Введение к работе
Актуальность темы. Грипп относят к группе острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), которые занимают одно из первых мест в структуре инфекционных заболеваний. По данным ВОЗ, ежегодно в мире болеет гриппом от 3 до 5 млн. человек, эпидемии гриппа ежегодно уносят жизни 250–500 тыс. человек (ВОЗ; Слепушкин А.Н., 2003). Заболеваемость гриппом высока во всех возрастных группах. Смертность от гриппа отчетливо приходится на лиц пожилого возраста, наиболее часто связанная с обострением имевшихся у пациента заболеваний (сердечно-сосудистых, респираторных, болезней обмена) (Семенов Б.Ф., Покровский В.И., 2004; Малый В.П. и др., 2007; Салтыкова Т.С., 2008; Bhat N. et al., 2005).
Основные эпидемии гриппа ХХ века были вызваны вирусами гриппа птиц модифицированных путем генетической реассортации между штаммами гриппа птиц и людей (пандемии 1957 и 1968 гг.) или адаптации птичьего штамма вируса гриппа к человеку («испанка» 1918-1919 гг.) (Claas E.C., 2000).
Грипп птиц в XXI веке приобретает значение мировой проблемы, поскольку вирус гриппа преодолел межвидовые барьеры и обрел способность вызывать заболевание у человека, как это случилось в 1997 г. в Гонконге (Claas E.C. et al., 1998; Osterhaus A.D. et al., 2002), в декабре 2003 г. в Юго-Восточной Азии, вызвав вспышки заболевания в разных странах (Бектимиров Т.А., 2005; Львов Д.К. и др., 2006; Соминина А.А. и др., 2006; Tarantola A. et al., 2010). В дальнейшем оказалось, что вирусы гриппа А/H5N1, выделенные от заболевших в 2004 г., подверглись дополнительной мутации. Большая часть мутировавших вирусов оказались резистентными к римантадину (Тимченко В.Н., Чернова Т.М., 2008). В 2005 г. и первом квартале 2006 г. зарегистрированы заболевания гриппом А/Н5N1 среди перелетных и домашних птиц на территории РФ (Ющук Н.Д. и др., 2007).
По данным ВОЗ на 29 декабря 2010 года заболеваемость человека гриппом птиц зарегистрирована в 58 странах мира, а общее количество вирусологически подтверждённых случаев заболевания людей, вызванного штаммами субтипа А/H5N1, составило 512, из которых 304 (60%) закончились летальным исходом, при этом среди детей до 15 лет летальность при гриппе А/H5N1 достигает 89% (ВОЗ).
В ходе исследований было отмечено, что у инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 людей и лабораторных животных развивается острый респираторный дистресс-синдром и ранний интерстициальный фиброз легких (Шестопалова Л.В. и др., 2008; To K.F., et al., 2001; Kortweg C., Gu J. et al., 2008; Qiao J. et al., 2009). Фиброз легких, развивающийся в столь короткие сроки и не характерный для острых инфекций, является одним из осложнений, приводящих к инвалидизации и ведущим к смерти больных. Феномен раннего (в остром периоде инфекционного заболевания) фиброза представляет большой интерес с позиций общей патологии, особенно при вирусной инфекции, поскольку патогенез его не изучен. Имеются лишь отдельные сообщения феноменологического характера о раннем фиброзе при инфицировании вирусом гриппа A/H5N1. Его высокая потенциальная опасность для человека, резистентность к немногочисленным противовирусным препаратам и плохо изученный патогенез предполагает актуальность дальнейшего детального изучения патогенеза данного заболевания. В частности, большой интерес представляет ранний фиброз легких – одно из важнейших патогенетических факторов, обусловливающих высокую летальность в связи с развитием острой легочной, а затем сердечной недостаточности у инфицированных людей и животных.
Цель исследования. Исследовать молекулярно-клеточные и патоморфологические особенности фиброгенеза легких после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 мышей линии C57Bl/6.
Задачи исследования:
-
Методом флуоресцентной микроскопии и с помощью ИГХ анализа изучить топологию вируса.
-
Изучить общие патоморфологические изменения в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в процессе развития заболевания.
-
Исследовать масштабы фиброза в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.
-
Изучить содержание различных типов коллагена в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.
-
Изучить изменения количества фибробластов, оценить их пролиферативную, «фибропластическую активности» в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.
-
Изучить особенности экспрессии факторов роста и их рецепторов, провоспалительных цитокинов, матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в патогенезе раннего фиброза легких у мышей линии С57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.
Научная новизна. Впервые в эксперименте исследованы изменения и вероятные механизмы нарушения и восстановления структурно-функционального гомеостаза в легких в целом и системе соединительной ткани (внеклеточного матрикса) легких мышей линии C57Bl/6 после их инфицирования высокопатогенным штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05. Показано, что характер деструктивных процессов помимо цитопатических эффектов вируса детерминирован вторично развивающимися патологическими структурно-функциональными изменениями, детерминирующими и усиливающими состояние гипоксии клеток и структур легких и в целом в организме.
Впервые показано, что инфицирование животных этим вирусом сопряжено с инфицированием их фибробластов и макрофагов. При этом получены свидетельства того, что инфицирование этих клеток вирусом A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 является триггерным механизмом для «запуска» процессов пролиферации фибробластов, увеличения их численности, экспрессии MMPs и их ингибиторов (MMP-2, MMP-9, MMP-10, TIMP-2) фибробластами и макрофагами легких, регулирующих процессы обмена структур внеклеточного матрикса, поскольку изменения величин, характеризующих эти процессы, не имели очевидной корреляционной зависимости от уменьшения количества инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 фибробластов.
Впервые показано, что в рассматриваемой экспериментальной модели раннее фиброзирование легких детерминировано дисрегуляцией, вероятно, неспецифических механизмов репаративной (substitucio) регенерации и механизмов гомеостазирования в системе соединительной ткани, возможно в связи с продолжающейся персистенцией вируса в исследованных и иных клетках организма. Впервые показано, что усиление фибробластами легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 экспрессии провоспалительных цитокинов (TNF- и IL-6) сопряжено с усилением процесса воспаления и в итоге усилением фиброзирования легких.
Научно-практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о том, что основным фактором, индуцирующим и поддерживающим раннее фиброзирование в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 является инфицирование фибробластов и продолжающееся персистирование в них и макрофагах вируса, приводящее к дискоординации процессов гомеостазирования в системе соединительной ткани легких. Эти данные указывают на необходимость разработки средств профилактики проникновения вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетки, в частности фибробласты и макрофаги или разработку средств эффективного уничтожения вирусов. Полученные результаты уточняют ряд патогенетических механизмов повреждения легких и развития одного из основных осложнений, в частности раннего фиброза легких, дополняют традиционные представления об этапах развития воспаления, в частности его репаративной фазы при инфицировании млекопитающих вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.», госконтракт № 02.740.11.0709.
Положения, выносимые на защиту:
-
Инфицирование мышей линии C57Bl/6 вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с персистированием его в фибробластах и макрофагах, развитием деструктивных процессов в легких, сопряженных с развитием вторичной острой гипоксии, обусловленной как дыхательной недостаточностью, так и формирующимся капиллярно-паренхиматозным блоком, препятствующим газообмену. Это является триггерным фактором для формирования патогенетической цепи дисрегуляторных и метаболических изменений в системе соединительной ткани легких, а продолжающаяся дискоординация процессов гомеостазирования в ней поддерживается персистенцией вируса в этих клетках.
-
Процессы раннего фиброзирования индуцированы вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 и поддерживаются развившейся гипоксией, ранней и активной пролиферацией фибробластов легких, их дифференцированием и последующим увеличенным синтезом структур внеклеточного матрикса: коллагеновых, ретикулярных и эластических волокон, коллагенов I, III, IV и VI типов.
-
Процесс фиброзирования легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 регулируется ростовыми факторами FGF и EGF и их рецепторами, экспрессируемыми как самими фибробластами, так и макрофагами. Фиброз как процесс неполноценной репарации легких (substitucio) развивается после повреждения, а также в ответ на острую гипоксию и обусловлен дискоординацией процессов гомеостазирования в системе соединительной ткани в связи с недостаточной активностью ММРs (MMP-2, MMP-9, MMP-10), ограничиваемых высокой экспрессией TIMP-2. Экспрессия фибробластами провоспалительных цитокинов TNF- и IL-6 усугубляет фиброзирование легких через механизм стимуляции пролиферации фибробластов и продуцирование ими структур внеклеточного матрикса.
Внедрение результатов работы в практику. Основные положения работы внедрены в практику преподавания на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрав России в раздел «Воспаление», «Инфекционные болезни», «Регенерация».
Апробация работы. Материалы исследований доложены на IV Международной Научно-практической Конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы: 65 отечественных и 212 зарубежных источников. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 33 рисунка. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
