Содержание к диссертации
Введение
1. Роль света различного спектрального состава в жизни растений 9
1.1. Реакция растений на длительное воздействие красного и синего света 9
1.2. Современные представления о фоторецепции зеленых растений 12
1.2.1 .Фоторецептор красного света 12
1.2.2.Фоторецептор синего света и UV-A радиации 13
1.2.3. Молекулярно-генетическая модель восприятия светового сигнала 15
2. Патофизиология вирусных болезней и механизмы устойчивости к ним 18
2.1. Влияние вирусной инфекции на рост и развитие растений 18
2.2. Физиологические процессы больного растения 19
2.3. Эффекты вирусной инфекции на гормональную систему растений 21
2.4.Физиолого-биохимические основы вирусного иммунитета растений 27
2.4.1. Механизмы растительного иммунного ответа 27
2.4.2. Роль индукторов устойчивости в процессе вирусного патогенеза растений 29
2.5. Транспорт вирусной инфекции в растении 34
2.5.1. Межклеточный транспорт фитовирусов в растении 35
2.5.2. Системное инфицирование при вирусном поражении 38
З. Объекты и методики исследования 40
3.1. Объекты исследования 40
3.2. Эксперименты с использованием спектрального света 44
3.3. VPI - метод искусственного заражения растений 46
3.4. Определение фотосинтетических пигментов 48
3.5. Определение уровня эндогенных фитогормонов 49
3.5.1. Выделение и идентификация * 49
3.5.2. Количественное определение фитогормонов 51
3.5.3. Определение активности цитокининов 52
3.6. Количественное определение вирусов в растениях 53
3.6.1. ELISA-метод 54
3.6.2. Western-blot гибридизация 55
4. Влияние mdmv на рост и развитие различных по устойчивости генотипов кукурузы, выращенных в условиях освещения белым светом 57
4.1. Особенности роста различных генотипов кукурузы инфицированных MDMV 57
4.2. Особенности пигментного фонда различных генотипов кукурузы при их инфицировании MDMV 62
4.3. Гормональный баланс здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных в условиях белого освещения 65
5. Влияние селективного света на морфогенез и гормональный баланс кукурузы инфицированной mdmv 76
5.1. Особенности роста здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных в условиях освещения синим и красным светом 76
5.2. Влияние синего и красного света на пигментный фонд растений кукурузы 83
5.3. Гормональный баланс здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных на селективном свету 87
Заключение 104
Выводы 107
Список литературы 108
- Современные представления о фоторецепции зеленых растений
- Механизмы растительного иммунного ответа
- Определение активности цитокининов
- Гормональный баланс здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных в условиях белого освещения
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования механизмов устойчивости растений к вирусам, необходимы в связи с практической целью охраны окружающей среды от ущерба наносимыми вирусами. В практике мировой агротехники считается, что вирусные болезни снижают урожай сельскохозяйственных культур на 30% и ухудшают товарные качества продуктов.
Химические методы борьбы имеют ряд ограничений. Во-первых, они небезопасны для человека и окружающей среды. Во-вторых, химические методы применяются, в основном, в тех случаях, когда вирусы передаются от растения к растению насекомыми-переносчиками, против которых и используются химические средства защиты растений. В третьих, они не достаточно эффективны, так как их использование не дает 100% положительного эффекта, и часто происходит быстрая адаптация переносчиков к инсектицидам.
Одним из наиболее перспективных способов защиты растений является индуцирование их устойчивости (Озерецковская, 1994). Способ основан не на прямом подавлении фитопатогенов, а на индуцировании естественного потенциала растительной ткани по тому образцу, как это происходит в природе. Известно, что индуцирующими свойствами обладают многие вещества как биотической, так и абиотической природы. В настоящее время уже доказано существование некоторых веществ, повышающих противовирусную устойчивость растений — таких, как салициловая и жасмоновая кислоты, PR-белки, синтезируемые растениями в ответ на вирусную атаку. Также показано участие цитокининов в механизмах трансдукции сигнала и экспрессии некоторых защитных генов (Sano, 1994; Ohashi, 1995; Agrostino, 1999).
Одним из наиболее важных абиотических факторов является свет. Значение света разного спектрального состава в формировании роста и развития многих видов растений хорошо изучено и показано многими исследователями (Клешнин, 1953, Воскресенская, 1979; Карначук,1989 и др.).
Однако вопрос о влиянии селективного света на вирусный патогенез до сих пор остается малоизученным. Существует предположение, что селективный свет способен изменять многие процессы, происходящие в больном растении. Нами впервые предпринята попытка изучения вирусного патогенеза различных по устойчивости растений кукурузы, выращенных, в условиях постоянного освещения синим и красным светом.
Используемые в данной работе новейшие методы заражения и определения титра вируса дают возможность количественно охарактеризовать физиологические процессы, происходящие в больном растении.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение влияния селективного света на рост, морфогенез и формирование гормонального баланса здоровых и инфицированных растений кукурузы, по-разному реагирующих на заражение вирусом мозаичной карликовости (MDMV). Данное исследование приближает нас к пониманию светоиндуцируемых механизмов, повышающих вирусоустойчивость растения.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
проанализировать рост, количество фотосинтетических пигментов, а также гормональный баланс здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных в условиях белого освещения;
изучить особенности роста, пигментного фонда и гормонального баланса здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных в условиях длительного освещения синим и красным светом;
3) оценить влияние селективного света на титр MDMV в различных по
устойчивости к вирусу генотипов кукурузы.
Научная новизна. Работа представляет комплексное исследование регуляции начальных этапов инфекционного процесса на примере различных по устойчивости к MDMV растений кукурузы Zea mays L., выращенных в условиях света разного спектрального состава. Эксперименты с использованием селективного света вносят вклад в развитие представлений о
механизмах фоторегуляции вирусного патогенеза, знание о которых позволит оптимизировать рост и развитие растений.
Показано, что при равных условиях заражения чувствительные, толерантные и устойчивые растения кукурузы по-разному реагируют на заражение вирусом.
Впервые показана зависимость развития вирусной инфекции от качества света. Установлено, что синий свет положительно влияет на морфогенез инфицированных растений восприимчивого генотипа, снижая негативный эффект вирусного поражения, тогда как длительное освещение красными лучами спектра негативно действует на рост и развитие растений всех генотипов.
Впервые получены данные о гормональном балансе здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных при длительном освещении селективным светом. Показана зависимость развития системной приобретенной устойчивости растений от уровня и активности цитокининов. По нашим данным, синий свет может выступать в качестве индуктора противовирусной устойчивости, путем стимуляции образования активных форм цитокининов.
Проведено сравнительное изучение титра MDMV в листьях чувствительных, толерантных и устойчивых растений кукурузы, выращенных в условиях длительного освещения синем и красным светом. Показано, что синий свет способствует снижению концентрации вирусных частиц в листьях растений восприимчивого генотипа. Красный свет влияет на снижение титра вируса в листьях устойчивых и толерантных растений и зависит от генов Mdmln Wsml.
Практическая значимость. Данную работу можно рассматривать как вклад в разработку биологических основ защиты растений от вирусной инфекции, что необходимо для селекционной работы по созданию высокопродуктивных и устойчивых сельскохозяйственных сортов.
На основе полученных данных можно рекомендовать использование синих люминесцентных ламп на начальных этапах онтогенеза в качестве индуктора повышения защитных механизмов растений к вирусной инфекции.
Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета.
1. РОЛЬ СВЕТА РАЗЛИЧНОГО СПЕКТРАЛЬНОГО СОСТАВА В
ЖИЗНИ РАСТЕНИЙ
1.1 Реакция растений на длительное воздействие красного и синего
света
Работы по выяснению адаптивных эффектов аппарата фотосинтеза к качеству света были начаты еще в середине 50-х годов, главным образом Мором, Пирсоном и его учениками. Во всех исследованиях зафиксированы устойчивые различия метаболизма и морфогенеза зеленых растений, выращенных на красном и синем свету. Ответная реакция на синий свет включает ингибирование длины гипокотиля, междоузлий, стимуляцию развития семядолей, регуляцию времени зацветания, фототропические изгибы, а также регуляцию генной экспрессии растений. Красный свет, наоборот усиливает рост стебля и междоузлий у стеблевых растений, сокращает срок вегетации, ускоряя генеративную фазу: выброс цветочной стрелки, образование плодов и как следствие, раннее старение растительного организма (Mohr, 1972).
В настоящее время широко распространено мнение, что синий свет стимулирует белковую, а красный - углеродную направленность метаболизма растений. (Воскресенская Н.П., 1979). Показано, что у растений выращенных на синем свету сумма белков, нуклеиновых кислот, а также нуклеотидов в клетках всегда существенно больше, чем у растений, выращенных на красном свету, что свидетельствует об активации синим светом всего белок-синтезирующего аппарата и увеличении энергетических возможностей клетки (Воскресенская, 1979). Характерный признак растений, длительное время культивируемых на красном свету, - накопление крахмала в хлоропласте и одновременно уменьшение по сравнению с синим светом всех указанных выше показателей.
Существенные различия в тонкой структуре хлоропластов растений, выращенных на красном и синем свету, сохраняются на протяжении всего
периода онтогенеза и усугубляются с возрастом листа. Электронно-микроскопические исследования хлоропластов указывают на то, что синий свет гораздо быстрее активирует образование гран, чем красный. Это сопровождается активацией биосинтеза белка и хлорофилла, что ведет к ускоренному развитию фотосинтетической функции зеленеющих растений. У растений, выращенных на красном свету, менее четко выражена структура гран в хлоропласте. Упаковка ламелл в гране рыхлая, а вся мембранная система менее плотная, чем у растений с синего света. Для тонкой структуры хлоропластов растений, выращенных на красном свету, характерна ее не стойкость, тенденция к прогрессирующему набуханию ламелл и их разрушению (Власова, Воскресенская, 1973; Senger et.al., 1974).
Помимо пластидных пигментов спектральный состав света влияет на образование пигментов клеточного сока. В настоящее время известно, что даже недлительное освещение синим светом, ведет к существенному накоплению — специального пигмента - антоцианина, играющего важную роль в устойчивости растений к стрессовым факторам (Jenkins et.al., 1995).
Наряду с пигментами, отмечено влияние спектрального света на содержание и активность фермента РБФ - карбоксилазы, играющего ведущую роль в самом процессе фотосинтеза. Показано, что в листьях ячменя активность РБФ-карбоксилазы на синем свету была в несколько раз выше, чем на красном в течение всего периода вегетации (Тихомиров, Лисовский, 1991).
По данным многих исследователей различные показатели мезоструктуры листа весьма чувствительны к монохроматическому свету. Показано, что клеточный рост наиболее активен на синем свету, а наименее на красном. На красном свету формируются листья более тонкие, с мелкими хлоропластами, при этом толщина слоя полисадной паренхимы в 2-3 раза меньше по сравнению с губчатой при любом спектре излучения ФАР (Воскресенская, 1979; Карначук, Головацкая, 1998).
При выращивании растений в потоках ФАР различного спектрального состава была установлена видовая специфика реакций высших растений на
спектральный состав света и интенсивность облучения. Такая видовая специфичность наиболее отчетливо наблюдается к красной области спектра, в лучах синей и зеленой областей она выражена слабо, либо вообще не проявляется (Тихомиров, Лисовский, 2000).
При низких значениях ФАР порядка 10-12 Вт/м реакция растений на красный свет фактически отсутствует (Ко, 1982). При уровнях облученности до 50 Вт/м изменения, происходящие в фотосинтетическом аппарате обратимы (Leong, Anderson, 1986; Заворуева и др, 1996; Бухов и др., 1998). Отличия в эффективности излучения красной области спектра при длительном выращивании растений связаны не только с интенсивностью, но и со структурой спектра излучения. При использовании высокоинтенсивного (порядка 100 Вт/м2 ФАР и выше) длинноволнового (600-700 нм) излучения растения гороха, пшеницы, томата, кукурузы, способны не только поддерживать структуру и функциональную активность фотосинтетического аппарата, но и давать хозяйственно - полезный урожай. В то же время у растений редиса и огурца происходит существенное снижение фотосинтеза, и даже гибель растений (Тихомиров, Лисовский, 1991).
Оценка длительного воздействия красного света на ценозы различных видов растений позволяет предположить существование двух групп растений, различающихся по реакции на «чистый» красный свет: первая группа характеризуется нарушением метаболизма и падением продуктивности; вторая группа - отсутствием аномальных изменений в метаболизме и достаточно хорошей продуктивностью (Тихомиров, 2000).
Излучение синей области спектра, в отличие от красной, обеспечивает, как правило, накопление общей биомассы на протяжении всего периода вегетации для разных видов культур. В тоже время не все культуры в синих лучах формируют хозяйственно-полезный урожай, или величина его весьма низка (Тихомиров, 2000).
1.2.Современные представления о фоторецепции зеленых растений
Растения воспринимают свет посредством сложной системы различных фоторецепторов. Как правило, это вещества белковой природы, имеющий специальный пигмент - хромофор и белок — эффектор (апопротеин). Поглощение света хромофором вызывает конформационное изменение в белковой части рецептора, которое передается следующим сигнальным молекулам, что приводит к изменению мембранной проницаемости, экспрессии генов, а далее инициируется целый ряд биофизических, биохимических и физиологических превращений (Кефели, 1975; Ahmad, 1999).
1.2.1. Фоторецепторы красного света
Фитохромы - фоторецепторы, воспринимающий красный (К) и дальний красный спектр излучения (ДК). Установлено, что фитохромы регулирует различные физиологические процессы такие как, прорастание семян, цветение растений, направленность различных биосинтезов и многое другое.
В настоящее время идентифицировано пять монофилетических семейств фитохромов (phy А, В, С, D и Е), имеющих сходную структуру, но кодируемые разными генами. Хромофор является общим для всех фитохромов и представляет собой линейный тетрапиррол, ковалентно связанный с апопротеином (Kendrick, Kronemberg, 1994; Clack, Mathews, 1994).
Фитохром может находиться в активном и неактивном физиологическом состоянии и соответственно этому, запускать либо блокировать те или иные физиологические процессы: неактивное состояние с максимумом поглощения при длине волны X 660 нм (К), и активное - при А. 730 нм (ДК). Эти формы легко переходят друг в друга (Borthwick, 1972).
Установлено, что при облучении светом с X 660 нм образуется около 75% Ф730 и 25% Фббо. Это связанно с тем, что неактивная форма имеет более интенсивное и более селективное поглощение при X 660 нм, чем форма Ф730»
поэтому выход активной формы существенно выше. При облучении светом X 730 нм образуется около 2% Ф7зо и 98% Ф6бо. Образование незначительного количества Ф730 в этом случае связано с очень низким поглощением лучей при X 730 у формы Ф660 (Borthwick, 1972; Mohr, 1972).
Другой важной особенностью фитохрома является наличие у него поглощающей способности не только в красной, но и в сине - фиолетовой области спектра, хотя эффективность поглощения синих лучей ниже, чем красных. Подобные спектральные свойства фитохрома, дают основания считать, что фитохромные эффекты фоторегуляции могут происходить при облучении растений в широком диапазоне видимого света.
Ранее была установлена связь активной формы фитохрома с мембраной цитоплазмы (плазмаллемой), а также мембранами митохондрий и этиопластов. Однако исследования последних лет позволяют усомниться относительно мембранной ассоциации фитохрома (Sineshchekov et. al., 1994). Большинство исследователей придерживаются мнения, что фитохром является растворимым белком, ограниченным в цитозоле (Quail et.al.,1995; Furuya, Schafer,1996), a недавняя работа Nagatani с соавт. продемонстрировала ядерную локализацию фитохрома В (phy В) (Sakamoto, Nagatani, 1996).
Первичный механизм действия фитохромов долго оставался спорным вопросом для исследователей. В настоящее время установлено, что, очевидно, только фитохром А может функционировать как регулируемая светом протеинкиназа (McMichael, Lagarias, 1990), а сигнал трансдукции включает G-белки, ионы Са и циклический GMP в цитоплазме (Bowler, Neuhaus et.al., 1994).
1.2.2. Фоторецепторы синего света и УФ-А радиации
Растения имеют несколько фоторецепторов синего света и УФ-А радиации, которые регулируют различные аспекты роста и развития. Недавние исследования идентифицировали три фоторецептора: криптохром 1 (CRY1), криптохром 2 (CRY 2) и фототропин (Ahmad, Cashmore, 1993; Christie,
Reymond et. al., 1998). В качестве светопоглощающих хромофоров выступают флавины, и птерины (Galland, Senger, 1991).
Криптохромы обладают фотолиазной активностью, которые регулируют рост колеоптиля и время зацветания растений. Фототропин медиирует фототропизмы в ответ на синее излучение и является протеинкиназой, которая регулирует концентрацию цитоплазматического Са2+ (Lin, 1996).
CRY 1 - фоторецептор, регулирующий ряд ответов, основным из которых является ингибирование роста гипокотиля в длину. Синий свет влияет на удлинение гипокотиля посредством двух кинетических фаз: быстрой и медленной. Быстрый ответ происходит в течение нескольких минут или даже секунд экспозиции, а для медленного необходимо не менее часа светового освещения (Briggs, Huala, 1999; Parks et. al., 1998).
Быстрому торможению роста синим светом, предшествует деполяризация плазматической мембраны в клетках гипокотиля растений. Деполяризация мембраны является следствием раскрытия ионных каналов, т.к. синий свет вызывает быструю (в течение 1 мин.) активацию их работы. Вслед за активацией ионных каналов начинается медленная фаза, завершающаяся повышением водного потенциала в клетках, что ведет к замедлению их роста (Cho, Spalding, 1996). Медленный ответ ингибирования гипокотиля не произойдет, по крайней мере, час после облучения синим светом. Показано, что именно этого времени достаточно для изменения экспрессии гена (Briggs, Huala, 1999; Parks et. al., 1998).
Показано, что криптохромы функционируют не только в синей области спектра, но также чувствительны к UV-A радиации (320-390 нм). Эксперименты по облучению UV-A радиацией мутанта Arabidopsis thaliana cryl показали, что CRY 1 участвует в регуляции экспрессии генов, кодирующих фермент хальконсинтазу (CHS), ключевого фермента в биосинтезе флавоноидов.(Іепкіп5, Christie et.al., 1995). Кроме того, предварительная обработка красным светом усиливает последующую медиацию CRY1 и индукцию CHS.
Фототропин - флавопротеин, который регулирует фототропические изменения в ответ на излучение синем светом и УФ-А радиацией. Фототропин — является белком с серии - треонин киназной активностью, способной фосфорилировать остатки серина и треонина. Фототропин связан с плазматической мембраной растений, но природа этих связей до конца не выяснена (Christie, Reymond et. al., 1998).
На мутантах Arabidopsis thaliana (L.) идентифицировали два рецептора NPH1 и NPH3, ответственные за фототропические реакции (Huala et.al.,1997; Motchoulski, Liscum, 1999). Ген NPH1 кодирует 120 kDa белок, связанный с цитоплазматической мембраной. Бриггс с сотрудниками выявили быстрый эффект (меньше чем 1 сек освещения) синего света на фосфорилирование этого белка. Максимальное фосфорилирование наблюдалось в растущей области стебля и физиологические ответы растений были сходны с фототропизмом (Briggs, Huala, 1999).
1.2.3. Молекулярно-генетическая модель восприятия светового
сигнала
Процессы трансдукции сигнала, которые соединяют фоторецепцию с ответом, являются ключевым моментом в понимании действия света на рост и развитие растений.
Цепь компонентов на пути трансдукции состоит из большого числа сигнальных молекул, которые не только преобразовывают световой сигнал, но и усиливают , и в некоторых случаях накапливают его.
Два основных подхода используется в изучении трансдукции световых сигналов: генетический и биохимический (Schafer et. al., 1997).
Генетический подход основан на идентификации генов, включающихся в ответ на световое излучение.
ФОТОРЕЦЕПТОР СИГНАЛ ОТВЕТ
ТРАНСДУКЦИИ
phyA FHY1,FHY3
СВЕТ
к к
Синий /УФ-А Синий /УФ-А Синий /УФ-А УФ-В
CRY1
CRY2/PHH NPH1/NPH3 -NPIT2-4 UV-B (рецептор?)
HY5 СОР1
СОР 9,8,11 DET1
G-белок цГМФ Са+2 Кальмодулин
прорастание
де-этиоляция блок защиты
цветение
фототропизм
UV-защита
Упрощенная схема показывает некоторые компоненты участвующие в рецепции света и сигналах трансдукции (Batschauer, 1998).
Все гены указанных фоторецепторов (кроме UV-B) и сигнальные компоненты (HY5, СОР1,СОР9, СОРИ, DET1) были клонированы из Arabidopsis thaliana.
В результате исследований было показано участие генов FHY1 и FHY3 в сигнале трансдукции phyA, RED1 в сигнале трансдукции phyB, и NPH 2-4 в сигнале трансдукции фоторецептора NPH1.
Используя биохимические подходы, были идентифицированы
сигнальные молекулы выполняющие роль вторичных внутриклеточных мессенджеров трансдукции светового сигнала : G- белки, цГМФ, Са+2 и кальмодулин (Neuhaus et.al.,1993).
Показана функция цГМФ стимулирующего накопление антоцианов и экспрессию CHS, тогда как Са и кальмодулин стимулирует экспрессию CAB гена, разрешающего начальное развитие хлоропласт и экспрессию дополнительных генов необходимых для полного развития зрелых хлоропластов (Neuhaus et.al.,1993).
Хотя в последние годы получено немало информации о структуре и функциях растительных фоторецепторов и о компонентах трансдукции светового сигнала, исследователи далеки от понимания работы целого механизма, т.к. это осложняется включением многих внутренних стимулов (гормонов, углеводов) и внешних факторов как абиотических, так и биотических.
2. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ И МЕХАНИЗМЫ
УСТОЙЧИВОСТИ К НИМ
2.1. Влияние вирусной инфекции на рост и развитие растений
Наиболее характерным симптомом вирусных заболеваний является нарушение роста растений. Степень угнетения роста больных растений зависит от их реакции на заболевание. Вирусное поражение вызывает заметное подавление роста у системно реагирующих растений и слабо влияет на рост растений с некротической реакцией на заболевание (Caborianyi, Sagi et al., 1973).
Некоторые вирусы вызывают особенно сильное торможение роста, что приводит к появлению карликовых форм растений. К ним относятся вирус мозаики озимой пшеницы, вирус карликовой мозаичности кукурузы и многие другие вирусы ( Сухов, 1959).
Торможение роста растений при вирусном заболевании определяется как снижением числа клеточных делений, так и подавлением растяжения клеток (Журавлев, Савельева, 1973).
При некоторых вирусных заболеваниях наблюдается более или менее равномерная задержка роста всех органов растения, но иногда вирусная инфекция подавляет рост одних органов в значительно большей степени, чем других. Часто инфицируемые вирусом карликовости растения менее интенсивно растут в высоту и больше кустятся по сравнению со здоровыми (Campbell, 1971). Такое явление обусловлено тем, что растение представляет собой сложную гетерогенную в возрастном отношении систему с различной пластохронной характеристикой каждого листа и даже отдельных его частей. Кроме того, при обычных методах инокуляции и при заражении в естественных условиях разные части растения инфицируются не одновременно, что еще больше усложняет воздействие заболевания на процессы роста и развития его органов (Ashby, 1970).
Вирусное поражение растений может сопровождаться местной гиперплазией. Например, при мозаичных заболеваниях часто происходит неравномерный рост листовой пластинки; края листа скручиваются и имеют неправильную форму. В результате несоответствия роста жилок и других тканей листьев возникает морщинистость листа, характерная для многих вирусных заболеваний. Часто гиперплазия выражается в образовании энаций на верхней или нижней поверхности листа. Местное разрастание ткани, особенно в корнях, характерно для болезни раневых опухолей (Black, 1950).
Вирусная инфекция вызывает нарушения в цветении и плодоношении растений. При заражении растений Vicia faba L. вирусом скручивания листьев фасоли все цветки опадают, новые не распускаются, а в уже завязавшихся плодах образуются мелкие семена (Гиббс, Харрисон, 1978). У растений риса при штриховатости риса образующиеся метелки часто остаются стерильными (Рейфман, Крылов, и др., 1976). У овса, пораженного закукливанием, метелки не образуются, а если они развиваются, то колоски бывают стерильными (Развязкина, 1975).
2.2. Физиологические процессы больного растения
Размножаясь в растительных клетках и используя их ресурсы для своей репродукции, вирусы неизбежно вызывают нарушения в обмене веществ хозяина. Сильно вирулентные штаммы вируса могут вызывать остро протекающий патологический процесс, приводящий растение к гибели. В других случаях растение переносит патогенное действие вируса, подвергаясь хроническому заболеванию, длящемуся в течение всей его жизни. В каждой фазе заболевания физиология больного растения оказывается в той или иной степени измененной, что создает особые условия для репродукции в нем вируса (Сухов, 1956).
Дыхание растений, несомненно, подвергается влиянию со стороны вирусной инфекции, но изменение его зависит как от фазы болезни, так и от
возрастного и физиологического состояния растения. Вскоре после заражения активность дыхания растений увеличивается, а затем падает. Так, например, молодые растения табака, зараженные вирусом огуречной мозаики, дышат интенсивнее, чем здоровые, тогда как у взрослых зараженных растений уровень дыхания, наоборот, ниже. При некоторых вирусных заболеваниях повышение дыхания оказывается довольно постоянным и сильным. Например, выделение углекислоты листьями мозаичной малины на 20-40 % превышает выделение ее здоровыми листьями (Сухов, 1956).
Пик дыхания и активности окислительных ферментов наступает на несколько дней раньше, чем пик концентрации вирусных частиц. Следовательно, активизация дыхания связана скорее не с процессом синтеза вирусных частиц, а с защитными реакциями хозяина. Возможно, в связи с этим, активный синтез вируса начинается после того, как интенсивность дыхания зараженных растений падает (Дьяков, 1984).
При заболеваниях мозаичного и желтушного типов происходит посветление и пожелтение листьев или отдельных их участков. Это связано с разрушением хлорофилла в результате активации фермента хлорофиллиназы. Вследствие этого почти для всех вирусных болезней характерно снижение активности фотосинтеза и уменьшение общего содержания углеводов. Кроме того, почти при всех вирусных болезнях происходит нарушение транспорта продуктов фотосинтеза из листьев в другие органы. Особенно это характерно для желтух, возбудители которых часто локализуются во флоэме и вызывают различные её поражения. Например, в листьях картофеля, пораженного скручиванием, накапливается большое количество крахмала, который перегружает паренхимные клетки. Листья становятся толстыми, кожистыми, хрупкими, с характерным блеском.
Возбудители мозаичных заболеваний чаще находятся в паренхиме. При мозаичных болезнях задержка передвижения крахмала из листьев обусловлена изменением проницаемости паренхимных клеток или изменением активности карбогидраз в них (Боуден, 1952).
Нарушение азотного обмена так же наблюдается почти при всех вирусных болезнях. Например, в случае заражения табака возбудителем мозаики общее количество азота в растении не меняется, однако значительная его часть потребляется на построение вирусных частиц. Таким образом, вирусный белок в основном образуется за счет белка растения-хозяина. В условиях дефицита азота количество небелкового азота в зараженных растениях сильно снижается. При избытке азота содержание свободных аминокислот, наоборот, увеличивается, что связано с усилением гидролиза растительных белков (Гиббс, Харрисон, 1978).
Симптомами многих вирусных болезней являются задержка роста, формирование пазушных почек и др., что свидетельствует о нарушении обмена гормональных веществ - стимуляторов и ингибиторов роста растений.
2.3. Эффекты вирусной инфекции на гормональную систему растений
Одну из главных ролей в регуляции процессов роста и органогенеза растений выполняют фитогормоны. Показано, что наблюдаемые при вирусном поражении различные нарушения в морфогенезе больных растений связаны с изменением гормонального баланса. Отмечено одинаковое влияние вирусной инфекции и солей Ni, Си, Hg, вызывающих появление некрозов, на образование этилена с локальной реакцией на заболевание (Nakagaki, et. al., 1980)
Известно, что процессы старения растений во многом схожи с процессом заболевания. Так, в первых же работах по влиянию кинетина на процессы старения в листьях было установленно, что цитокинин значительно активирует приток к обработанным им участкам листа подвижных метаболитов из других, не обработанных участков и за счет этого происходит увеличение содержания в снабженных цитокинином частях листа белка и РНК (Mothes et. al., 1959; Wollgiehn, 1961). Однако, O.H. Кулаевой было показано, что повышение количества белка в обработанных кинетином листьях происходило не за счет
аттрагирующего эффекта цитокининов, а за счет активации синтеза белка, либо за счет торможения его распада (Кулаева, Воробьева, 1962).
Показано, что с помощью экзогенных стимуляторов роста можно снимать вызванное заболеванием торможение роста. Скорость роста больных растений увеличивается, но симптомы не исчезают, и в растениях присутствует активный вирус (Fernandez, Gaborjanyi, 1977).
Данные по влиянию фитогормонов на размножение вирусов противоречивы. Так, М.И. Гольдин и Н.Г. Лапидус не обнаружили действие гибберелловой кислоты на репродукцию ВТМ (Гольдин, Лапидус, 1960). Имеются сведения о стимулирующем влиянии ауксинов и цитокининов на развитие некрозов и размножение вирусов (Kluge, Paunow, 1977, Simons, Israel, 1972 ). Однако в последнее время появляется все больше сведений в пользу ингибирующего эффекта экзогенными ростовыми веществами (Kiraly ,Pozsar, 1964; Kuriger, Agrios, 1977 et. al). Показано, что экзогенное применение цитокининов: дигидрозеатина и дигидрозеатин рибозида, ведет к ингибированию вирусной репликации в листьях фасоли инфицированных вирусом мозаики белого клевера (Clarke et. al., 1998).
Вирусы не одинаково влияют на содержание фитогормонов в больных растениях. Например, поражение вирусом курчавости верхушки сахарной свеклы вызывало у растений томатов и фасоли значительное снижение содержания ауксинов, причем существенных различий между устойчивыми и восприимчивыми растениями не наблюдалось (Smith, 1968). У растений томатов, инфицированных ВТМ, сразу после заражения уменьшалось содержание свободных ауксинов, и это снижение коррелировало с задержкой роста (Pavillard, 1957). Наоборот, X. Ярош обнаружил повышение содержания ауксинов в листьях картофеля, зараженного Х-вирусом картофеля в течение первых двух недель., на более поздних стадиях развития содержание их снижалось ( Jaros, 1969).
Таким образом, многие растения, пораженные различными вирусами, характеризуются задержкой роста и пониженной активностью ауксинов,
определяемой в растительных экстрактах с помощью биотестов. Снижение активности ауксинов может быть вызвано уменьшением их количества в инфицированных растениях в результате окисления или угнетения их синтеза (с увеличением содержания ингибиторов роста, маскирующих действие ауксинов) или действием обоих механизмов. Б. Грайв показал уменьшение содержания ауксинов в листьях томатов, и впервые предположил, что ауксины в больных растениях разрушаются ИУК-оксидазой ( Grieve, 1956).
Ю. Танг и Ж. Боннер из проростков гороха выделили фермент — ауксиноксидазу, участвующий в окислении ИУК (Tang, Bonner, 1958). Сейчас накоплено большое количество данных, свидетельствующих о роли разрушающих ИУК ферментных систем в регуляции ее содержания в тканях. Например, изменение активности ауксиноксидазы в значительной степени зависит от времени, прошедшего с момента заражения. У растений табака активность этого фермента резко возрастает сразу после инокуляции и достигает максимума ко времени проявления первичных симптомов заболевания. Затем по мере развития болезни она уменьшается до контрольного уровня и ниже (Малиновский, Журавлев, 1975). Однако, в листьях хлопчатника, инфицированных вирусом мелколистности хлопчатника, отмечено снижение активности ауксиноксидазы при хроническом заболевании (Narayanasamy, et. al., 1982).
Противоречивые данные о характере влияния вирусной инфекции на активность ауксиноксидазы, по-видимому, объясняются тем, что активность фермента определяли на разных стадиях заболевания растений. Во-первых, активность ауксиноксидазы с возрастом растений увеличивается, во-вторых, вирусное поражение неодинаково влияет на активность фермента в листьях разных ярусов. Вскоре после заражения активность ауксиноксидазы в листьях нижнего и среднего ярусов растений табака увеличивается и продолжает оставаться повышенной. В противоположность этому у листьев верхнего яруса она снижается сразу после инокуляции и остается на этом уровне. Возможно, снижение активности ауксиноксидазы в верхних листьях при заболевании -
защитная реакция растений, препятствующая уменьшению содержания свободной ИУК в верхушке растения и тем самым замедляющая торможение роста, обусловленное вирусным поражением (Малиновский В.И., Журавлев и др., 1976).
Многочисленные исследования показали, что активность ауксиноксидазы в значительной мере определяется присутствующими в клетках кофакторами и ингибиторами фермента (Furuya М et. al., 1982).
Содержание ауксинов в растениях, инфицированных вирусами, уменьшается так же в результате угнетения их синтеза. При заражении табака ВТМ подавляется активность ауксинсинтетазы в листьях всех ярусов. Особенно это характерно для нижних листьев, которые к моменту проявления вторичных симптомов заболевания (мозаика верхних листьев) полностью теряют свою ауксинсинтезирующую способность (Малиновский, Журавлев, 1976).
Возможно, вирусная инфекция не только влияет на содержание ауксинов в растениях, но и воздействует на механизм проявления ауксинами гормональной активности. Согласно гипотезе, высказанной А. Бэром, ауксины регулируют синтетические процессы в клетке, непосредственно взаимодействуя с нуклеопротеидами (Ber , 1959). Однако, не выяснено, что именно - не деградированная ИУК или продукты её метаболизма -связываются с нуклеопротеидами. В любом случае, вызванные заболеванием нарушения в интенсивности связывания приводят к изменению в содержании свободной ИУК, что, конечно, влияет на регуляторную активность этого фитогормона. Поскольку между связыванием ИУК с нуклеопротеидами и скоростью роста растений наблюдается положительная корреляция, то вирус-индуцированные изменения в связывании ИУК могут играть определенную роль в активации роста растений в начале заболевания и в подавлении — на более поздних стадиях болезни (Меркис, Новицкене, 1983).
Снижение активности стимуляторов роста при вирусном заболевании может быть также обусловленно накоплением в больных растениях ингибиторов роста. Взаимодействие стимуляторов и ингибиторов роста в
растении имеет сложный характер и, по мнению В.И. Кефели может осуществляться на этапах синтеза, функционирования разрушения этих соединений (Кефели, 1966). На этапе биосинтеза это взаимодействие проявляется в конкуренции за общие предшественники, так как ауксины и многие фенольные ингибиторы образуются из шикимовой кислоты, а гиббереллины и абсцизовая кислота - из мевалоновой. На втором этапе ингибиторы выступают как антагонисты стимуляторов роста и тормозят проявление их ростовой активности. На третьем этапе взаимодействие проявляется в участии некоторых фенолов в окислении ауксинов (Hare, 1964). Кроме того, этилен, абсцизовая кислота и другие ингибиторы роста способны активировать окисление ауксинов (Эйдельнант, Есипова , 1974).
В настоящее время получен ряд доказательств увеличения содержания свободных и связанных кумаринов при мозаичных заболеваниях цитрусовых (Feldman, Hanks, 1969). Показано накопление полифенолов и флавоноидов в растениях табака при заболевании (Tanguy , Martin, 1971). Р Бест обнаружил увеличение флюоресценции у растений табака при заражении вирусом бронзовости томатов за счет присутствия в растительной ткани скополетина (Best, 1954). Скополетин и некоторые другие дериваты кумарина в зависимости от условий подавляют или активируют фотоокисление ИУК и тем самым могут влиять на содержание ауксинов в зараженных вирусами растениях (Andreae, 1962).
Известно, что растения, в качестве универсальной ответной реакции на различные стрессовые воздействия, в том числе на проникновение патогенов, накапливают АБК. Например, поражение ВТМ растений табака увеличивает содержание этого ингибитора роста пропорционально накоплению вируса (Gaborianyi, 1973).
Опыты на растениях табака показали, что инокулированные листья выделяют этилен, причем продуцирование его является результатом некрозообразования. Показано, что у растений с локальной реакцией на заболевание вирусная инфекция стимулирует образование этилена, количество
которого положительно коррелирует с числом некрозов. При системном поражении синтез этилена существенно не меняется, но в процессе старения его содержание у больных растений возрастает с большой скоростью, чем у здоровых (Nakagaki, Hirai, 1980).
Давно установлен факт изменения содержания цитокининов в ответ на вирусную инфекцию. В растениях, системно реагирующих на заражение вирусом, содержание цитокининов заметно увеличивается, причем оно более высокое в темно-зеленых участках листьев, чем в светло-зеленых (Schuster, 1971). Аткинсон и Мэтьюз выявили, что в темно-зеленых участках листьев наряду с высоким содержанием цитокининов накопление вируса значительно сокращается по сравнению со светло-зелеными или желтыми участками (Atkinson, Matthews, 1967). Клетки темно-зеленых зон длительное время остаются почти свободными от вируса, хотя находятся в контакте и связаны плазмодесмами с клетками светло-зеленых зон, содержащих массы вирусных частиц (Atkinson, Matthews, 1970; Reid, Matthews, 1972). Некоторые авторы связывают подавление репликации вируса в темно-зеленых участках листа с накоплением в них цитокининов. Также показано, что гидролизованная РНК ВТМ имеет компоненты с цитокининовой активностью (Herrmann, Oelmueller, 1991). Кроме того, Sziraki и др. показали, что развитие системной приобретенной устойчивости совпадает с увеличением содержания зеатина и зеатин-рибозида в устойчивых листьях (Sziraki, Balazs, Kiraly, 1980). Было предположено, что повышение концентрации цитокининов является неотъемлемой частью для развития противовирусной устойчивости растений. Кларк с соавторами предоставили детальную картину изменения эндогенных цитокининов в ответ на поражение бобов (Paseolus vulgaris) вирусом белой мозаичности клевера. В результате исследования были отмечены количественные изменения в цитокининовом профиле. Концентрация свободных форм и дигидрозеатин рибозида понижалась, сопровождаясь повышением 9-глюкозидов и нуклеотидов, титр вируса при этом резко повышался (Clarke, Burritt, Jameson, 1998).
Механизм изменения подобного метаболизма до конца не выяснен, возможно, это происходит за счет ингибирования перехода нуклеотидов в активные формы или увеличение активности ферментов, которые превращают свободные формы и рибозиды в нуклеотиды. Было высказано предположение, что понижение свободных форм цитокининов и рибозидов позволяет повышаться вирусному титру в растениях, и ведет к старению и гибели инфекционных листьев (Jameson, 1994).
Кроме того, Сано, Агростино и др. отнесли ЦК к компонентам защиты растений с участием в трансдукции сигналов патологического пути и экспрессии некоторых защитных генов (Sano, Seo, 1994; Sano, Ohashi, 1995; Agrostino, 1999).
2.4. Физиолого-биохимические основы вирусного иммунитета
растений
2.4.1. Механизмы растительного иммунного ответа
За последние годы достигнут определенный прогресс в изучении биохимических молекулярных механизмов устойчивости растений к инфекционным заболевания, в том числе и к вирусным (Бернет, 1971).
Хотя вирусы отличаются относительно слабой специфичностью и отдельные их виды могут поражать довольно широкий круг хозяев, все же в пределах наиболее поражаемых семейств, всегда можно обнаружить виды, иммунные к тому или иному вирусному заболеванию.
Исследования последних лет позволили установить, что специфичность фитоиммунитета определяется на начальных этапах взаимодействия генов паразита и растения - хозяина. К настоящему времени относительно хорошо изучены продукты генов авирулентности патогенов (элиситоры) и совсем мало исследованы продукты генов устойчивости растений — рецепторы элиситоров (R-гены).
Изучение взаимоотношений растений с патогенами привело американского фитопатолога Флора к созданию теории «ген на ген». Согласно этой теории, несовместимость паразита и хозяина возможна только при наличии у партнеров двух взаимодействующих доминантных генов, при любых других сочетаниях реакция растения с патогеном окажется совместимой. В случае несовместимости взаимодействуют продукты генов устойчивости растения (R-гены) с продуктами генов авирулентности патогена (avr-гены). Потеря или изменение одним из партнеров гена устойчивости или авирулентности сделает их реакцию совместимой (Flor, 1971).
Предполагается, что некие метаболиты растений (рецепторы), синтезируемые под контролем генов устойчивости, узнают чужеродные метаболиты патогенов, контролируемые комплиментарными генами авирулентности, в результате чего индуцируются защитные ответы. Отсутствие у хозяина рецептора вследствие изменения (потери гена) устойчивости, или отсутствие у вируса метаболита, связываемого рецептором, вследствие изменения (потери) гена авирулентности, приводят к тому, что паразит перестаёт узнаваться растением, и иммунные реакции либо не включаются, либо включаются слишком слабо и поздно (Озерецковская, 2002).
Таким образом, в концепции Флор должны функционировать, по крайней мере, четыре типа факторов: 1) гены авирулентности и кодируемые ими соединения, получившие название элиситоров; 2) гены устойчивости и их продукты — рецепторы; 3) трансдукторы сигналов, передающие информацию на геном; 4) гены иммунного ответа. Два первых фактора специфичны, тогда как два последних - неспецифичны (Дьяков, 1996).
Вышесказанное соответствует представлению о двух фазах индукции устойчивости у растений. Во время первой специфической фазы, называемой детерминантнои, происходит взаимное распознавание партнеров, в результате чего определяется, будет ли растение здоровым или заболеет. За специфической детерминантнои фазой следует неспецифическая
экспрессивная, на протяжении которого включаются или не включаются защитные механизмы растений.
К настоящему времени относительно хорошо известны лишь конечные результаты экспрессивной фазы взаимодействия паразита и растения. В значительно меньшей мере исследованы начальные факторы детерминантной фазы - продукты генов авирулентности - элиситоры и совсем мало известны кодируемые генами устойчивости рецепторы (Озерецковская, 2002).
Что касается процессов передачи защитных сигналов, то в настоящее время постепенно высвечиваются события, происходящие между детерминантной и экспрессивной фазами (Тарчевский, 2000; Гречкин, Тарчевский, 1999). Они включают систему внутриклеточных мессенджеров, которые инициируются в результате взаимодействия элиситоров и рецепторов. Конечным этапом мультикомпонентного иммунного ответа растительной ткани является образование неспецифических элиситоров, которые индуцируют иммунные ответы у любого сорта растения, независимо от присутствующих в нем генов устойчивости. Такими элиситорами являются фитоалексины, PR-белки, жасмонаты и салицилаты, ингибиторы протеиназ, активные формы кислорода и азота, и другие вещества ( Гречкин, Тарчевский, 1999; Bol, Linthorst, 1990).
2.4.2. Роль индукторов устойчивости в процессе вирусного патогенеза
растений
В настоящее время известно, что устойчивость растений к различным патогенам, в том числе и вирусам, четко коррелирует со способностью растений продуцировать фитоалексины (ФА).
Все обнаруженные ФА — вещества вторичного происхождения, продукты специализированного обмена. Для их биосинтеза используются или активируются уже имеющиеся в растительных клетках биосинтетические пути,
последние этапы которых связаны с образованием соответствующих ферментов de novo (Метлицкий, 1987).
ФА обладают широким спектром антибиотического действия: они подавляют рост различных микроорганизмов и нематод, а так же оказывают токсическое действие на организм млекопитающих. ФА в силу широкого антибиотического спектра действия оказывают токсическое воздействие на растительные клетки, в которых образуются. Для сохранения собственной целостности растения обладают различными механизмами, один из которых — реакция сверхчувствительности. Она заключается в том, что клетки устойчивых сортов растений обладают столь высокой чувствительностью, что погибают (некротизируются) сразу же после проникновения в них паразита. Растение защищается ценой гибели своих же клеток, что определяет последующую гибель проникшего в них паразита. Причем причина гибели паразита оставалась неизвестной до открытия ФА. Оказалось, что именно ФА, образуясь в здоровых, прилегающих к некротизированным клеткам, мигрируют в некротизированные, где и накапливаются до токсичных для паразита концентраций. Зона некротизированных клеток вместе с локализованным в них паразитом отторгается от здоровых тканей отдельным барьером из перидермальных клеток (Метлицкий, 1987).
В последнее время, объектом пристального внимания остается изучение и поиск новых защитных белков, связанных с вирусным патогенезом растений. В начале 70-х годов Van Loon, Van Kammen и Gianinazzi , независимо друг то друга опубликовали сообщения о синтезе нескольких белков в растениях табака, сверхчувствительно реагирующих на заражение ВТМ (Van Loon & Van Kammen, 1970; Gianinazzi et. al., 1970). Выявлены стимуляторы образования PR-белков, такие как: полиакриловая кислота, этефон (который переходит в этилен), ароматические соединения, такие как бензойная, салициловая и ацетилсалициловая кислоты; аминокислотные производные и др. соединений (Bol, 1988; Van Loon, 1985). Так же эти белки были охарактеризованы по их кислотной природе, по их устойчивости к растительным протеазам и по их
расположению в клетке (PR-белки накапливаются в вакуолях) (Parent & Asselin, 1984). Позднее были определены основные гомологи для группы кислотных PR белков.
К настоящему времени из растений табака инфицированных ВТМ выделено и идентифицировано более 20 кислотных и основных PR-белков, участвующих в защитных механизмах растений против патогенов (Friting et. al., 1989; Kauffmann, 1988). Эти белки были классифицированны на 5 групп (Van Lun и др., 1987). Группа 1 включает в себя 16 кД PR 1-белки, их функция недостаточно изучена. РЛ2-белки составляют вторую группу и характеризуются |3-1,3-глюканазной активностью (Kauffmann, 1987), которые в чрезвычайно малых концентрациях индуцируют образование фитоалексинов. На плазматической мембране клеток некоторых растений существуют центры связывания гептаглюкозида, причем связывающая активность коррелирует со способностью к образованию фитоалексинов (Элберсгейм, Дарвилл, 1985).
Инфекция ВТМ стимулирует образование четырех табачных хитиназ двух кислотных PR-белков и двух основных PR-белков. Все белки серологически связанны и составляют третью группу. Хотя основные хитиназы в 6 раз активнее чем их кислотные изозимы, тем не менее кислотные формы составляют одну треть её активности (Legrand et. al., 1987).
Четвертая группа включает в себя белки с низким молекулярным весом, но они охарактеризованы в меньших деталях ( Pierpoint, 1986 & Vann Loon, 1987).
Два кислотных белка PR-R и PR-S и один основной 24-кД белок выделены и зачислены в пятую группу защитных белков. 24-кД белок идентичен осмотину, белку, продуцируемому в табаке в ответ на солевой стресс (Singh et. al., 1987). Все три белка демонстрируют 65% гомологию аминокислотной последовательности с белком тауматином (Comelissen, Hooft van Huijsdujen, Bol, 1986; Pierpoint et. al., 1987; Singh, 1987). Сходная степень гомологии была обнаружена с белком кукурузы, являющимся
бифункциональным ингибитором а-амилазы и протеазы насекомых (Richardson et.al., 1987).
Белки, связанные серологически или по сходству аминокислотных последовательнотей, индуцируемые в ответ на заражение ВТМ, найдены в свыше 20 видах растений, включая как однодольные, так и двудольные (Bol, 1988; Bol et. al., 1990). Защитные белки, составляют около 10% от всех растворимых белков и широко распространены в царстве растений.
Исследования последних лет показали, что в механизмах противовирусной устойчивости не малую роль играет жасмоновая кислота и родственные ей соединения. Например, жасмоновая кислота является сигнальной молекулой, которая образуется в растениях в ответ на различные стрессы, такие как ранение или патогенная атака (Greelman et. al., 1992). Накоплению жасмоновои кислоты предшествует активация митоген-активной протеин киназы, фермента играющего центральную роль в трансдукции разнообразных внешних стимулов. Предполагают, что жасмонаты транспортируются как локально, так и системно в пределах раненого растения (Anderson, 1985). Будучи летучими соединениями жасмонаты так же способны перемещаться по воздуху и проникать в соседние растения, вызывая в них характерные защитные реакции (Farmer, Ryan, 1992). Как вторичные мессенджеры, звырабатываемые растениями в ответ на патогенную атаку, жасмонаты запускают программу экспрессии защитных генов, которые на ранней стадии включают синтез определенных защитных белков, а на более поздней стадии патогенеза включает общую депрессию биосинтеза белков растения. Обе стадии, вероятно, связаны между собой, т.к. один из недавно идентифицированных белков JIP60, является белком инактивирующим рибосомы, который необратимо подавляет синтез растительных белков и вызывает смерть клетки (Becker, Apel, 1994). В связи с этим предполагается участие жасмоновои кислоты в реакциях сверхчувствительности растений на стресс. Известно пять групп растительных защитных белков, чей синтез стимулируется жасмонатами : ингибиторы протеиназ, тионины, обогащенные
пролином белки, энзимы, вовлеченные в фенилпропановый метаболизм и белки инактивирующие рибосомы (Reinbothe, Mollenhauer, 1994).
Среди множества индукторов устойчивости растений ведущее место занимает салициловая кислота (СК). Хорошо известно, что СК - важный компонент в цепи реакций, ведущих к развитию местной и системной защиты клеток растений от различных патогенов. Так, White еще в 1979 году установил, что обработка СК повышает сопротивление растений табака к инфекции ВТМ (White, 1979). Способность синтезировать СК в ответ на атаку патогенов кореллирует с устойчивостью растения. Растения, неспособные увеличивать внутриклеточную концентрацию СК, оказываются более чувствительными к вирусу: индуцируются более крупные некрозы, облегчается распространение вируса (Миг, Darby, 1997).
Предварительная обработка восприимчивых растений табака, зараженных ВТМ, СК сокращает уровень вирусной РНК и подавляет аккумуляцию белка вирусной оболочки. В устойчивых растениях табака, отвечающих на заражение ВТМ реакцией сверхчувствительности, происходит моментальное увеличение уровня СК в тканях (Malamy et. al., 1990) и стимуляция системной приобретенной устойчивости (SAR). Так же результаты изучения заражения восприимчивого генотипа вигны китайской вирусом мозаики люцерны (A1MV) показали, что обработка СК ведет к полному подавлению репликации этого вируса в протопластах (Hooft van Huijsdujen et. al., 1986). В зараженной ткани СК вызывает не только общую редукцию ВТМ, но так же влияет на изменение баланса РНК ВТМ от правовращающих в сторону левовращающих, а так же от полной длинны в сторону субгеномной. Предполагается, что СК вмешивается в процесс нормального функционирования вирусного RdRp комплекса, благодаря подавлению репликации и транскрипции вирусных частиц
В существующих схемах механизма её действия акцентируется внимание на связи с «окислительным взрывом» и индукцией PR-белков (Cutt, Klessig, 1992). Вместе с тем имеются данные о возможном влиянии СК на
межклеточные связи, приводящие к изменениям в животных клетках аглютинирующих свойств и способности к агрегации (Abramson, Korchak et. al., 1985). В отношении растительных клеток известна лишь одна работа о быстром и обратимом воздействии СК на электрическую проводимость плазмодесм водного папоротника сальвинии (Лялин, Ктиторова et. al., 1986). Однако, для клеток мезофилла подобный эффект СК не был обнаружен, т.к. мезофильные клетки толстостенные и мелкие, что затрудняет применение электрофизиологических методов (Красавина, Малышенко, 2002).
СК стимулирует образование каллозы, препятствует модификации плазмодесм и изменениям их пропускной способности под влиянием вируса в начальный период инфекции (Красавина, Малышенко, 2002). Известно, что образование каллозы в устьях плазмодесм может тормозить транспорт низкомолекулярных веществ - ионов и углеводов (Olesen, Robards, 1990). Известно также, что при патогенезе образование каллозы, наряду с лигнификацией клеточных стенок, ограничивает распространение инфекции (Wu, Dimitman, 1970). Показан синтез каллозы в местах контакта с патогеном. Кроме того, в мутантах, дефицитных по ферменту деградации каллозы, (3-1,3-глюканазе, тормозится распространение вирусной инфекции (Iglesias, Meins, 2000). В последних случаях речь идет об образовании в клеточной стенке защитного слоя, достаточно толстого, способствующего изоляции мест инфекции. В работах М.С. Красавиной и СИ. Малышенко показана возможность обратимого образования каллозы в плазмодесмах, которое может происходить сразу после инокуляции и ограничить межклеточный транспорт вируса еще до создания структурного барьера. СК стимулирует этот процесс (Красавина, Малышенко, 2002).
2.5. Транспорт вирусной инфекции в растении
При заражении растений вирус сначала проникает в незначительное число первично-инфицированных клеток. Дальнейшие этапы развития
инфекции протекают по-разному в восприимчивых и устойчивых растениях. В восприимчивом растении вирус из первично-инфицированных клеток перемещается по плазмодесмам в соседние, здоровые клетки в пределах инфицированного листа (ближний транспорт) и по сосудистой системе стебля на большие расстояния (дальний транспорт). Во многих видах устойчивых растений репродукция вируса ограничивается первично инфицированными клетками, за пределы которых вирусная инфекция не распространяется, то есть наблюдается блок транспорта вирусной инфекции. В таких растениях инфекция протекает без симптомов. Этот пример свидетельствует о тесной взаимосвязи между процессами транспорта вирусной инфекции и устойчивостью растений к вирусам (Matthews, 1981).
2.5.1. Межклеточный транспорт фитовирусов в растении
В растениях транспорт вирусной инфекции в пределах листа, осуществляется через плазмодесмы (Matthews, 1981; Atabekov, Dorokhov, 1984; et. al.).
Исследования структуры плазмодесм показали, что они представляют собой однородный цитоплазматический тяж, соединяющий соседние клетки. В состав плазмодесмы входит десмотрубочка диаметром 200 А со сложным внутренним строением. Цитоплазматическое отверстие плазмодесмы подразделено на 10-20 цилиндрических каналов (Robards, 1975; Gunning Overall, 1983). Эндоплазматические мембраны десмотрубочки находятся в тесном контакте с эндоплазматическим ретикулумом цитоплазмы растительных клеток в составе симпласта, участвующим в транспорте метаболитов между клетками (Robards, 1975). Верхним пределом пропускной способности плазмодесмы является молекула размером 1000 кД (Hull, 1989) и подавляется молекулами Са и полифосфоинозитами (Baron - Epel et. al., 1988).
В настоящее время существует ряд неопровержимых доказательств в пользу ключевой роли плазмодесм в процессе распространении вируса из клетки в клетку: скорость транспорта инфекции в мезофилле определяется
числом плазмодесм (Shalla et. al., 1982); во время инфицирования вирусом наблюдается модификация плазмодесм, которая может препятствовать распространению вирусной инфекции (Weintraub et. al., 1976); плазмолиз листовой ткани, сопровождающийся разрывом плазмодесм и отслоением плазмолеммы от клеточной стенки, приводит к подавлению распространения вирусной инфекции (Farkas, 1976).
Межклеточный транспорт - это активный процесс, который нуждается в специфическом взаимоотношении между плазмодесмами и вирус -кодируемыми транспортными белками (ТБ). В настоящее время единственным вирусом, у которого убедительно показано существование гена для ТБ является - ВТМ. Впервые предположение о том, что ген ЗОК-белка ВТМ - ген ТБ, высказано еще в 1979 году И.Г. Атабековым с соавт., хотя доказательства участия ЗОК-белка в межклеточном транспорте были получены значительно позже (Дорохов, 1994).
Существует два различных механизма действия ТБ ВТМ:
а) подавление и модификация защитных реакций при воздействии на
ядерный геном растения-хозяина;
б) модификация плазмодесм, делающая их открытыми для транспорта
вирусного генетического материала.
Исследования кинетики синтеза ЗОК-белка в инфицированных ВТМ протопластах и интактных листьях, показали, что ЗОК-белок и его субгеномная РНК синтезируется только на ранней стадии инфекции, причем синтез ЗОК-белка происходит до появления значительного числа вирионов. ЗОК-белок обладает способностью специфически связываться с однонитевыми молекулами РНК и ДНК, причем за это свойство ответственны аминокислоты 65-86, которые составляют домен связывания с однонитевыми РНК (Дорохов, 1994). ЗОК-белок ингибитор трансляции вирусных РНК и интегральный белок эндоплазматического ретикулума и клеточной стенки (плазмодесмы). Кроме того, ЗОК-белок не содержит свободной сигнальной последовательности, обеспечивающий транспорт в клеточную стенку и, по-видимому, для
выполнения своих функций ТБ взаимодействует с клеточным белком (рецептором) (Micheli, 2001; Дорохов, 2002).
Исследования последних лет показали, что таким рецептором для ТБ ВТМ может служить ключевой фермент клеточной стенки пектинметилэстераза (ГТМЕ). Было предположено, что функцию носителя ТБ в клеточную стенку выполняет одна из изоформ ПМЕ - проПМЕ, а непосредственно функцию рецептора выполняет зрелая ПМЕ, локализованная в клеточной стенке (Дорохов и др. неопубл. данные 2002). Молекулярный механизм действия ГТМЕ - ТБ ВТМ до конца не выяснен. Предполагают, что взаимосвязь ПМЕ с 30К-белком изменяет ионный баланс клеточной стенки и как следствие проницаемость плазмодесм (Micheli, 2001).
В настоящее время появилось много работ, в которых идентифицированы новые ТБ, синтезированные в растительной клетке под контролем того или иного вируса. Так, например, вирус погремковости табака (ВПТ) кодирует в своем геноме 29К-белок, по морфологии, структуре генома и стратегии трансляции схожий с ТБ ВТМ. Это и еще ряд косвенных доказательств позволили предположить, что ВТМ и ВПТ имеют общий молекулярный механизм выражения транспортной функции (Ziegler-Graff et.al., 1991).
Каулимовирусы кодируют продукт гена 1, присутствие которого значительно вокруг модифицированных плазмодесм. Стратфорд и Кови в экспериментах по картированию генетических локусов, установили, что локус, ответственный за скорость системного распространения вирусов находится в пределах гена 1 (Stratford, Covey, 1989).
Мутации и делеции комовирусов в кодирующих областях как 58К/48К белков, так и капсидных белков предотвращают системную инфекцию в растениях и необходимы для межклеточного транспорта. 58К/48К-белок располагается в тубулярных структурах, проникающих в плазмодесмы. Более того, эти белки обнаружены на концах тубулярных структур (Van Leht et.al., 1990).
Потивирусы - наибольшая по составу группа фитовирусов. Вирионом является однонитевая молекула РНК, около 10 kb длиной (Revers и др., 1999). Определена полная нуклеотидная последовательность РНК нескольких потивирусов. Только 28К-белок вируса крапчатости жилок табака (ВКЖТ) обладает слабой гомологией с ТБ ВТМ и предполагаемым ТБ (29К) ВПТ (Domier et.al., 1986).
Имеется множество транспортных групп, для которых существование гена транспортного белка предполагается. С другой стороны, для некоторых групп вирусов существование генов транспортного белка не показано. Возможно, среди них есть вирусы, у которых ген транспортного белка отсутствует.
2.5.2 Системное инфицирование при вирусном поражении
Показано, что транспорт вирусной инфекции на большие расстояния осуществляется по флоэме. Впервые возможность быстрого перемещения ВТМ продемонстрировал Самуэль на томатах. Он показал, что вирус сначала перемещается по направлению к корням, а затем к молодым листьям. Листья среднего и более старшего возраста инфицировались позднее (Мэтьюз Р., 1973)
Системное распространение вирусов в растении требует выражения не только вирусного генома, но и генома хозяина. Это предполагает, что взаимодействие вирусного транспортного белка и клеточных факторов определяет, произойдет ли межклеточный транспорт инфекции или он будет блокирован. Соответственно, результатом этого взаимодействия является системная инфекция, наблюдаемая у чувствительных растений, или инфекция, ограничивающаяся первично - инфицированными клетками, как это наблюдается у некоторых устойчивых растений (Дорохов, 1994).
Принято, что в качестве транспортных форм вирусной инфекции могут выступать как зрелые вирионы, так и свободные вирусные РНК (De Zoeten, 1981). Однако, получены факты, что зрелые вирионы не являются, по крайней мере, облигатной транспортной формой.
1) Транспортная инфекция — это ранняя функция и осуществляется не
после, а до образования зрелых вирионов.
Присутствие вирионов в первично — инфицированных клетках не может обеспечить транспорт инфекции в соседние, здоровые клетки. Этот вывод следует из результатов опытов с ВТМ мутантом по функции транспорта.
Свидетельство против зрелых вирионов как облигатной формы распространения вирусной инфекции получено в исследованиях некоторых вирусов дефектных по белку оболочки. Стало очевидным, что белок оболочки не обязателен для транспорта инфекции из клетки в клетку, но существен при транспорте на большие расстояния.
Транспортной роли зрелых вирионов противоречат результаты, полученные Доусоном с соавт. ( Dawson et.al., 1975) при дифференциальной температурной обработке (ДТО) инфицированных растений. В ходе ДТО нижние листья механически инокулированного ВТМ выдержали при температуре, оптимальной для репродукции вируса, в то время, как верхние листья помещали в холодную камеру, которая блокирует репликацию вируса. В таких условиях потенциально инфицированный материал (транспортная форма вируса) проникает в верхние неинфицированные листья и накапливается там. Однако, инфекционным началом не является зрелый вирион (Dawson, et.al., 1975). Установлено, что клетки растений, инфицированных ВТМ, мутантным по белку оболочки, содержат новый тип РНП частиц. Эти частицы содержат геномные и субгеномные РНК ВТМ, а также ВТМ специфические и клеточные белки. Эти структуры получили название вирусоспецифических информосомо - подобных рибонуклеопротеидов (вРНП). ВРНП содержат несколько белков и основной среди них - белок оболочки, который защищает РНК в составе вРНП от действия нуклеаз (Dorokhov et.al., 1983).
ВРНП синтезируются в нижних листьях, поступают в стебель и транспортируются в верхние листья, т.е. вРНП играет роль потенциального инфекционного материала при системном распространении вирусной инфекции.
3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Объекты исследования
В качестве растительного материала использовали растения кукурузы обыкновенной (Zea mays L), семейство злаковые - (Gramineae).
Кукуруза - однодомное растение с раздельнополыми соцветиями, прямым стеблем высотой от 50-80 см до 5-6 м, который иногда кустится. Корневая система мочковатая, проникает на глубину 100-150 см. На нижних надземных узлах стебля образуются толстые и прочные опорные корни, которые предохраняют растение от полегания и при окучивании влажной почвой снабжают его водой и питательными веществами. Листья кукурузы очередные, широколинейные, волнистые, сверху опушены; число их от 8 до 42. Мужское соцветие (на верхушке стебля) - метёлка; женское (в пазухах листьев) -сложный колос, обычно называется початком (длина его от 4 до 50 см, диаметр 2-10 см, масса от 30 до 500 г). На растении развивается и достигает полной спелости 1-2, редко 3 початка. Плод - зерновка, сжатой округлой или почковидной формы светло-желтого или красного цвета.
Кукуруза - типичный представитель большой экологической группы растений с особым «кооперативным» фотосинтезом. В листьях С-4 растений всегда имеются две специализированные ассимиляционные ткани - мезофилл и паренхимные обкладки густо расположенные вокруг сосудистых пучков, кооперативно осуществляющие фиксацию и восстановление углекислоты. Хлоропласты обкладки кукурузы и некоторых других видов растений ламмелярные. Однако на ранних этапах онтогенеза они не отличаются от мезофильных и содержат граны, которые редуцируются при дальнейшем развитии. Способность кукурузы создавать большую массу органического вещества в условиях ограниченной влажности обеспечивается высокой интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью транспирации (Карпилов, Малышев, 1970; Hatch, Slack, 1970).
PC? С СИ ИСКА'.і
госудлготг:»:>:нак
БИБЛИОТЕКА
Кукуруза - одна из важнейших продовольственных и кормивых культур.
Благодаря экологической пластичности этот вид возделывается в различных климатических областях земного шара. Основные посевы её сосредоточены в США, Бразилии, Мексике и тд. В СНГ кукурузу возделывают на Украине, в Молдавии, на Северном Кавказе, в Поволжье, Сибири, Центральночернозёмных областях, на Урале, Дальнем Востоке, а также в Закавказье, Средней Азии, Казахстане, Белоруссии и Прибалтике.
В эксперименте использовали три контрастных по устойчивости к MDMV генотипа кукурузы: Ра405 (устойчивый), Oh28 (восприимчивый), Wsml (толерантный).
Инбредная линия Ра405 обладает наиболее обширной и длительной устойчивостью к вирусам семейства Potyviridae, включая Maize dwarf mosaic virus (MDMV), Sugarcane mosaic virus (SCMV, его так же знают, как MDMV-B) и Wheat streak mosaic virus (WSMV) (Louie и др. 1991, McMullen и Louie 1991). Несколько лет назад, в Ра405, был выделен и идентифицирован единственный доминантный ген устойчивости к MDMV Mdml, локализованный на коротком плече 6 хромосомы (6S), вблизи области ядрышкового организатора (прил.1, McMullen и Louie 1989, Simcox et.al. 1995). Позднее в эту линию были внесены три доминантных гена устойчивости к WSMV- Wsml,Wsm2 и Wsm3 (McMullen et.al. 1994). Местоположение Wsml совмещено с Mdml, локализация Wsm2 в центральной области 3 хромосомы (3S), и положение WsmS на длинном плече 10 хромосомы (10L). Ранее (Melchinger et.al. 1998, Xu et.al. 1999) были определены ещё два доминантных гена устойчивости к SCMV - Scml и Scm2. Положение Scml на 6S хромосоме, совпадает с положением Mdml и Wsml, а положение Scml на 3S с Wsm2. Подобная локализация Mdml, Wsml и Scml указывает, что гены могут быть аллельные или что имеется три близко связанных локуса (Simcox и др. 1995).
Инбредная линия Oh28 не содержит ни одного гена устойчивости и восприимчива ко всем основным группам вирусов, инфицирующим кукурузу.
Изогенная линия Wsml была получена в результате шести обратных скрещиваний (backcross) Oh28 с гибридом Fl (Oh28 х Ра405). Wsml несет ген устойчивости к WSMV Wsml из области 6S хромосомы генотипа Ра405. Линия Wsml была отобрана при помощи RFLP маркеров, через 5-6 генераций и обладает высокой устойчивостью к данным вирусам (McMullen et.al. 1994).
В данной работе использовали растения кукурузы, семена которых любезно предоставлены Margaret G. Redinbaugh.
В качестве инфекционного материала использовали вирус мозаичной карликовости кукурузы обычный штамм A (MDMV-A). MDMV относится к самому большому и разрушительному семейству вирусов Potyviridae ( Revers et.al., 1999).
MDMV - вирус с филаментной структурой, размером 750 х 13 нм, содержащий однонитевую молекулу РНК длиной 10 000 нуклеотидов. На N -конце РНК располагается ковалентно связанный с геномом белок Vpg, а на С -конце - поли (А) - тракт (Hari, 1981) (рис. 1).
Рта іуРд-Ргоі
Рис.1 Геномная организация MDMV, SCMV, WSMV
Геномная РНК кодирует полипротеиновый предшественник, который процессируется с образованием 9 функциональных белков. Определена полная генетическая карта и локализация белков. Их перечень по направлению от N к С - концу следующий: a) N- терминальная протеаза (PI), ответственная за протеолитическое расщепление между собой и НС-Pro, стимулируя репликацию генома ; б) компонент - помощник (НС-Pro) играет центральную роль в развитии вирусной инфекции, участвует в передаче вируса тлями, включается в амплификацию генома (Kasschau et.al., 1997), а также обеспечивает вирусный транспорт по растению. Кроме того, НС-Pro подавляет посттрансляционный сайлесинг, защитную реакцию растений на внедрение
вирусов (Marathe et.al., 2000; Anandalakshimi et.al., 1998); в) белок цилиндрического включения (СІ), кодирует РНК-хеликазу, играет роль в репликации и межклеточном транспорте; г) два ядерных белка включения, белок -протеаза (Nla) и РНК-репликаза (Nib); д) белок капсида (СР), помимо структурной функции, он играет роль в передаче и передвижении вируса по растению (Klein et.al., 1994; Cronin et.al., 1995).
Рисунок 2. Симптомы заражения вирусом MDMV растений кукурузы.
MDMV наиболее распространен в южных широтах с теплым и влажным климатом. Злаковые культуры являются основными растениями, на которых паразитирует вирус. Характерные симптомы заражения MDMV проявляются через 5 дней после инфицирования в виде светло - и темно зеленой мозаики, либо пятен в основании молодых листьев, которые вскоре распространяются вдоль всего листа. Высота растений обычно уменьшается на 10-15% за счет сокращения междоузлий (Рис. 2). Все штаммы MDMV передаются как минимум 23 видами тлей (Клоке, Raymond, et.al., 1974).
3.2. Эксперименты с использованием спектрального
света
Зерна кукурузы Oh28, Ра405 и Wsml, после предварительной обработки раствором КМп04, были инокулированы вирусом MDMV методом VPI (см. ниже). Семена были высажены в почвенную культуру, содержащую состав земля: торф: песок в соотношении 1:2:1, соответственно. Параллельно в отдельные емкости были высажены здоровые семена кукурузы при тех же условиях.
С первого дня онтогенеза инфицированные (опытные) и здоровые (контрольные) проростки кукурузы были разбиты на равные группы и помещены в различные блоки фитотрона под длительное освещение белым, синим и красным светом (рис 4).
Растения выращивали в течение 14 дней при температуре воздуха 25 С, влажности 70% с фотопериодом 16 часов. Источником освещения являлись люминесцентные лампы: белые ЛБ-40 / 400-700 нм /; синие FHILIPS TL-D 36 W/18 /400-500 нм /, с макс. 420-440 нм; красные FHILIPS TL-D 36 W/15 I 600-700 /, с макс. 640-660 нм. Характеристики ламп даны на рис. 3.
Белый Синий Красный
Рисунок 3. Спектры пропускания белых, синих и красных люминесцентных ламп (Юшин, 2003).
'J
Интенсивность освещения под белым светом составляла 38 Вт/м~.
Свет был выравнен по числу падающих квантов и составлял 30 ммоль см"2 с'1 синего и красного света.
Фотопериод 16 ч.
Белый
Синий
Красный
/1\ /1\ /1\
Oh28 Ра405 Wsml Oh28 Ра405 Wsml Oh28 Ра405 Wsml
АААААА AAA
кок ококококок ококо
Рис. 4. Схема эксперимента ( К- контроль; О - опыт )
В ходе эксперимента определяли количество эндогенных фитогормонов (иммуноферментный анализ): индолилуксусной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК), гиббереллинов (ГКі+3» ГК4+7, ГК9), зеатина (3), рибозида зеатина (ЗР), изопентениладенина (ИЛА).
Определяли активность эндогенных цитокининов по методу изменения содержания бетацианина в семядолях ширицы (биотест).
Количество и активность гормонов, а также уровень пигментов определяли в третьем закончившем рост листе кукурузы.
Накопление белка оболочки MDMV регистрировали с помощью ELISA и Western-blot методов на 13-е сутки патогенеза.
В ходе эксперимента измерялись морфометрические показатели (высота растений, длина междоузлий, площадь листа) и пигментный фонд растений.
3.3. VPI - метод искусственного заражения растений
Рисунок 5. VPI - метод искусственного заражения растений
Впервые метод VPI был разработан и введен в практику R.Louie в 1995 году. Метод используется для механической передачи всех известных растительных вирусов устойчивым генотипам. Эта технология позволяет доставить вирус непосредственно в меристематическую ткань зародыша семени. Вирусный элюат вводится внутрь зародышевой ткани, с помощью тонких металлических насадок, прикрепленных к вибрирующему электрическому прибору. Используя данный прибор производиться три прокола в проводящую систему зародыша, доставляя вирус в клетки ( Рис.5).
Эффективность заражения зависит от того, насколько точно вирусный элюат будет доставлен в компетентные для репликации клетки. Симптомы мозаики в устойчивых генотипах проявляются только на первых пяти листьях, которые уменьшаются с увеличением номера листа и абсолютно исчезают на вновь отрастающих листьях (Louie et. al., 2000).
Семена кукурузы предварительно перед VPI инокуляцией обрабатывали в растворе KMnC>4 , а затем выдерживали в воде 2 часа при 30С или 4 часа при 23С. Набухшие семена раскладывали на плотный слой фильтровальной бумаги и продольно наносили на одну сторону эмбриона по 3-5 мкл. вирусного элюата. Далее под углом 45 производили три последовательных прокола в вершину, середину и основание зерна электрическим прибором в область проводящей системы зародыша, стараясь не повредить его. После инокуляции семена помещали в термостат на 48 часов, при 30С, после чего высаживали в почву.
Приготовление вирусного элюата. Буфер для растирания 0,01М рН 7,0 :
Na2HP04 NaH2P04 1 г свежих листьев с наиболее яркими симптомами заражения растирали в 4 мл буфера для растирания (1:4) и переносили в пробирку. Элюат центрифугировали при 8 000 об мин / 10 мин. Инфекционная способность элюата сохраняется в течение 4 ч. при температуре 23С и 8 часов при -2С.
3.4.0пределение фотосинтетических пигментов
Определение содержания пигментов на единицу сухой массы проводили спектрофотометрическим методом (Шлык А.А. 1971). Навеску свежих листьев (100 мг ) растирали в ступке в 2-3 мл 100% ацетона. Полученный гомогенат количественно переносили из ступки в центрифужную пробирку и центрифугировали при скорости 8000 оборотов/мин в течение 5 мин. Супернатант доводили ацетоном до определенного объема V (5 мл). Полученный экстракт исследовали на спектрофотометре СФД-2 в 1 см кювете. Измерялась оптическая плотность Е экстракта при следующих длинах волн : 450,0 нм (фиолетовый светофильтр) — опеделение суммы каротиноидов. 644,0 нм (красный светофильтр) - определение хлорофилла Ь. 662,0 нм (красный светофильтр) - определение хлорофилла а. 720,0 нм (красный светофильтр) - определение мутности экстракта.
Из значений экстинций при этих длинах волн вычисляли концентрацию С пигментов по формулам Хольма (для 100% ацетона): [ СЫ а ] = (9,784 х Е662.0,99 х Еш) х V/A; [ Chi b ] = (21,426 х Еб44- 4,65 х Е662 ) х V/A ;
[ S Саг ] = (4,695 х Е44о,5- 0,286 х ( 5,134 х Е662+ 20,436 х Еш )) х V/A ; где : Е = Е пигмента - Е720
С = концентрации пигмента в пробе, мкг/мл,
V = конечный объем экстракта, мл,
А = навеска растительного материала, г.
В таблицах указана ошибка средней арифметической 3-кратной биологической повторности. Различия между вариантами оценивали на уровне 0,95 по критерию Стьюдента.
Статистическую обработку проводили в программе «Statitica for Word 5.0»
3.5.0пределение уровня эндогенных фитогормонов 3.5.1. Выделение и идентификация
Свежий материал (1,5 г сырого веса) гомогенизировали и фиксировали кипящим 96% этанолом в количестве 9 мл на пробу. Этот этап необходим для прекращения деятельности ферментов, разрушающих фитогормоны. Экстракцию фитогормонов осуществляли в течение 20 часов 70% раствором этанола в темноте при температуре - 3-5С, для более полного извлечения активных веществ
Затем в течение 1 мин экстракт перемешивали, а осадок отделяли центрифугированием (10 тыс. об / мин., 10 мин.). Осадок трижды промывали 70% этанолом и повторяли центрифугирование. Объединенный спиртовый экстракт упаривали до водного остатка, до исчезновения запаха спирта. Водный остаток центрифугировали (10 тыс.об./ мин, 15 мин.) для осаждения пигментов и других водонерастворимых веществ. Полученный супернатант доводили дистиллированной водой до 12 мл и разделяли на три части, из которых затем выделяли гиббереллины (3 мл.), цитокинины (3 мл), ИУК-АБК (6 мл.).
Для выделения гиббереллинов водную фазу, полученную после упаривания спирта подкисляли 10% раствором серной кислоты до рН = 2,5-3 ( Ложникова и др., 1973). Затем к водной фазе приливали равный объем этилацетата и перемешивали покачиванием 10-15 раз, после чего отбирали эфирную фракцию, где содержатлись кислые ГК. Операцию повторяли 3 раза. Объединенный этилацетатный экстракт упаривали досуха и хранили на холоду до хроматографирования.
Для получения связанных форм ГК оставшуюся после эфирной экстракции водную фракцию подвергали щелочному гидролизу. К водной фазе добавляли 10% раствор NaOH до рН = 10 и нагревали на водяной бане до 90-100 С в течение 1 часа. Охлажденный гидролизат подкисляли 10% раствором H2SO4 до рН = 2,0-3,0 и освобожденные в результате гидролиза гормоны вновь
экстрагировали этилацетатом. Эфирные экстракты объединяли и упаривали досуха.
Для разделения гормонов использовали восходящую тонкослойную хроматографию (ТСХ). Сухие экстракты гормонов растворяли в 60 мкл. 96 % этилового спирта и наносили на уровне старта хроматограммы одновременно со стандартными метчиками гормонов ГК|+з и ГА4+7 на пластинки «Silufol-UV-254» Чехия. Хроматографическое разделение проводили в системе растворителей хлороформ: этиловый эфир уксусной кислоты: уксусная кислота (70:30:5). Затем пластинки просматривали в УФ-лучах для идентификации зон ГК по положению метчиков и их флуоресценции. Следует отметить, что ГК), ГКз и изо-ГКз, а также ГК4, ГК7 и изо-ГК7 не разделяются и элюируются в виде общих зон (Обут и др., 1983). Поэтому мы анализировали активность их смесей, которые соответственно обозначали как ГА|+з и ГА4+7.
Для выделения цитокининов супернатант доводили до рН = 8,0 раствором NaOH и трижды экстрагировали н-бутанолом в соотношении 1:1, после чего объединенный бутанольный экстракт упаривали досуха.
Современные представления о фоторецепции зеленых растений
Фитохромы - фоторецепторы, воспринимающий красный (К) и дальний красный спектр излучения (ДК). Установлено, что фитохромы регулирует различные физиологические процессы такие как, прорастание семян, цветение растений, направленность различных биосинтезов и многое другое.
В настоящее время идентифицировано пять монофилетических семейств фитохромов (phy А, В, С, D и Е), имеющих сходную структуру, но кодируемые разными генами. Хромофор является общим для всех фитохромов и представляет собой линейный тетрапиррол, ковалентно связанный с апопротеином (Kendrick, Kronemberg, 1994; Clack, Mathews, 1994).
Фитохром может находиться в активном и неактивном физиологическом состоянии и соответственно этому, запускать либо блокировать те или иные физиологические процессы: неактивное состояние с максимумом поглощения при длине волны X 660 нм (К), и активное - при А. 730 нм (ДК). Эти формы легко переходят друг в друга (Borthwick, 1972).
Установлено, что при облучении светом с X 660 нм образуется около 75% Ф730 и 25% Фббо. Это связанно с тем, что неактивная форма имеет более интенсивное и более селективное поглощение при X 660 нм, чем форма Ф730» поэтому выход активной формы существенно выше. При облучении светом X 730 нм образуется около 2% Ф7зо и 98% Ф6бо. Образование незначительного количества Ф730 в этом случае связано с очень низким поглощением лучей при X 730 у формы Ф660 (Borthwick, 1972; Mohr, 1972).
Другой важной особенностью фитохрома является наличие у него поглощающей способности не только в красной, но и в сине - фиолетовой области спектра, хотя эффективность поглощения синих лучей ниже, чем красных. Подобные спектральные свойства фитохрома, дают основания считать, что фитохромные эффекты фоторегуляции могут происходить при облучении растений в широком диапазоне видимого света.
Ранее была установлена связь активной формы фитохрома с мембраной цитоплазмы (плазмаллемой), а также мембранами митохондрий и этиопластов. Однако исследования последних лет позволяют усомниться относительно мембранной ассоциации фитохрома (Sineshchekov et. al., 1994). Большинство исследователей придерживаются мнения, что фитохром является растворимым белком, ограниченным в цитозоле (Quail et.al.,1995; Furuya, Schafer,1996), a недавняя работа Nagatani с соавт. продемонстрировала ядерную локализацию фитохрома В (phy В) (Sakamoto, Nagatani, 1996).
Первичный механизм действия фитохромов долго оставался спорным вопросом для исследователей. В настоящее время установлено, что, очевидно, только фитохром А может функционировать как регулируемая светом протеинкиназа (McMichael, Lagarias, 1990), а сигнал трансдукции включает G-белки, ионы Са и циклический GMP в цитоплазме (Bowler, Neuhaus et.al., 1994).
Растения имеют несколько фоторецепторов синего света и УФ-А радиации, которые регулируют различные аспекты роста и развития. Недавние исследования идентифицировали три фоторецептора: криптохром 1 (CRY1), криптохром 2 (CRY 2) и фототропин (Ahmad, Cashmore, 1993; Christie, Reymond et. al., 1998). В качестве светопоглощающих хромофоров выступают флавины, и птерины (Galland, Senger, 1991).
Криптохромы обладают фотолиазной активностью, которые регулируют рост колеоптиля и время зацветания растений. Фототропин медиирует фототропизмы в ответ на синее излучение и является протеинкиназой, которая регулирует концентрацию цитоплазматического Са2+ (Lin, 1996).
CRY 1 - фоторецептор, регулирующий ряд ответов, основным из которых является ингибирование роста гипокотиля в длину. Синий свет влияет на удлинение гипокотиля посредством двух кинетических фаз: быстрой и медленной. Быстрый ответ происходит в течение нескольких минут или даже секунд экспозиции, а для медленного необходимо не менее часа светового освещения (Briggs, Huala, 1999; Parks et. al., 1998).
Быстрому торможению роста синим светом, предшествует деполяризация плазматической мембраны в клетках гипокотиля растений. Деполяризация мембраны является следствием раскрытия ионных каналов, т.к. синий свет вызывает быструю (в течение 1 мин.) активацию их работы. Вслед за активацией ионных каналов начинается медленная фаза, завершающаяся повышением водного потенциала в клетках, что ведет к замедлению их роста (Cho, Spalding, 1996). Медленный ответ ингибирования гипокотиля не произойдет, по крайней мере, час после облучения синим светом. Показано, что именно этого времени достаточно для изменения экспрессии гена (Briggs, Huala, 1999; Parks et. al., 1998).
Показано, что криптохромы функционируют не только в синей области спектра, но также чувствительны к UV-A радиации (320-390 нм). Эксперименты по облучению UV-A радиацией мутанта Arabidopsis thaliana cryl показали, что CRY 1 участвует в регуляции экспрессии генов, кодирующих фермент хальконсинтазу (CHS), ключевого фермента в биосинтезе флавоноидов.(Іепкіп5, Christie et.al., 1995). Кроме того, предварительная обработка красным светом усиливает последующую медиацию CRY1 и индукцию CHS. Фототропин - флавопротеин, который регулирует фототропические изменения в ответ на излучение синем светом и УФ-А радиацией. Фототропин — является белком с серии - треонин киназной активностью, способной фосфорилировать остатки серина и треонина. Фототропин связан с плазматической мембраной растений, но природа этих связей до конца не выяснена (Christie, Reymond et. al., 1998).
На мутантах Arabidopsis thaliana (L.) идентифицировали два рецептора NPH1 и NPH3, ответственные за фототропические реакции (Huala et.al.,1997; Motchoulski, Liscum, 1999). Ген NPH1 кодирует 120 kDa белок, связанный с цитоплазматической мембраной. Бриггс с сотрудниками выявили быстрый эффект (меньше чем 1 сек освещения) синего света на фосфорилирование этого белка. Максимальное фосфорилирование наблюдалось в растущей области стебля и физиологические ответы растений были сходны с фототропизмом (Briggs, Huala, 1999).
Процессы трансдукции сигнала, которые соединяют фоторецепцию с ответом, являются ключевым моментом в понимании действия света на рост и развитие растений.
Цепь компонентов на пути трансдукции состоит из большого числа сигнальных молекул, которые не только преобразовывают световой сигнал, но и усиливают , и в некоторых случаях накапливают его.
Два основных подхода используется в изучении трансдукции световых сигналов: генетический и биохимический (Schafer et. al., 1997).
Генетический подход основан на идентификации генов, включающихся в ответ на световое излучение.
Механизмы растительного иммунного ответа
За последние годы достигнут определенный прогресс в изучении биохимических молекулярных механизмов устойчивости растений к инфекционным заболевания, в том числе и к вирусным (Бернет, 1971).
Хотя вирусы отличаются относительно слабой специфичностью и отдельные их виды могут поражать довольно широкий круг хозяев, все же в пределах наиболее поражаемых семейств, всегда можно обнаружить виды, иммунные к тому или иному вирусному заболеванию.
Исследования последних лет позволили установить, что специфичность фитоиммунитета определяется на начальных этапах взаимодействия генов паразита и растения - хозяина. К настоящему времени относительно хорошо изучены продукты генов авирулентности патогенов (элиситоры) и совсем мало исследованы продукты генов устойчивости растений — рецепторы элиситоров (R-гены). Изучение взаимоотношений растений с патогенами привело американского фитопатолога Флора к созданию теории «ген на ген». Согласно этой теории, несовместимость паразита и хозяина возможна только при наличии у партнеров двух взаимодействующих доминантных генов, при любых других сочетаниях реакция растения с патогеном окажется совместимой. В случае несовместимости взаимодействуют продукты генов устойчивости растения (R-гены) с продуктами генов авирулентности патогена (avr-гены). Потеря или изменение одним из партнеров гена устойчивости или авирулентности сделает их реакцию совместимой (Flor, 1971).
Предполагается, что некие метаболиты растений (рецепторы), синтезируемые под контролем генов устойчивости, узнают чужеродные метаболиты патогенов, контролируемые комплиментарными генами авирулентности, в результате чего индуцируются защитные ответы. Отсутствие у хозяина рецептора вследствие изменения (потери гена) устойчивости, или отсутствие у вируса метаболита, связываемого рецептором, вследствие изменения (потери) гена авирулентности, приводят к тому, что паразит перестаёт узнаваться растением, и иммунные реакции либо не включаются, либо включаются слишком слабо и поздно (Озерецковская, 2002).
Таким образом, в концепции Флор должны функционировать, по крайней мере, четыре типа факторов: 1) гены авирулентности и кодируемые ими соединения, получившие название элиситоров; 2) гены устойчивости и их продукты — рецепторы; 3) трансдукторы сигналов, передающие информацию на геном; 4) гены иммунного ответа. Два первых фактора специфичны, тогда как два последних - неспецифичны (Дьяков, 1996).
Вышесказанное соответствует представлению о двух фазах индукции устойчивости у растений. Во время первой специфической фазы, называемой детерминантнои, происходит взаимное распознавание партнеров, в результате чего определяется, будет ли растение здоровым или заболеет. За специфической детерминантнои фазой следует неспецифическая экспрессивная, на протяжении которого включаются или не включаются защитные механизмы растений.
К настоящему времени относительно хорошо известны лишь конечные результаты экспрессивной фазы взаимодействия паразита и растения. В значительно меньшей мере исследованы начальные факторы детерминантной фазы - продукты генов авирулентности - элиситоры и совсем мало известны кодируемые генами устойчивости рецепторы (Озерецковская, 2002).
Что касается процессов передачи защитных сигналов, то в настоящее время постепенно высвечиваются события, происходящие между детерминантной и экспрессивной фазами (Тарчевский, 2000; Гречкин, Тарчевский, 1999). Они включают систему внутриклеточных мессенджеров, которые инициируются в результате взаимодействия элиситоров и рецепторов. Конечным этапом мультикомпонентного иммунного ответа растительной ткани является образование неспецифических элиситоров, которые индуцируют иммунные ответы у любого сорта растения, независимо от присутствующих в нем генов устойчивости. Такими элиситорами являются фитоалексины, PR-белки, жасмонаты и салицилаты, ингибиторы протеиназ, активные формы кислорода и азота, и другие вещества ( Гречкин, Тарчевский, 1999; Bol, Linthorst, 1990).
В настоящее время известно, что устойчивость растений к различным патогенам, в том числе и вирусам, четко коррелирует со способностью растений продуцировать фитоалексины (ФА).
Все обнаруженные ФА — вещества вторичного происхождения, продукты специализированного обмена. Для их биосинтеза используются или активируются уже имеющиеся в растительных клетках биосинтетические пути, последние этапы которых связаны с образованием соответствующих ферментов de novo (Метлицкий, 1987).
ФА обладают широким спектром антибиотического действия: они подавляют рост различных микроорганизмов и нематод, а так же оказывают токсическое действие на организм млекопитающих. ФА в силу широкого антибиотического спектра действия оказывают токсическое воздействие на растительные клетки, в которых образуются. Для сохранения собственной целостности растения обладают различными механизмами, один из которых — реакция сверхчувствительности. Она заключается в том, что клетки устойчивых сортов растений обладают столь высокой чувствительностью, что погибают (некротизируются) сразу же после проникновения в них паразита. Растение защищается ценой гибели своих же клеток, что определяет последующую гибель проникшего в них паразита. Причем причина гибели паразита оставалась неизвестной до открытия ФА. Оказалось, что именно ФА, образуясь в здоровых, прилегающих к некротизированным клеткам, мигрируют в некротизированные, где и накапливаются до токсичных для паразита концентраций. Зона некротизированных клеток вместе с локализованным в них паразитом отторгается от здоровых тканей отдельным барьером из перидермальных клеток (Метлицкий, 1987).
Определение активности цитокининов
Основой для биологических методов определения активности гормонов являются их разнообразные физиологические эффекты гормонов. Биологические методы очень чувствительны, однако недостаточно специфичны, что требует одновременного применения нескольких биотестов.
Характерное для цитокининов физиологическое действие - это стимуляция клеточного деления в тканях каллуса, образования красных пигментов — бетацианинов в проростках амаранта, задержка старения листьев и их сегментов по сохранению хлорофилла ( Кулаева, 1973; Biddington, Tomas, 1973; Дёрфлинг, 1985).
Определение цитокининовой активности природных и синтетических соединений основано на стимуляции образования бетацианинов проростками ширицы.
Семена ширицы Amarantus caudatus L. раскладывали на смоченную водой фильтровальную бумагу в чашки Петри и проращивали в течение 72 часов в термостате в темноте при 24С. Затем на рассеянном свету у проростков отделяли корешок и раскладывали по 10 штук в пенициллиновые флаконы на бумажный фильтр, смоченный 2 мл 1/75 М раствором фосфатного буфера (рН=6,3) , содержащего 1мг/мл тирозина (контроль), или тирозин и вещество, исследуемое на цитокининовую активность (опыт).
Чашки инкубировали в темноте при температуре 24С. После 18 часов инкубации бетацианин экстрагировали 0,1н HCL (2мл). В целях наиболее полного извлечения бетацианина семядоли ширицы, погруженные в раствор соляной кислоты, трижды замараживали и оттаивали (Biddington, Thomas, 1973)
Концентрацию бетацианина определяли на спектрофотометре по изменению оптической плотности при длине волны 540 нм. Содержание бетацианина подсчитывали, исходя из отношения экстинции опытных вариантов и экстинции контроля, которое выражается в процентах.
В настоящее время существуют различные методики определения вирусов в растениях, в настоящей работе использовались два метода: классический подход количественного определения белка оболочки вирусов ELISA-метод, и метод Western-blot гибридизации (Harlow Е., Lane D., 1988) подходящий как для качественного, так и для количественного определения титра антигенов вирусов. 3.6.1. ELISA-метод
1) В полистероловый планшет наносили по 50 мкл. FAB-units (специфических антител к различным патогенам в т.ч. MDMV), растворенных в покровном буфере 1:200 (0,025 М ЫаНСОз, рН 9,7). Антитела экспонировали 2 ч. при комнатной температуре.
2) Далее планшет трижды обильно промывали буфером TBS (0,025 М трис- НС1, 0,015 М NaCl, 0,05% Tween - 20, рН 8,0).
3) Блокировка. В планшет наносили по 150 мкл покровного буфера, содержащего 1 % БСА и экспонировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Блокировка необходима для снижения уровня неспецифических реакций возникающих из-за неспецифических взаимодействий компонентов сока с поверхностью лунки планшета.
Гормональный баланс здоровых и инфицированных растений кукурузы, выращенных в условиях белого освещения
Фитогормоны - природные соединения, принимающие участие в регуляции процессов роста и органогенеза. В настоящее время известны четыре группы эндогенных регуляторов роста: ауксины, гиббереллины, цитокинины и ингибиторы роста. Взаимодействие всех эндогенных регуляторов роста в растении имеет сложный характер и определяет нормальный ход роста и развития растений.
Учитывая роль фитогормонов в регуляции процессов роста и развития растений, можно предположить, что наблюдаемые при вирусном поражении различные нарушения обусловлены воздействием вирусной инфекции на гормональную систему растений.
Вирусная инфекция самым различным способом может влиять на морфогенез, стимулируя или подавляя синтез, распад, перемещение или эффективность действия ростовых веществ в различных органах и на разных стадиях. Торможение роста больных растений обусловлено инактивацией свободных форм ауксинов. Данные, полученные в опытах с различными линиями кукурузы, инфицированными MDMV, свидетельствуют о снижении концентрации свободной 3-индолилуксусной кислоты (ИУК) - главного представителя ауксинов в листьях восприимчивого и толерантного генотипах (рис. 3). Снижение количества ИУК могло быть вызвано в результате окисления или угнетения их синтеза (с увеличением содержания ингибиторов роста, маскирующих действие ауксинов) или обоих механизмов.
По литературным данным известно, что ауксины в больных листья разрушаются ауксиноксидазой, участвующей в окислении ИУК. Сейчас накоплено большое количество данных, свидетельствующих о роли разрушающих ИУК ферментных систем в регуляции ее содержания в тканях. Возможно, что ауксиноксидаза, влияя на уровень ИУК, в значительной мере контролирует интенсивность роста, дифференциацию тканей и другие процессы (Родионова, 1975). Кроме того, в отличие от контрольных растений, где количество свободной ИУК было выше чем связанной, в инфицированных листьях наблюдалась обратная тенденция: концентрация связанных форм в листьях восприимчивого Oh28 и толерантного Wsml генотипов была повышена на 35 и 14% соответственно. Подобные изменения содержания ИУК сопровождались уменьшением роста восприимчивых генотипов. В листьях устойчивого генотипа Ра405 уровень эндогенной ИУК в инфицированных проростках достоверно не отличался от контрольных, что возможно, стало следствием каких либо защитных клеточных реакций, препятствующих торможению роста растений (рис.3).
Снижение активности стимуляторов роста при вирусном заболевании может быть обусловлено накоплением в больных растениях ингибиторов. Взаимодействие стимуляторов и ингибиторов роста в растении имеет сложный характер и, по мнению В.И.Кефели, может осуществляться на этапах синтеза, функционирования и разрушения этих соединений. На первом этапе это взаимодействие проявляется в конкуренции за общие предшественники, так как ауксины и многие фенольные ингибиторы образуются из шикимовой , кислоты, а гиббереллины и абсцизовая кислота - из мевалоновой. Далее
ингибиторы выступают как антагонисты стимуляторов роста и тормозят проявление их ростовой активности. На следующем этапе взаимодействие проявляется в участии некоторых фенолов в окислении ауксинов. Кроме того, этилен, абсцизовая кислота и другие ингибиторы роста способны активировать окисление ауксинов ( Hare, 1975).
В настоящее время из-за недостатка данных нельзя сделать определенный вывод о влиянии вирусной инфекции на содержание АБК. По данным нашего эксперимента характерной особенностью гормонального, баланса инфицированных растений кукурузы явился высокий уровень свободной АБК. Так, например, в инфицированных листьях Wsml свободная форма АБК на 40% превышала уровень этого гормона в листьях контрольных растений (рис 4). Увеличение показателей свободной АБК сопряжено с падением ростовой активности, причем у больных растений восприимчивого и толерантного генотипов эта зависимость выражена сильнее (рис 4, табл.1) ЕЗ Свободная Связаннаяо Oh28 Oh28 Wsml Wsml Pa405 Pa405 Рисунок 4. Влияние заражения MDMV на уровень АБК в 13-дневных проростках кукурузы, выращенных в условиях белого освещения ( - инфицированные).
Кроме того, MDMV вызывает в листьях Oh28 и Wsml изменение соотношений стимуляторов и ингибиторов роста: содержание ауксинов снижается, а ингибиторов - увеличивается.
Действие вирусной инфекции на другие эндогенные регуляторы роста растений изучено еще недостаточно. Гиббереллины регулируют почти все стадии жизненного цикла растений, включая прорастание семян, развитие листа, а также отвечают за рост и растяжение междоузлий в длину (Дерфлинг,1985).
При выращивании кукурузы на белом свету баланс различных групп гиббереллинов в контрастных генотипах отличался изначально. Так, в здоровых и инфицированных листьях различных генотипов всегда присутствовали ГКі+з и ГК4+7- Основая масса ГК9 находилась в связанной форме, в свободном состоянии ГК9 обнаруживалась в следовых количествах (рис.5).
