Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1. Липиды морских беспозвоночных 6
2. Липиды моллюсков 19
3. Сезонные изменения липидного состава беспозвоночных 23
4. Липиды нервной системы 27
Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 33
Глава III. МОРФОЛОГИЯ НЕЙРОНА 38
1. Половой цикл -самки 38
2. Рост ооцитов и .ядерно-плазменные отношения . 40
Глава ІV. МОРФОЛОГИЯ НЕРВНЫХ ГАНГЛИЕВ МВДИИ ГРЕЯ 45
1. Строение узла 49
2. Величина нейронов 49
3. Ультраструктура нейрона 50
4. Липидные включения 59
5. Нейросекреторные включения 63
6. Секреторный цикл клетки 70
7. Число секретирующих нейронов 72
Глава V. БИОХИМИЯ ЛИПИДОВ 81
1. Общие липиды 81
2. Жирные кислоты 84
3. Фосфолипиды 92
4. Нейтральные липиды 101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108
ВЫВОДЫ 113
ЛИТЕРАТУРА 115
Введение к работе
Актуальность работы. Размножение концентрирует главные v черты биологии вида и господствует над всеми другими явлениями жизни. Периодическая репродукция половых клеток - материальная основа размножения - проходит у двустворчатых моллюс- V ков при участии центральной нервной системы (Мотавкин П.А., Вараксин А.А., 1983). Ее нервные клетки вырабатывают нейро-гормоны, продукция которых коррелирует с размножением и ростом гамет (Вараксин А.А., 1977). По-своему химическому составу неиросекреторныи материал может быть липо- или гликопротеи-дом (Поленов А.Л., 1971). Было отмечено, что у большинства двустворок, исключая подвижных гребешков, ключевым цитоплазма-тическим включением являются липиды (Скадовская П.С., 1937; Мотавкин П.А., Вараксин А.А., 1983), которые,надо полагать, входят в состав нейросекреторного материала и, кроме того, обеспечивают энергией синтез и выведение гормонов. Между тем, данных о составе липидов ВДС двустворок, динамике этих веществ в зависимости от половой активности, времени года, синтетической активности нет (Крепе Е.М., 1967, 1981). Лишь в единичных оригинальных работах (Крепе Е.М. и др., 1963;кгерв et al., 1968; Haley et al., 1976) описаны отдельные классы липидов ЦНС, главным образом фосфолипиды у unio crassa и му-tiius eduiis. Полное отсутствие подобных сведений о нервных р ганглиях мидии Грея определило выбор и направление наших исследований.
Пель и задачи исследования. Показать у мидии Грея измен-
чивость структуры нейрона, его секреторной активности и липид-ного состава в зависимости от половой активности моллюска. В работе решались следующие задачи:
изучить морфологию гонады на основных стадиях полового цикла;
исследовать структуру и секреторную активность нейронов;
с помощью гистохимических методов выявить лабильность липид-ных включений в нейронах;
установить основные классы липидов и их динамику.
Научная новизна и теоретическое значение. Впервые у 466 самок мидии Грея на пяти стадиях полового цикла (половая инертность, начало развития, активного гаметогенеза, преднерестовая и нерестовая) изучена ультраструктура, секреторная активность и липидный состав цереброплевральных, висцеральных и педальных ганглиев ЦНС. Установлена динамика общих липидов, 26 жирных кислот, фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, церамидаминоэтилфосфонат, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, лизофосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилхолин, дифосфатидил-глицерин, фосфатидная кислота) и нейтральных липидов (холестерина, свободных жирных кислот/ триглицеридов, эфиров холестерина). Показано, что количественное содержание липидов в ганглиях находится в соответствии с секреторной активностью нейронов и коррелирует с ростом ооцитов.
Практическая ценность. Мидия Грея является одним из перспективных видов для марикультуры на Дальнем Востоке. Предприняты попытки наладить непрерывное воспроизводство моллюсков вне сезонов размножения, путем стимулирования гаметогенеза адекватной температурой (Викторовская Г.И. и др., 1983). Зависимость между структурой, секреторной функцией, липидным составом ганглиев и морфологией гонады, установленная нами в настоящей работе, можно использовать для оценки общего состояния моллюска и эффективности регуляции гаметогенеза на основе гис-
тологии половой железы. В тех случаях, когда регуляция окажется недостаточной, ее лекарственная и гормональная корреляции могут быть проведены, исходя из уровня развития гамет. Нейро-гормоны мидии способны стимулировать рост и плодовитость некоторых млекопитающих (Мотавкин П.А. и др., 1975) и перспективны для использования в животноводстве и медицине. На основе данных настоящей работы максимальное содержание неирогормонов приходится на пятую стадию гаметогенеза, соответствующую маю; это время следует считать оптимальным для получения гормонов в наибольшем количестве.
Полученные нами данные дополняют характеристику вида, итоги изучения которого подведены ранее в содержательной монографии "Биология мидии Грея" (М.: Наука, .1983, 150 с, ответственный редактор В.А.Свешников).
Липиды морских беспозвоночных
Лшшды морских беспозвоночных благодаря особенностям своего состава давно привлекают внимание исследователей. К настоящему времени литературные данные о липидах морских организмов представлены В ряде работ ( Zama, 1963; Giese, 1966; Vaskovsky, Kostetsky, 1969; Yamada, 1972; Hayashi, Yamada, 1973; Oudejens, Horst van der, 1974; Masayuki, 1975; Васьковский Б.Е. и др., 1976; Костецкий Э.Я., 1978; Johns et al., 1980; Tagaki et al., 1980; Ромашина H.A., Васьковский B.E., 1982; Костецкий Э.Я., Шипунов Ю.А., 1983).
Одни из этих работ посвящены изучению общих липидов ( Lo-vern, 1964; Hayashi, Yamada, 1973; Костецкий З.Я., 1978), другие - исследованию только фосфолипидов, гликолипидов, нейтральных липидов или жирнокислотному составу морских беспозвоночных ( Vaskovsky, Kostetsky, 1969; Horst van der, Voogt, 1969; Vaskovsky et al., 1970; Isono, Isono, 1975; Johns et al., 1980; Костецкий З.Я., 1982; Левитина M.В., 1983).
По некоторым данным,липидный компонент тела беспозвоночных Составляет 4,3$ у СамОК И 5,1$ у СаМЦОВ ( Parshad, Guraya, 1977).
Количество липидов в различных органах далеко неодинаково. При исследовании химического состава промысловых моллюсков и иглокожих Сахалинского района было отмечено (Леванидов И.П., Захарова В.П., 1968), что наибольший процент общих липидов содержится в печени (до 20,5$), в то время как в других органах липидов значительно меньше (0,2-0,6$). Японские авторы Tsujuki, Mochisuki (1966) сравнивали липидный состав съедобных и несъедобных частей МОРСКОГО ежа Acantocidaris crassispina И нашли, что первые имеют 9,5$ липидов (на сырой вес), а вторые ТОЛЬКО 2$. Hayashi, Yamada (1973), Изучая ЯПОНСКОГО гребешка Chlamys nipponensis установили, что ткани и внутренние органы содержат от 1,5$ до 4,6$ липидов соответственно. Авторы предполагают, что липидный состав японского гребешка в значительной мере определяется характером фитопланктона, используемого этим моллюском в пишу, Б составе липидов морских беспозвоночных установлены: фосфолипиды, гликолипиды, нейтральные липиды, жирные кислоты с высокой степенью ненасыщенности. У многих беспозвоночных фосфолипиды являются главным компонентом липидов (Simon et ai», 19676; Yasuda, 1967; Костецкий Э.Я., 1978),
Материал и методы
Кусочки гонады заливали в парафин. Срезы толщиной 6 мкм, полученные на микротоме, окрашивали гематоксилином Эрлиха с докраской эозином и железным гематоксилином по Гейденгайну. На каждой стадии полового цикла измеряли объемы клеток их ядер и ядрышек. Размеры клеток их ядер и ядрышек вычисляли по формуле эллипсоида V=-g Do где Ъ - больший, d - меньший диаметры, проекции клеток получены с помощью рисовального аппарата РА-4.
Для электронно-микроскопического исследования нервные ганглии фиксировали 2,5$ раствором глутаральдегида на фосфатном буфере рН 7,8, содержащим 0,5$ раствор нейтрального формалина, 17$ сахарозы при 4 в течение двух часов. Затем промывали в фосфатном буфере рН 7,8 с сахарозой в течение 12-14 часов. До-фиксапига проводили в 1$ растворе четырехокиси осмия на фосфатном буфере, содержащим 27$ сахарозы. После обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации кусочки заливали в ЗШН 812. С залитых блоков готовились срезы на ультратоме LKB (Ш модель). Срезы контрастировали 2$ уранилацетатом и нитратом свинца ( Reynolds, 1963), просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-юов.
Для биохимических исследований нервные ганглии заливали смесью хлороформ: метанол 2:1 и хранили в темной посуде при 0 до момента полного сбора материала каждой стадии. Липиды извлекали по методу Polch et al. (1957). Полученные липидные экстракты использовались для исследования общих фосфолипидов, фос фолипидных и нейтральных фракций липидов. Концентрацию липи-дов в экстракте определяли бихроматным методом ( Amenta, 1964). Количество фосфолипидов определяли с помощью молибдатного реактива по методу Васьковского с соавт. (1975).
Половой цикл -самки
Состояние половых желез самок оценивали по шкале зрелости, цредлояенной Дзюба СМ. (1972), в которой автор выделила 5 стадий: половой инертности, начало развития, активного гаметогене-за, преднерестовую и нерестовую.
Первая стадия (I) - "половой инертности" (рис. la). У ми-дии-эта стадия короткая и занимает не более двух недель второй половины сентября. Гонады небольшие, дряблые, ацинусы маленькие неправильной формы. Межацинусная соединительная ткань сильно разрастается, в ней появляются мышечные волокна. В просветах ацинусов видны 1-4 оопита, оставшиеся после нереста и единичные молодые ооциты новой генерации. Визуально пол не определяется.
Вторая стадия (П) - "начало развития" (рис. 16) - протекает на протяжении октября. Половые железы небольших размеров светло-оранжевые или слабо-розовые. Ацинусы варьируют в размерах. Наряду с мелкими пристеночными ооцитами в железе много свободнолежащих клеток. Часть из них закончила рост; отмечается резорбция отдельных ооцитов, достигающих максимальной величины. Пол визуально не определяется.
Третья стадия (Ш) - "активный гаметогенез" (рис. 1в) -продолжается с ноября до апреля и составляет большую часть полового цикла. Гонады крупные, плотные, желтого, розового или светло-оранжевого цвета. Происходит усиленное разрастание половой железы за счет образования новых ацинусов. Процессы резорбции приводят к снижению количества свободнолежащих ооцитов, однако число клеток на начальных этапах роста продолжает нарастать.
Липидные включения
Липидные включения под световым микроскопом видны в виде мелких гранул размером 0,5-1 мкм, разбросанных в цитоплазме без особой закономерности (рис. 13). Усиленное депонирование липидов приводит к слиянию гранул в капли диаметром 5-7 мкм, заполняющими порой всю цитоплазму нейрона от ядерной оболочки до плазматической мембраны (рис. 14).
Под электронным микроокопом цитоплазматические включения видны как правильно очерченной формы гранулы интенсивно черного цвета, одетые мембраной. Величина гранул колеблется от I до 1,8 мкм (рис. 17, 18). Увеличение содержания липидов в нейроне имеет определенную закономерность. В начале появляются клетки, цитоплазма которых содержит отдельные мелкие гранулы. Такие нейроны характерны для I стадии полового цикла (рис. 13). За тем появляются клетки, в которых эти гранулы слились в пери-нуклеарный ободок. Эти нейроны встречаются постоянно, но их особенно много на III и ІУ стадиях полового цикла (рис. 14). Далее липидные включения заполняют всю цитоплазму, оттесняя ядро на периферию; такие клетки преобладают на П и У стадиях (рис. 15, 16). Наибольшее число клеток с липидами на П и У стадиях полового цикла соответствует максимальному накоплению их каждой клеткой (рис. 19, табл. 14). Имеющиеся различия в содержании клеток с липидами не существенны. Обычно глиальные клетки лишены липидных включений. Только в отдельных глиоцитах эти вещества появляются на П и У стадиях и открываются под электронным микроскопом в виде капель неправильной формы (рис. 20).
Общие липиды
Содержание общих липидов в цереброплевральных, висцеральных и педальных ганглиях меняется с одинаковой закономерностью по стадиям полового цикла (рис. 27, табл. 16).
На I стадии отмечается наименьшее содержание липидов во всех узлах, что соответствует сравнительно небольшому числу нейронов с липидами. Гистохимические исследования убеждают в том, что липиды в основном входят в состав нейронов. На П стадии количество общих липидов в педальных ганглиях увеличивается на достоверную величину (Р 005). На Ш стадии полового цикла содержание общих липидов возрастает еще более значительно. Во всех узлах увеличение этих веществ синхронизировано, хотя общее их количество больше в цереброплевральных и висцеральных узлах, чем в педальных. На следующем этапе развития гонады (17 стадия) содержание липидов во всех узлах довольно резко падает, вплоть до уровня, характерного для I стадии. Новый,самый высокий, подъем в содержании общих липидов свойственен для У стадии. Следует отметить, что увеличение липидов происходит в узлах довольно стремительно. На графике (рис. 26) видно, что прямая, отображающая этот процесс, круто поднимается вверх и достигает апогея к началу нереста. Увеличение липидов, как и на предыдущих стадиях, синхронизировано по всем узлам. Зтот факт особенно ярко указывает на то, что колебание липидов одинаково в ганглиях и имеет, видимо, одну и ту же причину.
