полихимиотерапия, что определяет особую важность мониторирования и оценки изменяющихся под воздействием цитостатиков молекулярно-биологических характеристик именно данного вида опухолей и приближает к основной идее персонализированной медицины – индивидуализации подходов диагностики и лечения злокачественных опухолей (Jain K.K. 1998, 2002,2003,2009; Foussard C. et al., 2005; A. et al., 2008).
Это делает необходимым понимание процессов опухолевой прогрессии после химио-лучевого воздействия (Hanahan D. et al., 2000). Полученные сведения помогут оптимизировать схемы лечения каждого пациента индивидуально и сделают возможным проведение более успешной таргетной терапии гемобластозов (Miura K. et al., 2011).
Существует ряд проблем, не позволяющих полноценно и эффективно использовать химиотерапию: развитие опухолевой прогрессии в результате накопления мутаций и генетической нестабильности, отбор клонов с максимальными возможностями к пролиферации, развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) (Блохин Д.Ю., 2009; Foulds L., 1969). Все эти качества опухолевой клетки направлены на выживание и рост неоплазмы и нередко в ней включается сразу несколько механизмов защиты от воздействия химиотерапии. Отдельные свойства опухоли прогрессируют независимо друг от друга, а непредсказуемость количества и качества вторичных мутаций делают эту прогрессию уникальной и индивидуальной для каждой опухоли, что требует определения исходного и меняющегося под воздействием лечения генотипа каждого злокачественного новообразования.
Кроме того, существенным недостатком противоопухолевых препаратов является их токсическое воздействие на органы и ткани. Все цитостатики подвергаются биотрансформации в печени с помощью системы микросомальных оксигеназ и в результате образуются токсические метаболиты, которые вызывают развитие гепатотоксичности и повреждение гепатоцитов. Это в свою очередь является фактором ограничивающим проведение многократных курсов полихимиотерапии (Казюлин А.Н., 2012; I., 2012; D.E., 2013).
Степень разработанности темы исследования. В научной литературе приводится крайне мало данных об изменениях в ткани печени при проведении многократных курсов терапии цитостатиками, это обстоятельство делает необходимым изучение морфологических изменений ткани печени в условиях цитотоксической нагрузки, а так же изменений уровней ферментных систем, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков.
Кроме того, большой проблемой является моделирование схем лечения опухолей в эксперименте на животных, приближающееся по продолжительности курсов полихимиотерапии у пациентов, что существенно ограничивает исследование процессов, формирующихся в опухоли под воздействием химиотерапии.
Вышеизложенные обстоятельства указывают на очевидную недостаточность данных по обсуждаемой проблеме опухолевой прогрессии под воздействием цитостатиков и необходимость уточнения существующих сведений, что и определило цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования: изучить молекулярно-клеточные и патоморфологические особенности проявлений опухолевой прогрессии в злокачественных лимфомах в условиях полихимиотерапии: в эксперименте на резистентной лимфоме мышей RLS и в опухолевой ткани пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой.
Задачи исследования:
1. На экспериментальной модели лимфомы мышей RLS исследовать динамику роста опухоли и соотнести её с показателями уровней некрозов и апоптозов в ткани опухоли под воздействием курсов полихимиотерапии.
2. Исследовать экспрессию генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости и инициации программы апоптоза, в клетках опухоли мышей RLS без лечения и после проведения курсов полихимиотерапии.
3. Иммуногистохимическим методом изучить динамику изменения экспрессии Ki-67, р53, caspase 3, bcl2 и Р-гликопротеина в клетках опухоли RLS под воздействием курсов полихимиотерапии.
4. Провести патоморфологическое изучение структурных изменений в печени мышей с лимфомой RLS и изучить экспрессию цитохрома P450 в гепатоцитах в динамике курсов полихимиотерапии.
5. Исследовать морфологические и молекулярно-биологические особенности проявлений опухолевой прогрессии в диффузной В-крупноклеточной лимфоме у пациентов до и после проведения многократных курсов полихимиотерапии.
Научная новизна исследования
Впервые разработана оптимальная доза имплантирования опухолевых клеток резистентной лимфомы мышей RLS, позволяющая провести четырехкратное введение комплекса цитостатиков, что сделало возможным изучить спектр молекулярно-биологических изменений, происходящих в изначально резистентной к химиотерапии опухоли RLS поэтапно, после каждого из 4-х курсов химиотерапии.
Впервые в резистентной лимфоме RLS на фоне четырехкратного введения комплекса цитостатиков установлено изменение экспрессии ключевых генов, регулирующих апоптоз и участвующих в формировании МЛУ, что в совокупности с данными о динамике экспрессии соответствующих белков позволило сделать вывод об особенностях опухолевой прогрессии изначально резистентной к цитостатикам опухоли RLS.
Впервые в лимфоме RLS после четырехкратного воздействия цитостатиков установлено нарушение процессов апоптоза, которые характеризовались повышением количества клеток, экспрессирующих белок bcl-2, снижением количества р53-позитивных клеток при невысоком числе клеток, синтезирующих каспазу 3 в течение всех 4 курсов полихимиотерапии. Впервые показано, что пролиферативная активность опухолевых клеток RLS до лечения и на этапах полихимиотерапии нарастает в совокупности с увеличением количества опухолевых клеток, экспрессирующих Р-гликопротеин, участвующий в формировании множественной лекарственной устойчивости.
Впервые у животных с лимфомой RLS исследована динамика нарастания структурных изменений в паренхиме печени на фоне воздействия опухолевого процесса и 4 курсов полихимиотерапии, а так же впервые на основании изменений количества гепатоцитов, экспрессирующих цитохром Р450, показано «истощение» системы микросомального окисления в зависимости от нагрузки цитостатиками и нарастания деструктивных изменений паренхимы печени.
Впервые у пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой на основании исследования уровней экспрессии ряда белков, характеризующих опухолевую прогрессию (Ki-67, bcl-2, р53, Р-гликопротеин), установлены изменения молекулярных характеристик опухолевых лимфомных клеток под воздействием многократных курсов полихимиотерапии в процессе лечения заболевания в сравнении с впервые диагностированной диффузной В-крупноклеточной лимфомой.
Научно-практическая значимость работы
Полученные новые данные дополняют сведения о молекулярно-клеточных механизмах формирования опухолевой прогрессии и множественной лекарственной устойчивости в изначально резистентных к химиопрепаратам опухолях под воздействием многократных курсов полихимиотерапии, что зачастую наблюдают в клинике у пациентов с агрессивными формами лимфом.
Данное исследование продемонстрировало особенности структурных изменений в печени при проведении многокурсовой химиотерапии свидетельствующих об «истощении» системы цитохрома Р450 в течение курсов введения цитостатиков, что сопряжено с нарушениями метаболизма цитостатиков и, как следствие, снижению их воздействия на опухолевую ткань, что следует учитывать в процессе длительного лечения онкологических больных химиопрепаратами.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На фоне многократных введений комплекса цитостатических препаратов животным с лимфомой RLS, которая характеризуется изначально лекарственно-резистентным фенотипом, продолжала нарастать степень злокачественности опухоли, как отражение опухолевой прогрессии. Это выражалось в нарушениях механизмов гибели опухолевых клеток апоптозом, усилении множественной лекарственной устойчивости, наращивании пролиферативной активности опухолевых клеток. В итоге наблюдали снижении чувствительности опухоли к цитостатикам и прогрессирующий рост опухолевого узла на фоне курсов химиотерапии.
2. В условиях влияния опухолевого процесса и проведения многокурсовой полихимиотерапии нарастают деструктивные изменения в паренхиме печени животных и происходит «истощение» синтеза цитохрома Р450 в гепатоцитах, что снижает чувствительность опухоли к цитостатикам и повышает токсическую нагрузку на организм.
3. Проведение многократных курсов полихимиотерапии пациентам с диффузной В-крупноклеточной лимфомой в процессе лечения заболевания приводит к изменениям молекулярных характеристик лимфомных клеток, отражающих опухолевую прогрессию: в леченой опухоли в сравнении с первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомой происходит блок процессов апоптоза и активация множественной лекарственной устойчивости, что способствует прогрессированию опухолевого процесса у пациентов, снижает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, способствует увеличению опухолевой массы, повышению токсической нагрузки.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Материалы исследования представлены на ежегодной конкурс-конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2010, 2012), на всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011), межвузовской научной студенческой конференции «Интеллектуальный потенциал Сибири» (Новосибирск, 2012), первой всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине ХХI века» (Москва, 2012), на научно-практической конференции патологоанатомов ДВФО посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.И. Зеленского «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Хабаровск, 2012), на научно-практической конференции Южного Урала (Челябинск, 2014).
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую деятельность на кафедрах патологической анатомии и гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ и в научно-исследовательскую деятельность лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2– в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций материалов диссертационных исследований, 1 статья в зарубежном издании.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками и содержит 3 таблицы. Библиографический указатель содержит 185 источников, из которых 45 отечественных и 140 зарубежных работ.
Множественная лекарственная устойчивость и ее роль в опухолевой прогрессии злокачественных новообразований
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – это
невосприимчивость клеток или организма к целому ряду лекарственных препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия. Причем у опухолевых клеток снижение чувствительности к химическим агентам происходит до такой степени, что они сохраняют способность к пролиферации при воздействии на них препарата в критической или даже более высокой концентрации, т.е. это своего рода механизм приспособления клеток опухоли к изменяющимся условиям их существования (Блохин Д.Ю. 2009).
Данный феномен имеет важное клиническое значение, так как является серьезным препятствием на пути успешного лечения злокачественных новообразований (Ставровская А.А., 2000; Штиль А.А., 2003). В отношении гемобластозов этот феномен изучен достаточно подробно и сделан вывод, что он является основной причиной неудач в лечении и прогрессирования заболевания. Существует несколько механизмов формирования данного феномена, все они могут быть следствием самых разных причин: от ограничения накопления химиопрепаратов в клетке и до отмены программы клеточной гибели, индуцируемой лекарственным веществом, а часто бывает, что в клетке включается сразу несколько механизмов МЛУ (Hegewisch-Becker S.,1996; Shtil A.A., 2002; Shah N.P., 2003). В данное время наиболее хорошо изучены такие механизмы как: активация ферментов системы глутатиона, активация трансмембранных транспортных белков, которые выводят токсические вещества из клетки (например, р-гликопротеин), изменения в системе генов и белков, которые осуществляют контроль за апоптозом и клеточной пролиферацией, усиление репарации лекарственно - индуцированного повреждения ДНК, повреждение лекарственных мишеней (топоизомераза II) (Goldstein L.J. et al., 1989; Filipits M., 2004; Baguley B.C, 2010).
Существует взаимосвязь между количественными изменениями опухолевой клеточной популяции и изменениями их биологических свойств. В активно размножающейся опухолевой ткани всегда имеется некоторое количество лекарственно-устойчивых клеточных линий, соответственно по мере гибели опухолевых клеток, например под влиянием химиотерапевтических препаратов или лучевой терапии, нарушается соотношение между количеством лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых клеток в пользу последних. В результате такой клональной селекции формируется поликлоновая опухоль, в которой будут доминировать наиболее агрессивные клеточные клоны, устойчивые к лечению.
Установлено, что цитотоксическое действие большинства
противоопухолевых препаратов реализуется путем индукции апоптоза и ключевая роль в этом процессе, принадлежит белковым продуктам генов р53 и bcl-2 (Allouche M., 1997; Kojima Y. et al., 2006). Установлено, что экспрессия wtр53 повышает чувствительность к химиотерапии, поскольку ускоряет вхождение клеток в апоптоз, а вот мутантный р53 проявляет свойства онкогена, поскольку он не обладает способностью останавливать деление клетки с поврежденной ДНК и индуцировать её апоптоз, в результате чего в клетках начинается репликация этой поврежденной ДНК. Все это в дальнейшем приведет к нестабильности генома и повысит вероятность закрепления вторичных мутаций и злокачественной трансформации клеток. Следовательно, белковый продукт гена супрессора р53 является важным компонентом клеточного цикла, снижение функции которого или его мутации приведут к выживанию опухолевых клеток, которые должны погибнуть в процессе проведения терапии (Чумаков П. М., 2000; Jeffrey P. 1994; Kotala V. et al., 2001; Levine A., 2006; Selivanova G., 2007). Белки семейства Bcl так же играют важную роль в регуляции апоптоза, индуцированного различными физиологическими, химиотерапевтическим и лучевыми воздействиями. Некоторые из этих белков (BCD-XL, Bag, Bcl-2) препятствуют развитию апоптоза, тогда как другие (Bcl-xS, Bax, Bad, Bak, Bid) наоборот, обладают проапоптотическим действием. Гиперэкспрессия белков bс1 2 делает клетки опухоли нечувствительными к проапоптотическим стимулам и, следовательно, ассоциирована такая гиперэкспрэкспрессия с устойчивостью опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов и лучевой терапии. Ген bcl-2 работает как супрессор апоптоза, препятствует гибели клеток путем апоптоза под действием химиопрепаратов, предотвращает протеолитический процессинг и активацию каспаз в ответ на повреждение ДНК, которое индуцируется цитостатиками (Фаллер Д.М., 2006; Alberts B., 2008). Повышенная экспрессия Вс1-2 наблюдается при некоторых видах лимфом (ДВККЛ, мантийноклеточная, фолликулярная) (Reed J.C., 2008; Abbott D.R., 2009), а также при нейробластомах (Wang D. et al., 2009) опухолях предстательной железы (DiPaola R.S., 1999; Lee E.C., 2004) и др. В исследованиях показано, что при гиперэкспрессии bcl-2 опухолевые клетки могут приобретать лекарственную устойчивость к различным химиотерапевтическим препаратам (Zhong C. et al., 2001; Monti E., 2006), что может рассматриваться как неблагоприятный прогностический признак при ряде новообразований, но ингибирование функций этого гена повышает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, что делает ген bcl-2 мишенью для воздействия химиопрепаратов. Таким образом, получается, что как анти-, так и проапоптотические белки могут влиять на развитие лекарственной резистентности опухолевых клеток.
Еще одним из основных механизмов МЛУ является снижение накопления лекарственных препаратов в опухолевых клетках, обусловленное активным выведением веществ в межклеточную среду (Baguley B.C., 2010). Такой транспорт осуществляется группой трансмембранных белков АВС-транспортеров, которые связывают АТФ и используют энергию ее гидролиза для переноса молекул через клеточные мембраны (Stavrovskaya A.A., 2008). Одним из таких белков плазматической мембраны является Р- гликопротеин (P-gp), кодируемый геном MDR1, принадлежащим к семейству генов MDR. Он локализован в 7 хромосоме, молекула этого белка состоит из 1280 аминокислотных остатков и имеет внутри-и внеклеточный компонент, каждый из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков и два сайта связывания АТФ. Благодаря этому механизму P-gp обеспечивает выброс веществ за пределы клетки и соответственно ее выживание в присутствии токсичных для нее веществ, различных по структуре и биологическому действию (Komdeur R. et al., 2002).
Семейство MDR включает два гена человека ( MDR1 и MDR2) и три гена грызунов ( mdr1 , mdr2 , mdr3), но лишь один ген человека (MDR1) и два гена грызунов имеют отношение к МЛУ.
В норме в организме наблюдаются высокие уровни экспрессии мРНК и белка P-gp в печени, почках, надпочечниках, поджелудочной железе, тонком и толстом кишечнике, яичниках и яичках, эндотелии капилляров головного мозга (Staud F. et al., 2010). К развитию МЛУ может приводить как изменение экспрессии гена MDR1, так и увеличение дозы гена - амплификация участка генома, содержащего ген MDR1. Еще одной характеристикой MDR1-опосредованного механизма является наличие многообразия его субстратов, которые различаются по структуре и функции: от малых молекул (катионы и аминокислоты), до макромолекул (полисахариды, белки).
МЛУ может развиваться в клетках различного тканевого происхождения и в ответ на действие самых разных веществ: химиопрепараты, различные типы излучений (Пасюков В.В., 2007; Matsunaga S., 2006). В активации МЛУ участвуют многочисленные механизмы проведения внутриклеточных сигналов. Эта своего рода защитная система жизненно необходима для опухолевой клетки и поэтому ее регуляция неоднократно дублируется через разные механизмы и, соответственно, возможны обходные пути проведения этих сигналов, если тот или иной механизм не функционирует. Такая взаимозаменяемость механизмов надежно обеспечивает развитие МЛУ при воздействии различных веществ (Schinkel A.,1998; Schumacher M., 2004; Loo T., 2005). Поэтому применение высокодозных цитостатических режимов лечения для повышения его эффективности, может индуцировать развитие МЛУ в выживших клетках, а снижение доз (чтобы избежать развития МЛУ) – заведомо будет неэффективно (Marie J.P., 2001).
Получение первичной культуры клеток из опухолевого узла
Для получения первичной культуры клеток, на определенных сроках роста перевитой в мышцы правого бедра опухоли, животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Мышей препарировали, отделяли пласт опухолевой ткани, затем его помещали в стерильный физиологический раствор (10мл) и хранили в емкости со льдом. Далее ткань опухоли подвергали гомогенизации и двукратной фильтрации, что бы приготовить суспензию опухолевых клеток. Полученную суспензию из клеток опухоли наслаивали на 3 мл среды LSM, далее ее центрифугировали в течение 15 минут при скорости 1500 об/мин. Фракцию клеток, которая находилась на границе раздела cупернатанта и LSM переносили в чистую пробирку с 5 мл фосфатного буфера PBS, суспендировали, центрифугировали 5 минут при скорости 1000 об/мин. Полученный клеточный осадок помещали в питательную среду IMDM, которая содержит 1%-ый раствор антибиотика и антимикотика, 10%-ую бычью сыворотку. Далее клетки культивировали при температуре 37оС в атмосфере 5%-ого СО2, растущую культуру клеток для поддержания экспоненциального роста пересевали каждые 3 дня.
Суммарная клеточная РНК была выделена из культивируемых опухолевых клеток с помощью SDS/фенольной экстракции согласно методике, описанной в литературе (Chattopadhyay N. et al., 1993). Для предотвращения развития деградации РНК все манипуляции проводили во льду. Клетки в количестве 5х106 осаждали с помощью центрифугирования на скорости 2000 об/мин в течении 5 минут. Полученный супернатант убирали, к клеточному осадку добавляли 100 мкл ТЕ-буфера и раствор SDS до конечной концентрации 0,5%. Затем в эту смесь добавляли 2 объема фенола, уравновешенного водой, и ацетата натрия (рН 4,5) до конечной концентрации 0,3 М. Полученную водную фазу отделяли от органической с помощъю центрифугирования на скорости 10000 об/мин, 10 минут и остатки белков экстрагировали последовательно равным объемом смеси фенол/ хлороформ (v/v; 1/1) и хлороформа. Далее осаждали РНК из водной фазы 3-мя объемами 96%-ого этанола в течение 20 часов при -20оС., а затем осадок РНК отделяли центрифугированием (13000 об/мин, 4оС, 15 минут), промывали 80%-ым этанолом, высушивали и растворяли в Н2О milliQ и хранили при -20оС. Концентрацию полученной РНК определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 260 нм.
Сохранность полученной РНК проверяли при помощи проведения электрофореза в 1%-ом агарозном геле в буфере ТВЕ при напряжении электрического поля 20 В/см. К пробам добавляли одну пятую от объема пробы раствора G непосредственно перед нанесением на гель. Затем гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали при визуализации в УФ свете. 2.6.3. Обратная транскрипция
С помощью метода обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) проводили определение уровней мРНК генов mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53, -актина в клетках первичной культуры опухоли RLS в группах без лечения и после проведения нескольких курсов ПХТ.
Для синтеза кДНК использовали полученную суммарную РНК клеток опухоли RLS. кДНК получали с помощью реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей ОТ-буфер, 2 мкг суммарной клеточной РНК, 0,01 М DTT, 12 пмолей гексануклеотидного праймера, 0,5 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 20 ед. обратной транскриптазы М-MLV. Реакцию синтеза кДНК проводили в течение часа при температуре 37оС, полученные при этом образцы были использованы для проведения ПЦР, либо их хранили при температуре -20оС.
Последовательности олигонуклеотидов которые использовались как праймеры для проведения ПЦР приведены в таблице 1. ПЦР проводилась в реакционной смеси объемом 20 мкл, которая содержала 1 мкл кДНК, 2 ед. Taq полимеразы, 6 пмолей специфических праймеров, 0,05 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатов для генов mdr1b, bcl-2, p53 и 0,2 мМ для гена mdr1a. Что бы получить специфические продукты данных генов использовали для гена mdr1b- 24 цикла амплификации, для mdr1a- 26 циклов, для генов р53 и bcl-2 31 цикл амплификации. Праймеры -актина были добавлены в реакционную смесь для генов р53 и bcl-2 после шестого цикла, а для mdr1a после третьего и для mdr1b после первого цикла. Амплификацию проводили по следующей схеме: 1цикл, денатурация – 95оС в течение 5 минут; плавление праймеров – 57оС, 1 минута; элонгация – 72 оС, 1 минута. Последующие циклы амплификации проводили при следующих условиях: 94 оС, 1минута; 57 оС, 1 минута; 72 оС, 1минута. Отсутствие загрязнений при проведении ПЦР контролировали с помощью замены одной кДНК пробы на чистую дистиллированную воду. Далее полученные продукты ПЦР разделяли с помощью электофореза в 8%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях при соотношении акриламид/N,N-метиленбисакриламид = 20/1 в буфере ТВЕ при напряженности электрического поля 30-45 В/см. Перед тем как нанести пробы на гель к ним добавляли одну пятую от объема самой пробы раствора F. Полученное положение продуктов в геле определяли путем окрашивания их раствором бромистого этидия при визуализации в УФ свете. Далее полученные изображения полос обрабатывали с помощью компьютерной денситометрии (программа Gel-Pro Analyzer 4.0). Что бы определить уровни экспрессии мРНК интегральную оптическую плотность полос, соответствующих ген-специфическим ПЦР-продуктам, нормализовали на оптическую плотность продукта -актина. 2.6.5. Оценка эффективности ПХТ и динамика роста опухоли Динамику роста перевитой опухоли оценивали, проводя ежедневные замеры пораженной конечности при помощи штангенциркуля. Затем полученные три взаимно перпендикулярные размера перемножали и получали объем опухоли. Регулярно проводили взвешивание животных, чтобы оценить токсическое действие опухоли и химиотерапии на организм животных.
Влияние ПХТ на динамику роста лимфомы мышей RLS и продолжительность жизни животных с опухолью
Для оценки влияния противоопухолевой терапии проводили повторяющиеся курсы ПХТ по схеме CHOP на уже обоснованно подобранной дозе опухолевых клеток, с учетом ранее установленной (первый этап эксперимента) продолжительности жизни животных-опухоленосителей. Опухоль была сформирована путем перевивки опухолевых клеток в правую бедренную мышцу животного, динамику роста лимфосаркомы RLS у животных контрольной группы (без введения цитостатиков) и в группе животных с проведением ПХТ отслеживали путем измерения пораженной конечности штангенциркулем (рис.13).
Забор материала для гистологического исследования проводили на 7-е сутки после проведения каждого из трех курсов ПХТ и на 1-е сутки после проведения 4-ого курса ПХТ.
Рис.13. Динамика роста опухоли RLS у животных без лечения и у животных с опухолью RLS, получивших 4 курса ПХТ по схеме CHOP. У всех животных на 7-е сутки после трансплантации опухолевых клеток в бедре формировался солидный опухолевый узел, достигавший среднего объема около 0,16 см3, далее размеры узла поступательно увеличивались, несмотря на повторяющиеся курсы ПХТ (рис.13).
В сравнении с динамикой роста опухоли у контрольных животных было получено, что повторяющиеся курсы введения цитостатиков оказывали лишь «сдерживающий» эффект на лимфому RLS, но не позволили её элиминировать. Проводя измерения размеров опухоли через день, не было отмечено уменьшения ее размеров ни на одном из 4-х курсов ПХТ (рис.13).
У животных с перевитой опухолью в группе контроля (опухоль без воздействия ПХТ) начало гибели животных отмечали на 18-е сутки после трансплантации опухолевых клеток и их средняя продолжительность жизни составила 26,6 суток. В группе животных-опухоленосителей с проведением 4-х последовательных курсов ПХТ с интервалом в 7 дней гибель животных начиналась к 25-м суткам после трансплантации опухоли и их средняя продолжительность жизни составила 28 суток. Максимальный размер опухолевого узла составлял 4±0,26 см в группе животных с опухолью без лечения и 1,6±0,15 см в группе животных получавших лечение цитостатиками.
Таким образом, полученные данные о прогрессирующем на фоне введений комплекса цитостатиков росте опухоли RLS потребовали уточнения механизмов прогрессирования опухолевого процесса в изначально резистентной опухоли. 3.4. Определение уровня экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках опухоли RLS после воздействия нескольких курсов ПХТ
После проведения каждого курса ПХТ в ткани опухоли RLS определяли уровень экспрессии генов, которые участвуют в формировании МЛУ: mdrla, mdrlb, bcl-2, p53. Уровень экспрессии этих генов определяли с помощью метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), в качестве внутреннего стандарта использовали ген /3-актин. Из опухолевых клеток первичных культур (глава 2.4.1.) была выделена суммарная РНК с помощью стандартной SDS/фенольной экстракции (глава 2.4.2.). Затем проводили синтез кДНК в буфере с использованием суммарной клеточной РНК, рандомизированного гексануклеотидного праймера и обратной транскриптазы M-MLV (глава 2.4.3.). Для проведения ПЦР с помощью программы OLIGOS были подобраны последовательности специфических праймеров к генам mdrla, mdrlb, bcl-2, р53 и /З-актину, которые приведены в таблице 1 (глава 2.4.4). Линейный участок кривой накопления продукта амплификации соответствовал 22-25 циклам для 0-актина, 24 циклам для mdrlb, 26 циклам для mdrla, 31 циклу для bcl-2 ир53, количество ген-специфического продукта нормировали на количество актин-специфического продукта. Получившиеся данные и количественная обработка результатов ОТ-ПЦР представлены на рисунке 14.
В результате было установлено, что по сравнению с опухолью без лечения, после воздействия четырех курсов ПХТ в клетках опухоли RLS повысилась экспрессия генов mdrlb (в 1,8 раза) и bcl-2 (в 1,3 раза), уровень экспрессии гена mdrla снижался в 1,2 раза, а экспрессия гена р53 различалась по курсам ПХТ и к 4 курсу произошло снижение показателя почти в 2 раза.
Исследование опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы у пациентов в процессе полихимиотерапии: сравнительная молекулярно-клеточная характеристика опухоли у пациентов до лечения и после курсов химиотерапии по поводу рецидивов
С целью оценки молекулярных характеристик диффузной В крупноклеточной лимфомы у пациентов до лечения и после проведения курсов
ПХТ по поводу рецидивов заболевания, выполняли патоморфологическую оценку гистологических препаратов операционно-биопсийного материала лимфатических узлов 30 пациентов с первично выявленной ДВККЛ (средний возраст пациентов составил 52,3±3,7) и лимфатических узлов по секционному материалу от 20 пациентов с ДВККЛ, перенесших от 16 до 24 курсов ПХТ суммарно и умерших при очередном рецидиве данного заболевания (средний возраст пациентов 57,1±2,9).
В исследование были выбраны случаи неспецифицированного варианта ДВККЛ (по ВОЗ классификации – Diffuse large B-cell lymphoma, not otherwise specified (DLBCL), NOS, ICD-O code 9680/3) (Swerdlow S., 2008) с первично нодальным поражением. Микроскопически ДВККЛ была представлена диффузным ростом в лимфатических узлах опухолевых лимфоидных клеток, стирающих рисунок их строения. Опухолевые клетки крупного размера (в 3-4 раза больше размера малого лимфоцита), имеют морфологию центробластов и иммунобластов. Центробласты – крупные клетки с просветленными округло-овальными ядрами, ровным либо изрезанным контуром ядер, наличием 2-4 ядрышек, расположенных близко к ядерной мембране; ободок цитоплазмы узкий. Иммунобласты – крупные клетки с просветленными округлыми ядрами, ровным контуром ядер, наличием одного более крупного ядрышка, расположенного центрально; цитоплазма хорошо выражена, часто эксцентрично расположена относительно ядра.
В наших наблюдениях как у первичных больных с ДВККЛ, так и у умерших от ДВККЛ преобладали опухоли центробластного типа строения (24 и 17 пациентов соответственно), у остальных в опухолевом инфильтрате была большей доля иммунобластов, но примесь центробластов присутствовала. Опухолевые клетки стирали рисунок строения лимфатических узлов, инвазировали капсулу и прилежащую клетчатку. В опухолевых лимфоидных клетках часто встречали митозы, были клетки в состоянии апоптотического распада. Существенных морфологических различий на светооптическом уровне в первичной ДВККЛ и рецидивной ДВККЛ после многократных курсов ПХТ отмечено не было. Обращало внимание, что некрозы в опухоли в обеих группах встречались редко в виде очень небольших очагов – в первично выявленной ДВККЛ у 1 пациента (3,3%), а в рецидивных ДВККЛ умерших пациентов в 3 случаях (15%), хотя пациенты умерли на фоне получаемой программной цитостатической терапии и можно было бы ожидать более существенных деструктивных процессов в опухолевой ткани.
У пациентов с ДВККЛ, получивших многокурсовое ПХТ-лечение и умерших при очередном рецидиве заболевания, на аутопсии в разном сочетании выявляли распространенный инвазивно-диссеминированный рост опухоли в нескольких группах лимфатических узлов, опухолевые инфильтраты в прилежащих тканях (особенно забрюшинной клетчатке, средостении), паренхиматозных органах (прежде всего - печени, почках, легких, селезенке), очаговое поражение костного мозга. Такая распространенность процесса на момент смерти свидетельствовала о крайней агрессивности ДВККЛ, которая на фоне ПХТ демонстрировала прогрессирование, а, значит, низкую чувствительность к лечению. Оценивая индекс мечения (ИМ) окрашенных ядер антителами к Ki-67 было выявлено, что в группе пациентов с первично диагностированной ДВККЛ уровень пролиферативной активности опухолевых клеток, изначально был высоким и составил 56,3 ± 1,5% (табл.3), что отражает высокую агрессивность данного варианта НХЛ. В опухоли онкобольных, перенесших многокурсовую ПХТ и умерших при очередном рецидиве болезни, уровень пролиферативной активности опухолевых клеток снижался в 1,5 раза (табл.3), несмотря на очевидное прогрессирование заболевания с вовлечением в опухолевый процесс мультилокализаций (нескольких групп полостных и периферических лимфатических узлов, селезенки, печени, костного мозга, инфильтрацией паренхиматозных органов и перифокальных тканей) (рис. 28, рис.29). Уровень индекса мечения онкопротеина BCL2, ингибирующего каспазы и тем самым подавляющего апоптоз, был изначально достаточно высоким у пациентов с первично возникшей опухолью - 47,4±2,4 %, а у пациентов с рецидивами после полученного цитостатического лечения отмечали дополнительное нарастание этого показателя в 1,7 раза (табл.3, рис. 30, рис.31). Уровень онкосупрессора p53 так же повышался у пациентов перенесших рецидивы заболевания и многократные курсы ПХТ - показатель увеличился в 2,3 раза, по сравнению с аналогичным показателем в группе больных с первично возникшей опухолью (рис.32, рис. 33, табл. 3).
