Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор сифоновых и сифонокладовых водорослей и состояние изученности процессов их посттравматической регенерации 7
1.1. Цитологическая и морфологическая организация, географическое распространение 7
1.2. Адаптация к неблагоприятной среде. Состояние изученности процессов посттравматической регенерации 14
ГЛАВА 2. Материалы и методы 24
2.1. Изученный материал 24
2.2. Методы исследований 26
ГЛАВА 3. Формирование протопластов у сифоновой водоросли bryopsis plumosa (huds.) ag. и их роль 36
3.1. Формирование протопластов 38
3.2. Условия, определяющие образование жизнеспособных протопластов 42
3.3. Последовательность процессов агглютинации клеточных компонентов и формирования плазматической мембраны 51
3.3.1. Агглютинация клеточных компонентов 51
3.3.2. Формирование плазматической мембраны протопласта 59
3.3.3. Характеристики первичной полисахаридной оболочки 65
ГЛАВА 4. Формирование и роль протопластов у сифонокладовои водоросли chaetomorpha aerea (dillw.) kutz 69
4.1. Формирование протопластов 72
4.2. Условия, определяющие образование жизнеспособных протопластов 79
4.3. Последовательность процессов агглютинации клеточных компонентов и формирования плазматической мембраны 83
4.3.1. Агглютинация клеточных компонентов 83
4.3.2. Формирование плазматической мембраны протопласта 88
ГЛАВА 5. Формирование и роль протопластов у сифонокладовои водоросли microdictyon umbilicatum (velley) zanard 94
5.1. Формирование протопластов 96
5.2. Условия, определяющие образование жизнеспособных протопластов 103
5.3. Последовательность процессов агглютинации клеточных компонентов и формирования плазматической мембраны 107
5.3.1. Агглютинация клеточных компонентов 107
5.3.2. Формирование плазматической мембраны протопласта 108
ГЛАВА 6. Процессы формирования протопластов у других представителей сифоновых и сифонокладовых водорослей 112
6.1. Обоснование выбора видов и их характеристика 112
6.2. Специфические особенности формирования протопластов изученных видов и их значение для воспроизводства 118
Заключение 126
Выводы 130
Литература 133
- Адаптация к неблагоприятной среде. Состояние изученности процессов посттравматической регенерации
- Формирование плазматической мембраны протопласта
- Последовательность процессов агглютинации клеточных компонентов и формирования плазматической мембраны
- Условия, определяющие образование жизнеспособных протопластов
Введение к работе
Сифоновые и сифонокладовые водоросли относятся к древним, первично морским представителями отдела Chlorophyta. Они характеризуются специфической организацией и принципиально отличаются от других зеленых водорослей, прежде всего тем, что не имеют настоящего клеточного строения. Их слоевище - это либо одна гигантская, обычно многоядерная клетка-сифон, лишенная клеточных перегородок, либо разделенное перегородками на многоядерные сегменты образование. Уникальное цитологическое строение сифоновых и сифонокладовых водорослей определило возможности широкого использования их как модельных объектов для изучения внутриклеточных и молекулярных процессов (Menzel, 1988; Graham, Wilcox, 2000). Появление новых сведений об особенностях жизнедеятельности и адаптации к окружающей среде гигантских клеток интересно с точки зрения формирования представлений о биологическом разнообразии живых организмов и необходимо для дальнейшего развития клеточной биологии.
Основным районом географического распространения сифоновых и сифонокладовых водорослей являются теплые воды Мирового океана. В морях Российского Дальнего Востока их флора представлена 7 родами и 12 видами (Клочкова, 1998). Большинство этих видов характеризуются короткими сроками вегетации, высоким репродуктивным потенциалом и широкой экологической пластичностью. Вследствие этого они устойчивы к неблагоприятному воздействию среды.
В ненарушенных сообществах макрофитобентоса присутствие сифоновых и сифонокладовых обычно невелико. При загрязнении, особенно органическом, наблюдается возрастание ценотической роли этих и других зеленых водорослей, и на определенном этапе изменений растительного покрова к ним переходит безраздельное доминирование. Подобные явления были зарегистрированы в разных районах Мирового океана и получили название «зеленые приливы». На российском Дальнем Востоке они были описаны для Авачинской губы (Klochkova, Klotchkova, 1998; Клочкова, Березовская, 2001), но, судя по всему, имеют более широкое распространение. В связи с участием сифоновых и сифонокладовых водорослей в формировании зеленых приливов изучение биологии их развития приобретает практическое значение.
Известно, что среди живых организмов лишь очень немногие не имеют типичного клеточного строения. Они, так же как и организмы с обычным клеточным строением, подвержены травматизму. Но для многоклеточных наземных растений даже обширные травмы не являются смертельными. У них в поврежденном месте формируются прилегающие к ране защитные и восстановительные ткани, а регенерация отдельных клеток становится маловажной (Lipetz, 1976; Buggeln, 1981). Выживание же организма, состоящего из одной гигантской клетки-сифона, либо нескольких крупных клеточных сегментов, безусловно, зависит от их способности к регенерации.
Способы регенерации частично поврежденных сифоновых и сифонокладовых водорослей начали изучаться давно. Почти все проводившиеся в этом направлении исследования касались регенерации небольших разрывов клеточной стенки и восстановления частично деформированной плазматической мембраны, когда почти вся протоплазма оставалась внутри клетки. В случае истечения протоплазмы из сифона в морскую воду она, как полагали, должна погибнуть. Обобщающая информация по этому вопросу приводится в работе Д. Мензеля (Menzel, 1988).
Уникальную способность сифоновой водоросли Bryopsis plumosa образовывать протопласты из вытекшей in vitro протоплазмы впервые обнаружили японские ученые М. Татеваки и К. Нагата (Tatewaki, Nagata, 1970) и К. Кобаяши и Ю. Канаизука (Kobayashi, Kanaizuka, 1985). Их эксперименты показали, что при обширном повреждении клеточного сифона вытекшая из него протоплазма не погибает, а сжимается в компактную массу и формирует протопласт, который далее прорастает в обычное растение видоспецифической морфологии. Таким образом, несовместимое с жизнью повреждение гигантской клетки приводило к прекращению ее существования, но с другой стороны, в результате внутриклеточных процессов преобразования протоплазмы появлялось большое количество новых жизнеспособных клеток.
Открыв само явление преобразования вытекшей протоплазмы В. plumosa, упомянутые ученые не изучили детали этого процесса на молекулярном и клеточном уровнях (Tatewaki, Nagata, 1970; Kobayashi, Kanaizuka, 1985). Сделанное ими открытие поставило перед альгологами целый ряд новых вопросов: уникально ли обнаруженное явление среди сифоновых водорослей, свойственно ли оно сифонокладовым водорослям, существуют ли закономерности процесса формирования протопластов и в чем они проявляются. Решению этих и других, важных с научной и практической точек зрения задач посвящено настоящее исследование.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение формирования протопластов на молекулярном и клеточном уровнях и их дальнейшей роли в регенерации клеточных сифонов у сифоновых и сифонокладовых морских зеленых водорослей.
Для достижения поставленной цели было необходимо решение следующих задач:
1. С целью определения закономерностей и специфических особенностей процессов формирования протопластов представителей класса Siphonophyceae на основе изучения их разнообразия и распространения выбрать для изучения виды с разным уровнем морфологической организации таллома;
2. Изучить процесс формирования протопластов сифоновых водорослей, определить имеет ли место формирование протопластов у сифонокладовых водорослей;
3. Определить механизм агглютинации клеточных компонентов с помощью методов цитохимического и молекулярного анализов;
4. Установить последовательность процессов агглютинации клеточных компонентов и формирования плазматической мембраны протопласта у разных видов водорослей;
5. Определить корреляцию между размерами образовавшихся протопластов и их выживаемостью и изучить влияние факторов среды на течение процессов формирования протопластов;
6. Изучить процессы формирования протопластов у разных по морфологической сложности представителей класса Siphonophyceae и определить их общие закономерности;
7. Оценить значение феномена для воспроизводства жизнеспособного потомства и сохранения видового разнообразия этих таксономических групп.
Получение в ходе исследования новых данных позволило сформулировать следующие основные положения, выносимые на защиту:
- агглютинация вытекших in vitro клеточных компонентов (органел, ядер и жидкого вещества протоплазмы) в протоплазматические массы происходит посредством образования комплементарной лектинно-углеводной связи;
- у протопластов в течение нескольких часов с момента их формирования отсутствует плазматическая мембрана. Ее регенерация происходит в 3 этапа (1 - появление полисахаридной либо полисахаридно-белковой оболочки; 2 - ее преобразование в полисахаридно-липидную оболочку; 3 — формирование липидно-белковой мембраны). При этом используется разрушенная плазматическая мембрана материнского растения;
- у изученных сифоновых и сифонокладовых водорослей наиболее высокую
выживаемость имеют те из образовавшихся протопластов, размеры которых близки к размерам зооспор соответствующих видов;
— процесс дальнейшего развития появившихся из протопластов клеток зависит от морфологической сложности талломов исходных растений;
— сформированные in vitro протопласты сифоновых и сифонокладовых морских зеленых водорослей выполняют регенеративную и репродуктивную функции.
Благодарности. Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю, д.б.н. А.А. Вараксину за всю оказанную им помощь.
Особо я признательна профессору Национального университета Конджу, Южная Корея Г.Х. Киму (Ph.D., Prof. Kim Gwang Hoon, Kongju National University, Korea), в лаборатории которого мне посчастливилось работать, за его постоянное внимание к моим исследованиям, возможность использовать научное оборудование, необходимые материалы и научную литературу по данному вопросу.
В 1997 г. автору довелось принимать участие в экспедиционных исследованиях лаборатории альгологии КФ ТИГ ДВО РАН в разных районах Авачинского залива (юго-восточная Камчатка). Помощь в сборе материала оказывали сотрудники лаборатории и водолазы ООО «Подводремсервис». В 1998 г. автор работала в Корфо-Карагинском районе у о. Карагинский и в зал. Анапка. За помощь в организации экспедиционных исследований благодарю сотрудников КамчатНИРО д.б.н. Н.Г. Клочкову и д.б.н. Н.И. Науменко.
Работа выполнена в рамках плановой темы НИР лаборатории альгологии КФ ТИГ ДВО РАН «Изучение водорослей-макрофитов Северо-Западной Пацифики» (шифр: 2.33.1, 2.33.6). Цитохимические и молекулярные исследования проводились при финансовой поддержке KOSEF (grant Н00010, руководитель Г.Х. Ким).
Адаптация к неблагоприятной среде. Состояние изученности процессов посттравматической регенерации
Сифоновые и сифонокладовые водоросли относятся к одному из крупнейших отделов водорослей - Chlorophyta (зеленые), который характеризуется наличием ассимиляционных пигментов зеленого цвета, некоторыми специфическими особенностями клеточной организации, размножения и строения генеративных структур (Голлербах, 1977). В соответствии с геологическими данными, некоторые сифоновые зеленые водоросли поддерживали неизменные экологические ниши и морфологическое строение со времени мелового периода (Deloffre, Genot, 1982). Растения с сифоновым и гигантским одноклеточным строением были найдены также в отложениях силурийской эры (Schopf, 1970; Таррап, 1980; Bassoulet et al, 1983). Эти находки свидетельствуют о древнем происхождении представителей класса Siphonophyceae.
Морфологическая организация сифоновых и сифонокладовых водорослей достаточно разнообразна. Это — стелющиеся или прямостоячие растения. Их размеры изменяются от нескольких сантиметров до нескольких десятков сантиметров, но в большинстве случаев бывают 10-20 см высоты. Самые примитивные представители сифоновых имеют вид беспорядочно разветвленных во всех направлениях кустиков (Bryopsis hypnoides), более высоко организованные - правильное упорядоченное ветвление, например, перистое, пучковатое и др. (В. plumosd). Ветви могут отходить в одной или разных плоскостях, быть свободными или тесно переплетаться и формировать определенные, достаточно сложные в морфологическом и анатомическом отношении структуры. У некоторых видов слоевище может иметь вид одиночного пузыря (род Ventricaria) или стелющихся ризомов и отходящих от них пузырей (род Caulerpa). У некоторых сифоновых наблюдается дифференциация ветвей на генеративные и вегетативные (В. plumosa).
Строение сифонокладовых водорослей менее разнообразное. В примитивном случае это однорядные нити с крупными, обычно хорошо различимыми невооруженным глазом клеточными сегментами, имеющими равные размеры (род Rhizoclonium), или постепенно увеличивающиеся от основания к вершине нити (род Chaetomorpha). Иногда это разветвленные нити (род Cladophora). Ветвление нитей может быть чрезвычайно редким или многократным. Как правило, оно имеет видоспецифические особенности. Боковые ветви у одних видов могут быть свободными. У других, например, у представителей рода Microdictyon, они формируют сеточку. Размеры клеточных сегментов сифонокладовых, представленных разветвленными кустиками, могут колебаться от нескольких сотен до нескольких десятков микрометров в длину и ширину.
Обеим описываемым группам водорослей свойственны все известные у растений типы размножения: вегетативное, половое и бесполое (Scagel, 1966). Вегетативное размножение сифоновых осуществляется фрагментацией и специальными выводковыми почками — пропагулами. У сифонокладовых для этой цели служат акинетоспоры. Кроме того, они могут размножаться фрагментацией слоевища. Бесполое размножение у этих водорослей осуществляется зооспорами, а половое — гаметами.
Изучению циклов развития сифоновых и сифонокладовых водорослей посвящено достаточно большое число работ. Исследованиями разных авторов было показано, что им свойственны как изоморфные, так и гетероморфные диплогаплобионтные жизненные циклы. Обзор приводится в специальных монографиях по водорослям (Hon, 1994; Ноек et al., 1995).
Единой общепринятой таксономической системы зеленых водорослей до сих пор не существует, и классифицируют их по-разному. При этом сифоновые и сифонокладовые водоросли практически все систематики относят к классу Siphonophyceae. От остальных классов Chlorophyta он, как уже говорилось выше, отличается отсутствием у его представителей типичного клеточного строения. У сифоновых водорослей (порядок Siphonales) все крупное, достаточно сложно организованное, иногда даже причудливое по морфологии слоевище представляет собой одну гигантскую клетку. У сифонокладовых (порядок Siphonocladales) клеточный сифон поделен перегородками на отдельные крупные участки, которые в российской альгологической литературе принято называть клеточными сегментами (Виноградова, 1979).
Гигантские клетки и клеточные сегменты у представителей Siphonophyceae редко содержат одно ядро (род Acetabularid). Чаще они имеют множество ядер и, следовательно, представляют собой не одноклеточные организмы в обычном понимании этого слова, а комплекс не вполне разделившихся между собой клеток (Виноградова, 1977). При образовании таких клеток ядерные деления не сопровождаются цитокинезом, в результате чего возникает ценоцитный многоядерный таллом, или так называемая сифональная организация. Во время кариокинеза все ядра делятся синхронно. Примечательно, что центральная вакуоль у этих водорослей занимает более 90 % от общего объема клетки или клеточного сегмента (South, Whittick, 1987). Указанные выше признаки клеточной организации отчетливо очерчивают обсуждаемый класс и отделяют его от других классов Chlorophyta.
При делении класса Siphonophyceae на порядки наблюдается также различие точек зрения, и разными альгологами в нем выделяется различное их количество. Так С.К. Тзенг (Tseng, 1983), описывая тихоокеанскую флору Китая, делит класс на 3 порядка: Cladophorales,Siphonocladales и Codiales. П. Сильва с соавторами в ревизиях морской бентосной флоры Филиппин (Silva et al., 1987) и флористической сводке по бентосной флоре Индийского океана (Silva et al, 1996), разделили класс на порядки Cladophorales и Bryopsidales. Кодиевые на уровне семейства (Codiaceae) они включили в порядок Bryopsidales, в то время как в системе С.К. Тзенга кодиевые были вьщелены в особый порядок Codiales, а бриопсиевые (Bryopsidaceae) были включены в него в качестве семейства.
Американские исследователи И. Абботт и Г. Холленберг (Abbott, Hollenberg, 1976) при описании североамериканской тихоокеанской флоры низкоумеренных и субтропических широт выделили те же 3 порядка, что и С.К. Тзенг. В последней крупной флористической сводке по флоре Южной Кореи (Lee, Kang, 2001) класс Siphonophyceae был разделен также на 3 порядка: Cladophorales, Siphonocladales и Codiales.
Для российской части Дальнего Востока таксономическая ревизия флоры Chlorophyta была проведена К.Л. Виноградовой (1979). На основании анализа эколого-географических особенностей, различий в структуре и химическом составе клеточных стенок, характере протопласта, клеточного деления, а также с учетом ранних стадий онтогенеза зеленых водорослей отдел Chlorophyta был разделен ею на 2 класса: Chlorophyceae и Siphonophyceae. В последнем были выделены 3 порядка: Siphonales, Siphonocladales и Dasycladales (Виноградова, 1977, 1984). При этом было обосновано выделение бриопсиевых, кодиевых и кладофоровых в статусе семейств, входящих в состав двух первых порядков. Далее в своей работе мы придерживаемся таксономической системы Chlorophyta, разработанной К.Л. Виноградовой, и рассматриваем сифоновые и сифонокладовые водоросли в качестве порядков класса Siphonophyceae.
Формирование плазматической мембраны протопласта
Затем они трижды промывались искусственной морской водой и еще 30 мин выдерживались в растворе детергента Triton Х-100 (0,1 %). После этого растения вновь промывались искусственной морской водой и прокрашивались в течение 30 мин флуорохромом FITC-phalloidin (Sigma, U.S.A), растворенным в ацетоне в концентрации 1 %. Подготовленные образцы изучали под лазерным сканирующим микроскопом.
Для окрашивания плазматической мембраны протопластов использовали флуорохром l-(4rimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-a, 3,5-hexatriene (ТМА-DPH, Sigma), растворенный в CiHsSO (DMSO, Sigma) в концентрации 3 ммоль (Mulders et al., 1986). Данный препарат окрашивает исключительно плазматическую мембрану, поскольку он концентрируется только между двумя ее фосфолипидными слоями (Mulders et ah, 1986). Протопласты изучали под флуоресцентным микроскопом с использованием ультрафиолетового фильтра (U-MWG).
Для окрашивания внутриклеточных липидов использовали флуорохром Nile Red (Nile Blue A Oxazone, Sigma), растворенный в ацетоне в концентрации 3 ммоль (Oparka, Read, 1994). Флуорохром Nile Red также окрашивает мембраны органел и плазмалемму (Oparka, Read, 1994). Препараты изучали под флуоресцентным микроскопом с использованием ультрафиолетового фильтра и лазерным сканирующим микроскопом.
Ядра окрашивались ДНК-специфичным флуорохромом DAPI (4\ 6-diamidino-2-phenylindole, Sigma), растворенным в дистиллированной воде в концентрации 5 мг/мл (Oparka, Read, 1994). Целлюлозная клеточная стенка окрашивалась с помощью Calcofluor White M2R (Sigma; Oparka, Read, 1994). Он разбавлялся в морской воде в концентрации 0,5 мг/мл. Препараты просматривали под флуоресцентным микроскопом с использованием ультрафиолетового фильтра.
Для определения целостности плазмалеммы протопластов использовали флуоресцентный диацетат (fluorescein diacetate, Sigma) и йодид пропидиума (propidium iodide, Sigma). Эти красители широко используются для выявления живых и мертвых клеток и определения целостности плазмалеммы (Oparka, Read, 1994). Флуорохромы разводились в одинаковой концентрации, 1 мг/мл, первый в ацетоне, второй в дистиллированной воде. Протопласты исследовали под флуоресцентным микроскопом с использованием голубого фильтра (U-MWIG) и под лазерным сканирующим микроскопом.
Во всех случаях, кроме окрашивания мембран органел и актина, препараты выдерживались в растворах флуорохромных красителей в течение 1-5 мин.
Выделение лектина бриохилин. Специфический лектин, вовлеченный в процесс агглютинации клеточных компонентов В. plumosa, был выделен в ходе аффинной хроматографии (Bollag, Edelstein, 1991) с использованием N-ацетил-глюкозамин-агарозной аффинной колонки. В начале эксперимента готовили концентрированный водорослевый экстракт по указанной выше методике.
Подготовленный водорослевый экстракт заливали в колонку и вьвдерживали в ней в течение 10-12 ч. После этого его удаляли, а колонку промывали раствором искусственной морской воды с рН 8 и соленостью 450 ммоль NaCl для того, чтобы полностью удалить из нее все вещества протоплазмы за исключением специфичного N-ацетил-глюкозамину лектина. Лектин элюировали 0,5 М. раствором N-ацетил-глюкозамина в искусственной морской воде с рН 8 и соленостью 450 ммоль NaCl (10 мл). В ходе этой процедуры каждую из фракций промывки объемом 0,1 мл собирали в отдельные пробирки. Затем проводили электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) для того, чтобы определить наличие лектина в фракциях (Laemmli, 1970; Bollag, Edelstein, 1991).
Фракция, содержащая исследуемый лектин, отделялась, после чего проводился ее повторный электрофорез. Перед электрофорезом лектин обрабатывали 2-меркаптоэтанолом для уменьшения количества дисульфидных связей. Белки на фореграмме окрашивали 0,1 % раствором Coomassie brilliant blue R (Bollag, Edelstein, 1991). Все использованные в ходе экспериментов химические реактивы были приобретены в компаниях Sigma и Bio-Rad Laboratories (Hercules, СА, U.S.A.).
Лизирование оболочки протопластов различными гидролитическими ферментами. Ферменты растворялись в морской воде в следующих подобранных опытным путем концентрациях: целлюлаза (С-8546, Sigma) - 30 мкг/мл; липаза (62301, Fluka BioChemika) - 30 мкг/мл; а-маннозидаза (М-7257, Sigma) - 15 мкл/мл; пектиназа (Р-9179, Sigma) - 100 мкл/мл; Р-глюкозидаза (G-4511, Sigma) - 30 мкг/мл; Р-глюкуронидаза (G-7017, Sigma) - 100 мкл/мл; протеиназа К (V302B, Promega Corporation, Madison) - 10 мкг/мл.
Для проведения экспериментов растения разрушали на предметном стекле в морской воде. Через промежутки времени 1, 3, 6, 9, 12 ч с помощью микроскопа высчитывали точное количество всех образовавшихся на стекле протопластов. Оно принималось за 100 %. Затем обычную морскую воду удаляли, и протопласты заливали раствором морской воды и какого-либо фермента и выдерживали 5 мин при комнатной температуре. Далее определялось количество протопластов с неповрежденными оболочками и высчитывалось их процентное содержание. Опыты ставились в 10-15 кратной повторносте для каждого изучаемого фермента. Статистическая обработка данных проводилась также с помощью стандартной компьютерной программы Microsoft Excel. Для всех рассчитанных значений, как и в описанных выше случаях, определяли стандартные отклонения по выборке.
Последовательность процессов агглютинации клеточных компонентов и формирования плазматической мембраны
При изучении развития люкопластов было обнаружено, что у них может формироваться плазматическая мембрана, а впоследствии даже целлюлозная клеточная стенка. Тем не менее, в течение последующих 20-24 ч после формирования они погибали. Таким образом, из всех структур, появившихся в результате преобразования протоплазмы, выживают только те, которые включают все органеллы и ядра, необходимые для нормального функционирования клетки.
Для того, чтобы выяснить, как влияют на выживаемость протопластов их размеры, в многократной повторности проводился следующий эксперимент. Протоплазма из надрезанного клеточного сифона выдавливалась на предметное стекло со специальной счетной камерой объемом 1 см, наполненной морской водой. По истечении сроков формирования первичной оболочки у всех образовавшихся протопластов замерялись размеры. Далее велось наблюдение за их последующим развитием. По данным этих наблюдений для каждой выделенной нами размерной группы протопластов устанавливалась доля (%) выживших образцов. Статистически обработанные данные этих экспериментов приведены на рис. 9.
Из представленного рисунка видно, что выживаемость образовавшихся структур во многом зависит от их размеров. Размер поперечника у наиболее многочисленных протопластов был близок к 25 мкм. Эта размерная группа составляла почти 17 % от общего количества образовавшихся протопластов. Ни один из протопластов с поперечником меньше 10 мкм не выживал до формирования мембраны. Их выживаемость постепенно снижалась также при размерах свыше 35 мкм. Протопласты с поперечником более 100 мкм обычно дегенерировали на самых ранних стадиях развития.
Таким образом, нами было установлено, что сценарий посттравматического преобразования вытекшей протоплазмы достаточно однообразный. Размер наиболее жизнеспособных протопластов колеблется в пределах 25-55 мкм, и может считаться видоспецифическим для В. plumosa. Среди них наиболее высокая выживаемость была зафиксирована у протопластов размером 30-40 мкм. Примечательно, что он относительно близок к размеру зооспор этого вида, который колеблется от 10 до 30 мкм.
Резкое уменьшение количества живых протопластов, вне зависимости от их размеров, наблюдается в промежуток времени между 6 и 12 ч с момента их образования, т.е. перед завершением формирования мембраны. Погибшие протопласты составляли около 50 % от их первоначального количества, а среди тех, у которых формировалась мембрана, выживали и начинали прорастать не более 80 %. Таким образом, был сделан вывод, что формирование плазмалеммы является фактором, определяющим их выживание.
Для определения способности протопластов к вторичному формированию проводились следующие эксперименты. Через разное время после их формирования (30 мин, 1, 2 ч) их подвергали механическому разрушению. Наблюдения показали, что в случае нарушения целостности их оболочки происходила почти мгновенная дезинтеграция содержимого протопласта: они мгновенно теряли сферическую форму, и освободившиеся клеточные компоненты расплывались в радиальном направлении. Эти эксперименты показали, что формирование протопластов после вытекания материнской протоплазмы может иметь место только единожды.
Для определения влияния водорастворимых веществ протоплазмы на выживаемость протопластов в 10-кратной повторности проводился следующий эксперимент. 1 мл выдавленной протоплазмы центрифугировали в течение 2 мин при скорости 2,000 . Этого было достаточно, чтобы все органеллы и ядра осели на дно пробирки и собрались в плотный комочек. Над ним всегда находилась тонкая прозрачная пленка, в которой, как показало окрашивание флуоресцентным красителем Nile Red, содержалось большое количество липидного материала. Остальное содержимое пробирки составляло около 95 % от общего объема и представляло собой вещество протоплазмы, свободное от органел и ядер. Оно осторожно удалялось, а в пробирку добавлялась морская вода. Содержимое пробирки взбалтывалось и вновь центрифугировалось в течение 2 мин при скорости l,200g. Затем воду удаляли, заменяли новой до объема 1 мл, пробирку встряхивали, и все содержимое переносили в чашку Петри.
Наблюдение за последующим поведением отделенных от водорастворимых веществ протоплазмы компонентов клетки показало, что в присутствии фракции, содержащей липидный материал, они не теряли способности к агглютинации и последующему формированию протопластов. Но при этом размеры образующихся протопластов не превышали 35 мкм в диаметре, а формирование первичной оболочки происходило медленнее, в течение 1 ч, тогда как в присутствии водорастворимой фракции на это, как указывалось выше, требовалось от 10 до 20 мин. Из образовавшихся протопластов около 40 % выжили и проросли в растения видоспецифичной формы. С помощью этого эксперимента было установлено, что участие водорастворимых веществ материнской протоплазмы не является решающим фактором в формировании и выживании протопластов и последующем развитии растений.
Для того, чтобы определить меняют ли условия среды процентное соотношение размерных групп протопластов, и оказывает ли воздействие на их выживаемость химический состав морской воды, были проведены специальные многократные наблюдения за поведение протоплазмы В. plumosa, вьщавленной в среды, имеющие разный ионный состав, рН и соленость. По данным экспериментов были проведены соответствующие статистические расчеты.
Условия, определяющие образование жизнеспособных протопластов
В настоящее время известно, что в процесс сцепления клеток разных организмов или клеток с внеклеточным материалом вовлечены несколько групп молекул, среди которых наиболее изученными являются лектины (Kalthoff, 2001). Это — группа белков-рецепторов, участвующих в клеточной адгезии между клетками или между организмами, посредством их сцепления с определенными сахаридами (Goldstein et al., 1980; Kalthoff, 2001). Они были найдены у большого числа разных организмов: от бактерий до животных (Sharon, Lis, 1989). Известно, что у животных лектины вовлечены в процессы эндоцитоза, внутриклеточного перемещения гликопротеинов, регуляции клеточной миграции и фагоцитоза (Goldstein et al., 1980). Предполагается, что у растений лектины вовлечены в процессы прикрепления азотфиксирующих бактерий к клеткам корневых клубеньков бобовых, защиты растительных клеток от патогенных организмов и регуляции вытягивания клеточной стенки. Однако точно это еще не доказано (Goldstein, Poretz, 1986).
Известно много видов морских водорослей, экстракты которых обладают фитогемагглютинативной активностью (Blunden et al., 1978; Hori et al., 1986, 1988, 1990). Следовательно, лектины у водорослей распространены столь же широко, как у других групп живых организмов. В настоящее время 22 лектина были получены у представителей Rhodophyta, 12 — у Chlorophyta и 1-у Phaeophyta (Hori et al., 1990; Rogers, Hori, 1993; Alvarez-Hernandez et al., 1999). Однако об их физиологической роли у изученных видов ничего не известно. Некоторые исследователи предполагают, что лектины у красных и бурых водорослей вовлечены в процесс распознавания гамет при оплодотворении (Kim, Fritz, 1993a,b; Schmid, 1993; Kim et al., 1996; Kim, S.-H. Kim, 1999). Авторы указанных работ обнаружили, что сцепление гамет не происходило тогда, когда в морской воде присутствовали углеводы, комплементарные лектинам, найденным ими на мембранах гамет путем их окрашивания флуорохромами FITC-conjugated lectins. Однако сами лектины при этом не были получены и охарактеризованы.
Основываясь на этих данных, мы предположили, что агглютинация клеточных компонентов в морской воде может осуществляться также посредством комплементарной лектинно-углеводнои связи. В результате проведенных исследований было показано, что это действительно так. Нам удалось выделить новый, не описанный в науке фитогемагглютинин, который был назван бриохилин (Bryohealin). Первая часть этого названия (Вгуо) соответствует родовому названию водоросли, в протоплазме которой он был обнаружен, (Bryopsis), вторая часть - функции, которую он выполняет в процессе постравматической регенерации поврежденных клеток-сифонов («healing» — англ. залечивать).
Как уже указывалось, агглютинация выдавленных клеточных компонентов в протоплазматические массы зависела от рН морской воды. Когда протоплазму выдавливали на предметное стекло без добавления морской воды, органеллы и ядра начинали собираться в протоплазматические массы в жидком веществе протоплазмы, рН которого, как было установлено нами, равняется 5,8. Такие же результаты были получены и в экспериментах Д. Пак с соавторами (Рак et al, 1991), исходя из чего они предположили, что необходимый для агглютинации материал находится в вакуолярном соке.
Однако когда в наших экспериментах протоплазма выдавливалась в морскую воду с таким же низким рН (5-6), то процессов агглютинации органел и ядер не наблюдалось. Таким образом, стало понятно, что в жидком веществе протоплазмы находится некий материал, вовлеченный в процесс их агглютинации. Он активен при значениях рН 5-6. Все же следует отметить, что по результатам своих экспериментов мы не могли определенно сказать, где именно локализуется этот материал: в вакуолярном соке, или в веществе цитоплазмы.
Далее проводился следующий эксперимент. Растения разрушали в малом количестве искусственной морской воды с рН 6 и соленостью 900 ммоль NaCl, для того, чтобы полностью ингибировать агглютинацию органел и ядер. Затем смесь воды и выдавленной протоплазмы собирали в пробирку и центрифугировали 10 мин при скорости 12,000 . Содержимое пробирки и липидную фракцию полностью удаляли, а осевшие на ее дно органеллы и ядра промывали в кислой гиперсоленой искусственной морской воде.
Процедура центрифугирования и промывания органел и ядер повторялась трижды, в результате чего они были полностью отделены друг от друга. Однако когда органеллы и ядра были размешаны в искусственной морской воде с рН 7-9 и соленостью 450 ммоль NaCl, то они снова собрались вместе в протоплазматические массы. При показателях рН ниже 5,5 и выше 10,5 их агглютинации не наблюдалось. Это дало основание сделать вывод о том, что существует еще один материал, вовлеченный в процесс агглютинации, и он находится на мембранах внутриклеточных структур и активизируется при показателях рН 7-9. Следует отметить, что несмотря на образование органеллами и ядрами протоплазматических масс, формирования первичной оболочки на их поверхности при отсутствии фракции протоплазмы, содержащей липиды и другие, удаленные в ходе отмывания вещества, не происходило.
Далее был проведен эксперимент, в ходе которого была изучена способность разных углеводов блокировать агглютинацию клеточных компонентов. Известно, что количество лектинов в протоплазме невелико, и образующиеся комплементарные лектинно-углеводные связи не слишком сильны (Kalthoff, 2001). Поэтому для того, чтобы блокировать агглютинацию органел и ядер в присутствии жидкого вещества протоплазмы, мы использовали концентрированные (0,1 М.) растворы углеводов.
В ходе этого эксперимента протоплазма В. plumosa выдавливалась в раствор морской воды с растворенными углеводами (0,1 М.), и через 1 ч высчитывалось общее количество образовавшихся в нем различных структур: протопластов в первичной оболочке, рыхло агрегированных протоплазматических масс без оболочек, и отдельных хлоропластов. При интерпретации данных эксперимента мы рассуждали следующим образом. Если на мембранах внутриклеточных структур действительно существуют рецепторы для содержащихся в протоплазме лектинов, то они будут пропитаны находящимися в растворе углеводами и не смогут вступить во взаимосвязь с лектинами. Следовательно, о способности определенного углевода блокировать агглютинацию клеточных компонентов мы могли судить по сценарию поведения протоплазмы и формированию протопластов в среде с его присутствием. Данные статистической обработки результатов этих экспериментов приведены в таблице 2.
