Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Анатомо-физиологическая характеристика верхнечелюстного синуса 10
1.2. Анатомо-гистологическая характеристика околоносовых пазух крысы 16
1.3. Оксид азота в репарации и реорганизации слизистых оболочек 21
1.3.1. Оксид азота как трофический фактор 21
1.3.2. Идентификация оксида азота в слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи 23
1.4. Феномен апоптоза 30
1.4.1. Механизм апоптоза 30
1.4.2. Молекулярные факторы апоптоза в условиях физиологической и репаративной регенерации 35
1.5. Межклеточные мессенджеры в регуляции репаративных процессов и апоптоза 42
Глава 2. Материал и методы исследования 49
2.1. Экспериментальная модель посттравматического синусита 49
2.2. Моделирование травматического перелома верхнечелюстного синуса 52
2.3. Клинический материал 56
2.4. Детекция NADPH-диафоразы и iNOS 61
2.5. Идентификация апоптоза 63
Глава 3. Нитроксидергические механизмы апоптоза при экспериментальной травме 68
3.1. Топография NADPH-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при односторонней деафферентации 68
3.2. Топография NADPH-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при переломе костей черепа 80
3.3. Апоптоз в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при односторонней деафферентации 87
3.4. Апоптоз в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при переломе костей черепа 92
Глава 4. Апоптоз и нитроксидсинтезирующие системы при патологии верхнечелюстного синуса человека 104
4.1. Клинико-морфологическая характеристика стадий посттравматического воспаления и репарации слизистой оболочки верхнечелюстного синуса 104
4.2. Топография NADPH-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса в условиях травмы и хронического воспаления 107
Заключение 111
Список сокращений 125
Список литературы 126
- Анатомо-гистологическая характеристика околоносовых пазух крысы
- Молекулярные факторы апоптоза в условиях физиологической и репаративной регенерации
- Моделирование травматического перелома верхнечелюстного синуса
- Топография NADPH-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при переломе костей черепа
Введение к работе
Актуальность исследования. Нарушение целостности верхнечелюстного синуса является широко распространенной самостоятельной патологией, сопровождающей, в силу анатомических особенностей строения, различные типы переломов костей скуло-орбито-верхнечелюстного комплекса (Зуев В.П., Гусев Э.П., 1988; Трунин Д.А., 2001). Так, при проведении имплантации на верхней челюсти с поднятием дна гайморовой пазухи возникают две проблемы: с одной стороны - воспаления верхнечелюстной пазухи после синус-лифтин-га, которое регистрируется в 3-20% случаев (Maksoud М.А., 2001; Schwartz -Arad D., 2004), а с другой - патология околоносовых пазух, которая ограничивает показания к данной операции (Costa Е et al, 2007). Исследования на экспериментальной модели показали структурную перестройку эпителия пазухи после репарации. Однако, объяснить это лишь прямым травматическим повреждением тканей не возможно, так как в процесс перестройки вовлекались клетки, расположенные на значительном расстоянии от перелома.
Современная концепция патогенеза травматического повреждения рассматривает два основных взаимосвязанных механизма гибели клеток: апоптоз и некроз (Ярилин А.А., 1998; Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Пальцев М.А., 2002; Калиниченко СЕ, Матвеева Н.Ю., 2007; Sloviter R., 2002; Marretta R.M., Ales Е, 2010; Khoury М.Р., Bourdon J.C., 2011). Понимание этих процессов исторически происходило не одновременно. Начиная с работ Вирхова (1859), было проведено детальное морфологическое описание смерти клетки, названной некрозом, под которым понимали необратимые изменения тканей (см. Серов В.В., 2001). По мере развития гистологических методов исследования, позволивших описывать детали процесса клеточной гибели, стало ясно, что некроз представляет собой не одномоментный, а растянутый во времени процесс. В 1885 г. Флеммингом был описан хроматолиз - процесс быстрого исчезновения образовавшихся при распаде клеток фрагментов ядра (Flemming W., 1885). Позднее Вейгерт ввел термины аутолиз, пикноз и кариолизис (Weigert К., 1890). Со временем стали появляться гипотезы о существовании естественного механизма смерти клеток, позволяющего поддерживать качественные и количественные показатели клеточных популяций на оптимальном, генетически детерминированном уровне. Подобный механизм элиминации клеток детально описал Елуксман в середине прошлого века (Gluksmann А., 1951), но только в 70-х годах в работах Керра было впервые введено понятие программированной гибели клеток или апопто-за (Kerr J.Eetal., 1972).
Изучение апоптоза при травматическом повреждении и регенерации слизистой оболочки является перспективным и с точки зрения возможности влияния на патологический процесс (Khoury М.Р., Bourdon J.C., 2011).
В то время как некроз представляет собой необратимую гибель клетки, смерть в результате апоптоза на определенных этапах может быть задержана или предупреждена (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). Поэтому особую актуальность приобретают исследования механизмов активации
апоптоза, его временного и пространственного распространения в клеточной популяции ткани.
Оксид азота (NO), обладая широким спектром регуляторного, фармакологического и токсического действия влияет на процессы клеточной смерти, физиологической и репаративной регенерации. NO является одним из главных факторов клеточной сигнализации и межклеточного взаимодействия. Он участвует в регуляции тонуса сосудистой стенки, угнетает агрегацию тромбоцитов и их адгезию к клеточной стенке, стимулирует ангиогенез, обладает цитотоксическим действием, участвуя таким образом в противомикробном, противовирусном и противоопухолевом иммунитете. В зависимости от условий NO может активировать или подавлять апоптоз, избирательно воздействуя на определенные типы клеток (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Choi В.М. et al, 2002).
Вместе с тем нельзя исключить и нейрогенные влияния, неизбежно возникающие при травме стенок гайморовой пазухи. В случае перелома, верхняя челюсть с костями носа отламывается от скуловых костей. В результате этого травмируются подглазничный и верхний альвеолярный нервы, что проявляется нарушением всех видов поверхностной чувствительности и встречается в 100% случаев при данном поражении (Крюков К.И., 2005).
Повреждение чувствительной иннервации вызывает в тканях нейроди-строфические изменения (Григорьева Т.А., 1951), явления воспалительного характера, нарушение морфо-функциональной специфичности клеток, их некроз и апоптотическую гибель (Князев Г.Г., 1992).
Установлено, что начальный период апоптоза при деафферентации индуцируется экспрессией фактора роста нервов, который при взаимодействии с рецептором р75 запускает механизмы клеточной смерти (Banasiak K.J. et al, 2000). Необратимую активацию этого процесса при перерезке нервов опосредуют проапоптотические ферменты - эффекторные каспазы и р53 (Li C.Q. et al, 2002).
Так, при деафферентации слухового нерва апоптоз нейронов слуховых ядер отмечается уже в первые сутки после нанесения травмы (Матвеева Н.Ю. и др., 2006), а перерезка зрительного нерва у мышей активирует апоптоз более 90% популяции ганглиозных нейронов сетчатки (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007). Менее известны механизмы программированной гибели клеток в ответ на деафферентацию периферических нервов.
С этих позиций приобретают особую актуальность данные, характеризующие роль апоптоза и оксида азота при деафферентации и в посттравматической репарации слизистой оболочки.
Цель настоящей работы состояла в установлении роли апоптоза и оксида азота в репаративных процессах травмированной слизистой оболочки верхнечелюстного синуса.
В работе решались следующие задачи:
-
Создать экспериментальную модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса на лабораторном животном - белая крыса;
-
Исследовать топографию конститутивной и индуцибельной изоформ NO-синтазы (NOS) и NADPH-диафоразы (NADPH-d) в слизистой оболочке гайморовой пазухи у человека и крысы в норме и на разных этапах регенерации;
-
Дать оценку клинико-морфологическим изменениям при репарации верхнечелюстного комплекса у человека после травмы и установить их связь с динамикой распространения апоптоза;
-
Исследовать качественные и количественные характеристики апоптоза клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при деафферентации и механическом повреждении у крыс;
-
Установить топографию и распределение Всі-2- и р53-иммунореактивных клеток на разных этапах регенерации слизистой оболочки у человека и крысы;
-
На основе полученных результатов и данных литературы представить обобщенную модель взаимоотношений NO-синтезирующих, про- и антиапопто-тических факторов при травме и воспалении поврежденной слизистой оболочки;
-
Обосновать закономерности развития апоптоза и механизмов цитотокси-ческого и протективного действия оксида азота в репарации слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи.
Научная новизна. В настоящей работе проведено комплексное исследование топографии и активности NO-синтезирующих ферментов и факторов апоптоза в поврежденной слизистой оболочке верхнечелюстного синуса человека и крысы.
Впервые продемонстрированы клинико-морфологические критерии и стадии репарации скуловерхнечелюстного комплекса у человека на разных сроках после травмы и неправильно консолидированного перелома.
Впервые представлена экспериментальная модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса.
Впервые установлен феномен апоптоза клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при деафферентации и экспериментальной травме костей черепа у крысы.
Впервые изучена динамика NADPH-диафоразы и индуцибельного изо-фермента NO-синтазы в клетках слизистой оболочки и проведен сравнительный анализ изменений, связанных с их апоптозом при хроническом риноси-нусите у человека.
Впервые исследована связь апоптоза с механизмами цитотоксического и протективного действия оксида азота в период восстановления слизистой оболочки после травмы.
Теоретическое и практическое значение работы. Изучены топография и активность нитроксидсинтезирующих ферментов и факторов апоптоза в условиях репаративнои регенерации слизистой оболочки верхних дыхательных путей и полости рта для выяснения роли модулирующих цитопротективных и цитотоксических эффектов и обоснования рациональной терапии стоматологических заболеваний.
Создана адекватная экспериментальная модель деафферентации верхнечелюстного синуса, имеющая реальные перспективы для дальнейших исследований в стоматологии и отоларингологии, разработки новых патогенетически ориентированных программ терапии острого и хронического синуситов, а также рекомендаций по реабилитации пациентов после травм костей лицевого черепа, гайморотомии, реконструктивных операций на средней зоне лица, в том числе дентальной имплантации и синуслифтинга.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом репрезентативных выборок, достаточным объемом наблюдений с использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Тихоокеанских научно-практическая конференциях ВГМУ (Владивосток, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), Приморских краевых ежегодных конференциях «Хирургия лица» (2006, 2007, 2008), имплантологических коференцих «Восток-Запад» (Владивосток, 2010, 2011), «Должановских чтениях» (Воронеж, 2011), IV научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» памяти проф. В.В. Куприянова, (Москва, РУДН, 2012).
Положения, выносимые на защиту:
-
Травматические и деафферентационные повреждения верхнечелюстного синуса вызывают селективные морфологические и цитохимические альтерации клеток различных слоев слизистой оболочки;
-
Апоптоз является постоянным компонентом вторичного повреждения слизистой оболочки и имеет специфическую динамику на разных стадиях хронического воспаления;
-
Динамика изменения TUNEL-иммунореактивных клеток, а также локализация NADPH-диафоразы и индуцибельной NO-синтазы в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса видоспецифичны и зависят от этиологии повреждающего фактора.
-
Репаративные и цитотоксические процессы в слизистой оболочке обусловлены кооперативным взаимодействием различных популяций NO-синтезирующих, р53- и Bcl-2-иммунореактивных клеток.
Публикации результатов работы. По теме исследований опубликована 1 монография и 30 научных работ, (в том числе 13 в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», входящих в международные базы цитирования).
Работа выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет». Все экспериментальные данные получены автором лично или при его непосредственном участии. Отдельные этапы работы выполнялись в содружестве с сотрудниками НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН, сотрудниками ЦНИЛ и кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Тихоокеанского государственного медицинского университета.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения и выводов. Список литературы содержит 390 источников (103 отечественных и 287 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 102 рисунками и 10 таблицами.
Анатомо-гистологическая характеристика околоносовых пазух крысы
Верхнечелюстной синус крысы расположен на наружной поверхности верхней челюсти кпереди от подглазничного отверстия. Его латеральная стенка образована костным возвышением, а медиальная - плоской наружной стенкой лунки резца. Обе стенки пазухи соединяясь образуют щелеводное пространство шириной около 0,1 см, вытянутое в сагитальной плоскости и несколько расширяющееся кзади (рис. 1.1). В верхнем дистальном отделе стенки пазухи расходятся, образуя элипсовидное отверстие размером 0,10 0,15 см, открывающееся рядом с подглазничным отверстием (Едранов С.С., 2005; Едранов С.С. и др., 2005). Подглазничный нерв, выходящий из этого отверстия, является непосредственным продолжением верхнечелюстного нерва, который иннервирует лицевую часть морды животного (рис. 1.2) (Карпилов Г.Х., 1937).
Конфигурация и размеры верхнечелюстной полости меняются в мезио-дистальном направлении и относительно окружающих анатомических структур. Силиконовые оттиски верхнечелюстной пазухи крысы, полученные трансальвеолярным способом, имели форму запятой, расположенной горизонтально. Расширенная часть синуса направлена дистально и кнаружи от лунки резца и не выходит задней границей за апекс альвеолы. Сужающаяся часть направлена вперед и медиально, косо пересекает центральную ось резца чуть кпереди середины длины нижней кривизны лунки, где они сообщаются через точечное отверстие (рис. 1.3) (Едранов С.С, 2005). Максиллярное отверстие открывается сразу под носовой раковиной в передней части носовой полости. Общая длина верхнечелюстной пазухи от максиллярного отверстия до дистальной границы приблизительно 0,8 см, длина расширенной части - 0,20-0,25 см, высота - 3,8-4,0 см. Фронтальный гистотопографический срез верхней челюсти крысы: естественное сообщение (1) верхнечелюстной назухн (2) и лунки резца (3). Окр. гематоксилином и эозином, 50 (увеличено при печати). Слизистая оболочка верхнечелюстной пазухи крысы выстлана однослойным многорядным мерцательным эпителием с ярко выраженным мукоциллиар-ным аппаратом - на 1мм2 приходится 170,9±7,3 реснитчатых эпителиоцита и 10,8±2,1 бокаловидной клетки (соотношение 15:1). Толщина эпителиального пласта пазухи - 19,9±2,6 мкм. Собственная пластинка слизистой оболочки содержит большое количество простых альвеолярных желез, лимфоидных элементов и групп тучных клеток (рис. 1.4). Площадь профильного поля мастоци-тов находится в пределах 322,3±9,5 мкм2 (Едранов С.С., 2005).
Электронная микроскопия фрагментов слизистой оболочки продемонстрировала известные особенности строения различных клеток: эпителиоцитов, фибробластов, лаброцитов и др. (рис. 1.5). При рентгенанатомическом исследовании верхнечелюстные пазухи крысы определяются как парные замкнутые полости в виде овалов, вытянутых в ди-стальном направлении и уплощенных с медиальной стороны, симметрично расположенные впереди от подглазничных отверстий и латеральнее резцов (рис. 1.6) (Едранов С.С. и др., 2004). Рис. 1.4. Слизистая оболочка верхнечелюстного синуса белой крысы: 1 - мерцательный эпителий, 2 - простые альвеолярные железы собственной пластинки. Фронтальный гистотопографический срез, окр. гематоксилином и эозином, ЮО. б V Рис. 1.5. Ультраструктура клеточных элементов интактной слизистой оболочки верхнечелюстного синуса белой крысы: а - фибробласты; б - тучные клетки; Я - ядро, СГ - секреторные гранулы. Электронограмма, 75000. Рис. 1.6. Визиограмма лицевого отдела головы белой крысы в горизонтальной проекции: а - лицевой отдел; б - носовой отдел; в - корни резцов; г - верхнечелюстной синус; д - вырезка подглазничного отверстия; е - височный отросток верхней челюсти (передний отдел скуловой дуги). 1.3. Оксид азота в репарации и реорганизации слизистых оболочек Оксид азота - универсальный межклеточный мессенджер - представляет собой исключительно важный регулятор физиологических функций (Ванин А.Ф., 1998; Реутов В.П. и др., 1998; Реутов В.П., 2000; Мотавкин П.А. и др., 2000). В норме он осуществляет регуляцию внутри- и межклеточных процессов. За последние два десятилетия стало известно, что главный механизм действия оксида азота связан с увеличением внутриклеточной концентрации циклического гуанозинмонофосфата и активацией через систему G-киназ Са2+-насосов эндоплазматического ретикулума (Borutaite et al, 2006; McCarty, 2009). Другим механизмом является активация при участии оксида азота ADP-рибозилтрансферазы и высвобождение ионов кальция. Наконец, образование NO+ - одного из промежуточных продуктов метаболизма оксида азота - влияет на проницаемость кальциевых каналов. Обнаружение описанных свойств позволило причислить оксид азота к таким вторичным мессенджерам, как циклические аденозин- и гуанозинмонофосфат, ионы кальцая, инозитолтрифосфат и арахидоновая кислота (Реутов В.П. и др., 1998; Neufeld A.H., 1999; Philippides A. etal.,2000).
Нарушение механизмов регуляции с участием оксида азота отмечают при травме, гипертензии, ишемии, тромбозах, инфекциях, иммунном ответе, опухолевом росте (Мотавкин П.А., ГельцерБ.И., 1998; Покровский В.И., Виноградов Н.А., 2005; Serrano C. et al., 2004; Nikolovska S. et al, 2005; Thomas M.S. et al, 2005). Степень продукции этого соединения определяет в конечном итоге его эффекторное действие на мишень, которое реализуется по двум основным механизмам: цитотоксическому и цитопротективному (Narayanan V., 1997; de la Rosa E., de Pablo F., 2000; HofR.J., HoskingL., 2000; Ott S.R. et al, 2000; Monti B. et al, 2001; Yang E.S., Park J.W., 2006).
Трофическая активность оксида азота неразрывно связана с его цитопро-тективным эффектом в условиях гипоксии, травмы или воспаления (Wilkins A. et al, 2004). A. Wilkins и A. Compston (2005) впервые доказали, что оксид азота могут секретировать формирующиеся аксоны, прорастающие в окружающую ткань в процессе посттравматической регенерации. В серии работ было показано, что оксид азота функционирует в этих условиях как нейротрофин, подобно фактору роста нервов, нейтротрофину-3 и мозговому нейротрофическому фактору (KlockerN. et al, 1998, 2000; Tzeng S.F., Huang H.Y., 2003; Estevez A.G. et al.,2006).
Взаимосвязь функциональных пулов оксида азота и нейротрофинов продемонстрирована при репаративной регенерации эпителия и соединительной ткани кожи, а также слизистой оболочки кишечника (RaapU., Карр A., 2010). В этой ситуации оксид азота выполняет функцию стыковочного звена в пространственных взаимодействиях между клетками. Предполагается, что эти эффекты поддерживаются нитроксидопосредованной вазодилятацией и положительным влиянием этого газа на процессы метаболической компенсации повреждения.
Молекулярные факторы апоптоза в условиях физиологической и репаративной регенерации
Как известно, воспалительную реакцию вызывают продукты поврежденных клеток. На основе последующей репарации на клеточном и внутриклеточном уровнях обеспечивается обширный диапазон приспособительных механизмов и функциональной активности в меняющихся условиях микросреды, а также восстановление и компенсация функций, нарушенных в результате воздействия патогенных факторов (Пальцев М.А. и др., 2003). Физиологическая регенерация не связана с действием повреждающих факторов и осуществляется с помощью апоптоза (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002; Ziegler T.R. et al, 2003).
Около десяти лет назад на цитоплазматической мембране был открыт первый специализированный рецептор для индукции апоптоза - Fas-рецептор (FasR), так же называемый Cluster of Differentiation (CD) 95 или APO-1. FasR представлен практически на всех клеточных мембранах (MagataS., Goldstein P., 1995). Этот рецептор принадлежит к суперсемейству фактора некроза опухоли/фактора роста нервов (BoronatM.F. et al., 2001). Описаны его растворимые формы, которые образуются за счет протеолитического расщепления мембранного домена, либо за счет транскрипции мРНК, кодирующей образование белка, соответствующего растворимой форме (Rho J. et al., 2001). Этот растворимый белок связывается с FasR и ингибирует Fas-опосредованный апоптоз (TakenakaK. et al., 1996). При связывании лиганда с рецептором происходит образование комплекса DISC (Death-Inducing Signaling Complex), в результате чего активируется каспаза-8 (Na-gataS., 1997). Олигомеризация Fas приводит к наличию в его структуре «домена смерти» (DD - Death Domain), состоящего примерно из 80 аминокислотных остатков (AizenmanE. et al., 1990; Davidson F.F., StellerH., 1998). Другой домен смерти находится во внутриклеточном белке FADD (Fas-Associated Death Domain). Его «эффекторный домен смерти» (DED, Death Effector Domain), индуцирует зимогенную форму каспазы-8 с последующей активацией каспазы-3 (Geng Y.J. et al., 1998). При этом экспрессия FasR бывает снижена или нарушается проапоптическая сигнализация с этих рецепторов (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). При экспрессии Fas может провоцировать клетки с FasR к апоптозу и, тем самым, вызывать диффузные поражения (Ashkenazi A.M., Dixit V.M., 1998; VennM.K., Conway E.L., 1998).
Другим важным фактором, индуцирующим апоптоз, является фактор некроза опухоли (TNF - Tumor Necrosis Factor). Семейство TNF включает, по крайней мере, 18 известных членов, из которых два - и (3 - секретируемые цитокины, а остальные - молекулы клеточной мембраны (Робинсон М.В., Тру-факинВ.А., 1991; Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 1996; BotzlerC. et al, 1999; Boulares A.H. et al, 2002). TNF является продуктом моноцитов/макрофагов, эндотелиальных, тучных и миелоидных клеток, клеток нейро-глии. TNF (лимфотоксин ) - производное активированных Т-лимфоцитов (CD4+ и CD8+), был найден в лимфатических узлах иммунизированных крыс (Robertson J.S. et al, 2003). Цитотоксическое действие TNF имеет комплексную природу. Обладая способностью индуцировать апоптоз, TNF вызывает образование в клеточной мембране активных форм кислорода, супероксидра-дикалов и оксида азота (Boix J. et al, 1998). TNF на 28% гомологичен TNF , существует в виде нековалентно связанного тримера, взаимодействует с теми же рецепторами, что и TNF . В отличие от TNF , TNF не имеет трансмембранной формы, но может существовать в виде мембранассоциированного комплекса при связывании с лимфотоксином . Последний является трансмембранным гликопротеином и известен как р33 (Zheng L. et al, 2000).
Однако TNF нельзя рассматривать как безусловный индуктор клеточной гибели. Имеются работы, в которых показано, что он может быть антиапоптоз-ным фактором. TNF предотвращал апоптоз, вызванный антииммуноглобули-новыми антителами в клетках лимфомы Беркита линии Ramos (Robertson J.D., 2000; YuanL., Neufeld A.H., 2000). Предполагают, что его антиапоптозный эффект может быть связан с активацией одного из ключевых факторов транскрипции - NF-кВ, т.е. с перманентной продукцией короткоживущих ингибиторов апоптоза (d Acquisto F. et al., 2001; Feng Z.W. et al, 2003).
Известен еще один член семейства TNF - TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), который экспрессируется на лимфоцитах и также способен индуцировать апоптоз. Другой член семейства - СБ30-лиганд, взаимодействуя с рецептором CD30, может индуцировать как апоптоз, так и пролиферацию клеток (Orlinick J.R, Chao M.V., 1998). Однако ключевым моментом в промежуточных и терминальных стадиях апоптоза выступает активация каспаз (caspases - cysteine proteases which cleave proteins after an aspartic acid residue) - цистеиновых протеаз, расщепляющих белки после остатка аспарагиновой кислоты. Данные ферменты существуют обособленно и функционируют как медиаторы сигнала апоптотической гибели (Cohen J.J., 1993; Cohen J.J., SquerM.K., 1997). Каспазы высоко гомологичны по своей аминокислотной последовательности и по субстратной специфичности. Каждый член семейства обозначается порядковым номером. Каспазы находятся в цитозоле в виде неактивных предшественников (прокаспаз) с молекулярной массой от 30 до 50 кДа и делятся на подсемейства - ICE (1, 4, 5) и CED-3 (2, 3, 6, 7, 8, 9, 10). Про-каспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1-2% активности зрелых каспаз (Фильченков А.А., 2003; Brakus et al., 2010).
Среди каспаз различают эффекторы - ферменты непосредственно гидроли-зирующие структурные белки клетки, и индукторы, которые принимают апоптотический сигнал и передают его на эффекторные каспазы. Каспазы при 38 сутствуют в клетке конститутивно, что позволяет быстро индуцировать апоптоз (Фильченков А.А., Абраменко И.В., 2001; Chae I.H. et al, 2004). Один из путей активации каспаз связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы-8 при взаимодействии Fas-лиганда с FasR). Другой путь - активация каспазы-9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Вс1-2. Третий путь активации - при помощи гранзима В, способного расщеплять и активировать каспазы. A.H. Boutillier et al. (2000) показано, что каспаза-9 активирует каспазу-3 после связывания с апоптогенными факторами митохондрий и аденозинтрифосфатом; каспаза-8 образует активные тетрамеры, принимая апоптогенную эстафету от адапторных белков, ассоциированных с «доменами смерти» Fas (Brakus S.M. et al, 2010).
Мишенями каспаз служат цитоплазматические (фодрин, актин, фосфолипа-за А2, протеинкиназа С) и ядерные белки. К последним относят ламины (компоненты ядерного скелета), ферменты репликации и репарации (топоизомера-зы, poly(ADP-ribose)polymerase ДНК-зависимая протеинкиназа); регуляторные белки (рRb), гистон HI и ряд других белков, в том числе ферменты и ингибиторы, задействованные в клеточном гомеостазе (d Amours R.H. et al, 1998; Culmsee C. et al., 2005). Установлено, что активированная каспаза-6 расщепляет ядерный ламин А, связанный с кариолеммой и организующий структуру хроматина (McKinnon C.J. at al, 2002). Разрушение ламина приводит к конденсации хроматина и способствует прикреплению его к внутренней поверхности ядерной мембраны с последующей ее деструкцией. Описанные механизмы активации апоптоза будут неполными без учета комплексного действия молекулярных факторов, запускающих и ингибирую-щих его при экзогенном повреждении. В настоящее время они выделены и охарактеризованы как целое семейство генов BCL-2 и ТР53, регулирующих активность пролиферации и апоптотической гибели соответственно (AtugF. et al, 1998; Vousden K.H., 2000; Kames H.E. et al, 2010).
Моделирование травматического перелома верхнечелюстного синуса
Для формирования острой травмы верхнечелюстного синуса животным на фоне анестезии наносили однократную компрессию в подглазничной области зажимом типа Бильрот без повреждения целостности кожных покровов. Для под 53 тверждения однотипности наносимой травмы использованы методы прикладной механики: аналитическое определение перемещений и напряжений при изгибе. Зажим обладает свойствами реального тела, способного изменять форму и размеры от нагрузки, то есть деформироваться. Обратимое изменение формы и размеров определяется как упругая деформация (рис. 2.3). В пределах упругих деформаций (при малых нагрузках), зависимость между напряжением и деформацией линейная (закон Гука): =Е , где - нормальное напряжение (интенсивность нагрузки в точке, действует по нормам к сечению), - линейная деформация (изменение длины единичного отрезка), Е - коэффициент пропорциональности (коэффициент упругости, модуль Юнга). От растяжения или сжатия усилие N распределяется равномерно: =N/A (N 0 - растяжение, A 0 - сжатие). От изгибающего момента верхние волокна растягиваются, нижние сжимаются.
Материал слизистой оболочки верхнечелюстных пазух человека получали в ходе оперативного вмешательства - реконструкции скуловерхнечелюстного комплекса после травмы и неправильно консолидированного перелома на разных сроках (7 наблюдений). Кроме того исследовали 37 биопсий слизистой оболочки пазухи от 11 больных с полипозно-гнойным хроническим риносинуситом (хроническим гайморитом). Контрольную группу составили 5 пациентов, у которых при открытом синуслифтинге возникли непреднамеренные перфорации мембраны Шнейдера (рис. 2.4). У этих пациентов в анамнезе отсутствовали указания на патологию верхнечелюстных пазух, а основные и дополнительные методы исследования не определили наличия ЛОР-заболеваний.
Больные хроническим гайморитом чаще всего предъявляли жалобы на нарушение носового дыхания (10 человек из 11), в единичных случаях регистрировалась головная боль, ощущение тяжести в подглазничной области, нарушение обоняния. При сборе анамнеза часто обнаруживался аллергический компонент воспаления: реакции на домашнюю пыль, шерсть домашних животных и пыльцу растений. Консервативное лечение по поводу острого гнойного риносинусита раньше получали 2 больных, хирургическое вмешательство по поводу хронического гайморита перенес 1 больной.
При передней риноскопии и эндоскопии искривление носовой перегородки найдено у 6 человек, страдавших хроническим гайморитом. Также в 6 случаях зарегистрирован отек слизистой оболочки в области остиомеатального комплекса. У двух человек обнаружена деформация средней носовой раковины, у одного - отек мягких тканей подглазничной области.
Среди лиц, перенесших травму скуловерхнечелюстного комплекса, наиболее частыми жалобами были онемение мягких тканей и ощущение тяжести в подглазничной области. Головная боль и нарушения носового дыхания в данной группе регистрировались эпизодически. При объективном обследовании в посттравматическом периоде с высокой частотой встречались деформация костей носа с асимметрией лица, отек мягких тканей подглазничной области и отек слизистой оболочки в области остиомеатального комплекса.
Компьютерная томография при хроническом гайморите примерно с одинаковой частотой регистрировала снижение пневматизации ячеек решетчастой кости и утолщение слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи со снижением ее пневматизации. Так, уменьшение объема гайморовой пазухи на 1/3 зафиксировано у 4, а на 2/3 - у 3 пациентов с хроническим гайморитом. Еще в 1 случае пневматизация отсутствовала полностью. С одинаковой частотой диагностировались кисты и хронические одонтогенные очаги в области дна пазухи (по 5 эпизодов). В 4 случаях в пазухе обнаружен пломбировочный материал. У пациентов после травмы скуловерхнечелюстного комплекса при компьютерной томографии чаще всего (5 случаев) в области дна верхнечелюстной пазухи регистрировались хронические одонтогенные очаги и снижение пневматизации (6 случаев). Кисты пазухи и снижение пневматизации ячеек решетчатой кости диагностированы в единичных наблюдениях (рис. 2.5, 2.6). Комплексный диагностический подход позволил найти некоторые схожие проявления патологического процесса у пациентов обеих групп. Например, при опросе пациентов с одинаковой частотой встречалась жалоба на тяжесть в подглазничной области. Однако, онемение подглазничной области, как один из па-тогомоничных симптомов повреждения подглазничного нерва, отмечалось только при переломе костей скуловерхнечелюстного комплекса,. В тоже время, затрудненное носовое дыхание и нарушение обоняния были больше свойствен 59 ны пациентам, у которых патологический процесс в гайморовой пазухе возникал на фоне искривления носовой перегородки. Также, общим для пациентов обеих групп являлось вовлечение в процесс остиомеатального комплекса, что выяснено при проведении инструментального обследования. Являясь анатомическим барьером между носовой полостью и двумя пранозальными пазухами (фронтальной и верхнечелюстной), комплекс неизбежно вовлекается в патологический процесс, как при риногенном, так и одонто-генном генезе заболевания. Травматическое повреждение костных стенок верхнечелюстного синуса еще и усугубляет этот процесс (Расулев С.Д. и др., 2010).
Самым важным наблюдением на собственном материале явилось наличие большого количества хронических очагов одонтогенной инфекции в обеих группах. Это говорит о том, что несмотря, на условное разделение пациентов на группы по риногенному и травматическому генезу патологии необходимо учитывать влияние и одонтогенного фактора. Это с одной стороны подчеркивает, необходимость более тесного сотрудничества стоматологов, челюстно-лицевых хирургов и оторинолярингологов в лечении пациентов с патологией верхнечелюстного синуса, а с другой - подчеркивает важность «чистых» экспериментальных моделей для углубленного изучения такого сложного анатомического образования, как гайморова пазуха.
Гистохимическая идентификация активности нейрональной NADPH-диафоразы (NOS) основана на образовании формазана в присутствии экзогенного NADPH (НореB.T. et al, 1991; DinermanJ.L. et al, 1994). Исследование проведено на экспериментальных моделях посттравматического синусита (15 животных) и деафферентации гайморовой пазухи (12 животных), а также на клиническом материале: 3 наблюдения с хроническим полипозно-гнойным риносинуситом и 2 наблюдения с посттравматическим гайморитом.
Материал слизистой оболочки околоносовых пазух человека получали в результате биопсии (хронический риносинусит) и в ходе оперативных реконструкций скуловерхнечелюстного комплекса после травмы и неправильно консолидированного перелома. Для контроля использовали операционный материал, полученный у лиц без ЛОР-патологии во время синус-лифтинга.
Топография NADPH-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при переломе костей черепа
Изменения состояния тучноклеточного аппарата, как и в эксперименте с де-афферентацией, имели различия в собственной пластинке слизистой и в под-слизистой основе. Четырехкратное увеличение популяции тканевых базофилов в собственной пластинке наблюдается уже в 1-е сутки, при этом большая их часть (70,3 %) давала положительную реакцию на NADPH-d. В среднем в состоянии дегрануляции находились лишь 20-25 % диафоразо-позитивных ма-стоцитов, однако часто встречались участки ткани, где в местах расположения тучных клеток оставались лишь скопления гранул. Аналогичное соотношение диафоразопозитивных базофилов к их общему числу сохранялось и на 3-й день после травматического воздействия, хотя количество тучных клеток в этот период превышало контрольные показатели примерно в 10 раз. Постепенное уменьшение тучноклеточной популяции начинало регистрироваться на 7-й день эксперимента, но даже к его концу превышало контрольный уровень в 3,5 раза. Из общего числа тканевых базофилов NADPH-d активностью в этот период обладала лишь треть клеток, чье состояние свидетельствовало об отсутствии дегрануляции (рис. 3.11).
Динамика активности тучных клеток подслизистого слоя отличалась двух-фазностью. Первоначально активность достигала максимума к 3-м суткам, а к 7-м суткам общее число тканевых базофилов сокращалось вдвое, и лишь единичные клетки в этот период оставались диафоразопозитивными. Второй пик активности регистрировался к 14-му дню эксперимента, когда общее число ма-стоцитов в 8 раз превышало контрольные значения и около половины из них (42 %) экспрессировали NADPH-d и активно дегранулировали (рис. 3.11,3.12).
Во всех отделах слизистой оболочки пазухи, сформированных соединительной тканью, основная доля гистохимической активности приходилась на нервные сплетения, которые располагаются как вдоль кровеносных сосудов, так и вне связи с ними (рис. 3.12, б). В зависимости от калибра и расположения кровеносного сосуда пространственная конфигурация NADPH-d-позитивных сплетений могла различаться. В мелких и среднего калибра артериях с хорошо развитой средней оболочкой NADPH-d-позитивные аксоны в разных направлениях пронизывают стенку сосуда на всю глубину, формируя в ее слоях плотные сплетения.
Иннервация венозных сосудов кавернозного типа чаще всего осуществлялась волокнами, ветвление которых происходило в адвентициальной оболочке, а вглубь стенки поступали одиночные проводники, расположенные в основном параллельно друг другу. Артерии, вены и капилляры собственной пластинки слизистой оболочки получали небольшое число NADPH-d-позитивных аксонов, приходивших из адвентиции и проникавших лишь на половину глубины сосудистой стенки.
Морфогистохимические изменения, сопровождавшие травму, затрагивали и эндотелий кровеносных сосудов, особенно тех, которые формируют глубокие кавернозные полости. Интима этих вен набухала, формирующие ее клетки приобретали неправильные очертания, выступали в просвет сосуда и отчетливо контурировались на фоне более светлой мышечной оболочки.
Связанные с травмой изменения в экспрессии iNOS наблюдались в эпителии, тучноклеточной популяции и эндотелии кровеносных сосудов (табл. 3.6). В остальных тканевых структурах на всем протяжении патологического процесса у крыс iNOS не выявлялась.
О селективности используемых антител и, соответственно, специфичности иммуноцитохимической реакции можно судить по препаратам, окрашенным без первичных антител, где не наблюдалось отложения продукта иммуноцитохимической реакции красного цвета. В контроле фермент локализовался лишь в апикальной части эпителиоцитов, причем исключительно в мерцательных клетках, в то время как бокаловидные клетки его не экспрессировали (рис. 3.13). При тангенциальном направлении плоскости среза можно заметить, что не все клетки, образующие поверхность эпителия, маркировались с помощью антител - окрашенные фрагменты эпителиоцитов формировали подобие мозаики, где окрашенные клетки характеризовались умеренным уровнем им-муноцитохимической активности.
Избыточная экспрессия фермента наблюдалась в течение остальных этапов посттравматического периода с максимумом на 3-й день. В это время наиболее заметной становилась разница активности iNOS в клетках поверхностных и средних рядов эпителиального пласта. Однако максимальная активность была сосредоточена в верхней порции эпителиоцитов и проявлялась интенсивным гомогенным окрашиванием их цитоплазмы. На этом этапе становилась очевидной экспрессия фермента в бокаловидных клетках.
В собственной пластинке слизистой оболочки начиная с 1-х суток и вплоть до 7-го дня эксперимента происходило постепенное увеличение числа iNOS-позитивных элементов. Преобладающее большинство их- тучные клетки. Продукт иммуноцитохимической реакции коричнево-красного цвета отчетливо маркировал их цитоплазму, оставляя свободной область ядра (рис. 3.15, а). Начиная с 14-го дня и до конца эксперимента число экспрессирующих iNOS лаброцитов постепенно снижалось до нормы. Этот факт отличал тучноклеточные популяции собственной пластинки и подслизистой основы - в последней динамическое увеличение количества iNOS-экспрессирующих клеток сохраняло тенденцию к нарастанию до самого конца эксперимента (табл. 3.6). Начиная с 7-го дня здесь становились заметны признаки дегрануляции - продукт реакции приобретал грубозернистые очертания и зачастую глыбками накапливался на периферии цитоплазмы, оставляя пустую зону вокруг ядра. Начиная с 3-х суток в активацию нит-роксидергических процессов вступали клетки эндотелия сосудов, расположенных как в собственной пластинке, так и в подслизистом слое (рис. 3.15, б).
Метод TUNEL дает неплохие результаты по избирательному выявлению апоптотических клеток, имеющих признаки фрагментации ДНК (рис. 3.16). На экспериментальном материале распределение TUNEL-позитивных клеток в слизистой оболочке оказалось неравномерным. Они превалировали в эпители 88 альном слое в ближайший период (1-7-е сутки) после деафферентации, гради-ентно «смещаясь» в глубокие отделы слизистой оболочки. Рис. 3.16. Клеточная гетерогенность апоптотических элементов слизистой оболочки при перерезке верхнечелюстного нерва: а- апоптотические ядра эпителиальных клеток (стрелки) на 3-и день эксперимента; б-апоптоз в собственной пластинке на 3-й день эксперимента; в - фибробластоподобные клетки под слизистои основы на 14-н день эксперимента; г- клетка, распавшаяся на множество апоптозных телец, на 14-н день эксперимента. Метод TUNEL, иммунофлюоресценция, 900.
На 14-21-е сутки эксперимента основное количество маркированных клеток локализовалось в подслизистой основе, где они концентрировались главным образом в периваскулярных пространствах. При этом стенки микрососудов с антителами не реагировали. Интенсивная флюоресценция ядер апоптотических клеток демонстрировала признаки фрагментации ДНК: флюоресцирующие точки (апоптозные тельца), которые, сливаясь, формировали кольца, полукольца и однородные конгломераты (рис. 3.17). Они локализовались на месте расположения ядра, равномерно распределялись по цитоплазме, смещались к цитоплазматической мембране или группировались у одного из полюсов клеточной сомы. В подслизистой основе регистрировалась флюоресценция ядер единичных фибробластопо-добных клеток, формировавших скопления - кластеры (рис. 3.16, в). Морфологические признаки апоптоза и некроза, определенные на срезах слизистой оболочки, являются взаимоисключающими. Для TUNEL-позитивных элементов характерно наличие неповрежденной клеточной мембраны, вокруг них отсутствуют очаги воспалительной инфильтрации. При сравнительном электронномикроскопическом исследовании апоптоз определялся как глыбча-тый распад ядра с формированием электронно-плотных фрагментов хроматина, окруженных остатками ядерной мембраны (рис. 3.18, а, в). Иногда обнаруживались разрывы кариолеммы, через которые хроматин «вываливался» в цитоплазму, свободно располагаясь среди органелл. Глубокие инвагинации кариолеммы в сочетании с маргинацией хроматина представляют, по-видимому, единственные ранние признаки апоптоза. Как предстадию апоптоза можно рассматривать пикнотиз ядер некоторых эпителиальных клеток, а на завершающей стадии процесса определяются апоптозные тельца различных размеров и формы. Значимые изменения отмечались в митохондриях, которые набухали, меняя обычную форму (рис. 3.18, б, г). Внутренний матрикс митохондрий становился бесструктурным, кристы разрушались, между ними нередко визуализировались разнообразные включения. Очевидно, описанные изменения ядра и митохондрий свидетельствуют о необратимости процесса и уже более глубоких повреждениях мембранных структур. Важно подчеркнуть, что апоптотический распад ядра сочетался с сохранением структуры цитоплазмы и ряда органелл (рис. 3.18, г).
