Кариосистематическое изучение представителей семейства Trilliaceae Cheval Мякошина Юлия Анатольевна

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы с. 9

2.1. Систематика сем. Trilliaceae Cheval с. 9

2.2. Семейство Trilliaceae на территории России с. 11

2.3. Морфологические характеристики представителей сем. Trilliaceae с. 13

2.3.1. Морфологические характеристики Trillium camschatcense Ker.-Gawl с. 14

2.3.2. Морфологические характеристики Trillium tschonoskii Maxim с. 15

2.3.3. Морфологические характеристики природного гибрида Trillium х hagae Miyabe et Tatewaki с. 16

2.3.4. Морфологические характеристики Trillium rhombifolium Кот с. 17

2.3.5. Морфологические характеристики Trillium erectum L с. 17

2.3.6. Морфологические характеристики Trillium recurvatum Beck с. 18

2.3.7. Морфологические характеристики Trillium grandiflorum Michaux с. 19

2.3.8. Морфологические характеристики Paris quadrifolia L с. 19

2.3.9. Морфологические характеристики Paris incompleta Bieb с. 20

2.3.10. Морфологические характеристики Daiswa hainanensis (Merrill) Takht с. 20

2.4. Начальные этапы кариосистематического и цитогенетического изучения семейства Trilliaceae. Cheval с. 20

2.5. Методы дифференциального окрашивания хромосом растений с. 24

2.5.1. Метод холодового окрашивания хромосом - CSR-метод с. 24

2.5.2. Дифференциальное окрашивание хромосом с помощью С-метода с. 27

2.5.3. Дифференциальное окрашивание хромосом с помощью

флуоресцентных нуклеотидспецифичных красителей (Q-окрашивание) с. 28

2.5.4. Выявление ядрышковых организаторов (NOR) при помощи окрашивания хромосом азотнокислым серебром с. 29

2.6. Роль CSR-метода в кариосистематике сем. Trilliaceae с. 30

2.6.1. Полиморфизм CSR-сегментов Т. camschatcense Ker.-Gawl. (KiKi) с. 31

2.6.2. Полиморфизм CSR- сегментов у Т. rhombifolium Кот с. 33

2.6.3. Полиморфизм CSR-сегментов Т. tschonoskii Maxim. (К2К2ТТ) с. 34

2.6.4. Полиморфизм CSR-сегментов Т. х hagae (Зх) Miyabe et Tatewaki (К1К2Т)

и Т. hagae (6х) Miyabe et Tatewaki (КіК^КгТТ) с. 35

2.6.5. Полиморфизм CSR-сегментов Т. apetalon Makino (SSUU), Т. smallii Maximowicz (K1K1SSUU или K2K2SSUU), T. xyezoense Tatewaki (KjSU), T. x miyabeanum Tatewaki (K2TSU) с 36

2.6.6. Полиморфизм CSR-сегментов североамериканских видов Trillium с. 37

2.7. Использование С- и Q- методов дифференциального окрашивания в кариосистематике сем. Trilliaceae с. 42

2.7.1. Полиморфизм С- и Q- сегментов у видов рода Trillium с. 42

2.7.2. Полиморфизм С-сегментов у видов рода Paris с. 44

2.7.3. Полиморфизм гетерохроматиновых сегментов, выявляемых различными методами дифференциального окрашивания, у видов Daiswa Raf. с. 46

2.8. Молекулярная систематика сем. Trilliaceae Cheval с. 47

3. Методы и материалы с. 51

3.1. Происхождение материала с. 51

3.2. Приготовление препаратов с. 51

3.3. Окрашивание препаратов с. 52

3.4. FISH-гибридизация с. 54

3.5. Построение филогенетических деревьев с. 55

4. Результаты и обсуждение с. 57

4.1. Анализ кариотипа Т. camschatcense с. 58

4.2. Анализ кариотипа Т. tschonoskii. с. 61

4.3. Анализ кариотипа природного гибрида Т. tschonoskii х camschatcense (=Т. xhagae) с. 64

4.4. Анализ кариотипа Т. rhombifolium с. 66

4.5. Анализ кариотипа Trillium erectum с. 69

4.6 Анализ кариотипа Т. grandiflorum с. 71

4.7. Анализ кариотипа Т. recurvatum с. 73

4.8. Сравнительный анализ рисунков дифференциальной исчерченности хромосом у представителей рода Trillium с. 75

4.9. Анализ кариотипа Paris quadrifolia. с. 79

4.10. Анализ кариотипа Paris incompleta с. 84

4.11. Анализ кариотипа Daiswa hainanensis с. 89

4.12. Сопоставление паттернов Q- и CSR-дифференциальной исчерченности хромосом у D. hainanensis с. 91

4.13. Результаты молекулярно-филогенетических исследований представителей сем. TriUiaceae и их сравнение с кариосистематическими данными с. 99

5. Выводы

6. Список литературы с. 112

7. Благодарности с. 129

• Систематика сем. Trilliaceae Cheval
• Морфологические характеристики Trillium rhombifolium Кот
• FISH-гибридизация
• Анализ кариотипа Т. camschatcense

Введение к работе

Актуальность темы. Исследование проблемы организации и эволюции геномов и хромосом цветковых растений в настоящее время является одним из магистральных направлений исследований в ботанике, генетике, а также новой дисциплине, сложившейся на рубеже XX-XXI веков - сравнительной геномике. Результаты подобных исследований, в частности, имеют важное значение для понимания закономерностей эволюции, решения задач систематики и филогении. Сравнительно-кариологические исследования отдельных таксонов являются лишь начальной, но абсолютно необходимой базой для решения этого круга проблем.

Сем. Trilliaceae, включающее в себя как диплоидные, так и полиплоидные виды с самыми крупными среди эукариот хромосомами, до сих пор недостаточно полно исследовано с точки зрения кариологии. Между тем, сравнительно-кариологические данные зачастую имеют большое значение для систематики и филогении растений. Изучение кариотипов включает в себя исследования числа, размеров, морфологии и центромерного индекса хромосом, а также рисунка дифференциальной исчерченности (паттерна), получаемого при помощи различных методов дифференциального окрашивания хромосом.

Данная работа посвящена кариосистематическому исследованию представителей семейства Trilliaceae (Trilliaceae Cheval.).

Триллиевые - это хорошо обособленное олиготипное семейство однодольных, систематическое положение которого до сих пор неясно. Наиболее яркой чертой всех представителей этого таксона являются рекордные не только для цветковых растений, но и для всех эукариот размеры геномов, что делает это семейство в данном смысле уникальным. Так, средняя длина хромосом Т. camschatcense в метафазе превышает 50 мкм, а содержание ДНК на гаплоидный геном - 45 пг. Расчеты показывают, что содержание ДНК на одну хромосому у этого вида составляет около 9 000 000 000 пар нуклеотидов, что в 3 раза превышает содержание ДНК всего гаплоидного генома человека (Ingle et al., 1975; Гриф и др., 1980). Организация таких мегагеномов пока неизвестна, можно предполагать, что они насыщены разнообразными повторяющимися последовательностями ДНК.

Уникальные размеры хромосом Триллиевых давно сделали представителей этого семейства привлекательными модельными объектами для исследования структурно-функциональной организации хромосом эукариот (Matsuura, 1934, 1937а, б, в, 1938а,б,в,

1941а, б; Darlington, La Cour,. 1938; Shaw, 1959; Dyer, 1964; Gri 2000; Пунина E.O. и др., 2001). Закономерно, что один из видов Триллиевых - Trillium erectum L. - был одним из первых объектов, на которых Т. Касперсоном был открыт феномен линейной неоднородности хромосом высших эукариот, выявляемой при окрашивании хромосом акрихин-ипритом, так называемая Q-исчерченность (Casperson et al., 1968).

Кариотипы всех Триллиевых, с одной стороны, удивительно консервативны по морфологическим параметрам хромосом (длина, центромерный индекс), а, с другой стороны, крайне разнообразны и полиморфны по рисунку распределения гетерохроматиновых сегментов, выявляемых при помощи различных методов дифференциального окрашивания хромосом.

ДНК гетерохроматина является одной из фракций ДНК генома и в самом общем случае она представляет собой многократно повторенные, генетически инертные последовательности ДНК, которые большую часть митотического цикла находятся в конденсированном состоянии (см. напр., Прокофьева-Бельговская, 1986). Одной из особенностей гетерохроматина является его способность окрашиваться на цитологических препаратах иначе, чем прилегающие участки эухроматина, т.е. дифференциально. Рисунок (паттерн) распределения получаемых при этом полос (бэндов, сегментов, блоков) очень часто хромосомо- и видоспецифичен, поэтому различные методы дифференциальной окраски хромосом уже давно являются надежным инструментом в сравнительно-кариологических исследованиях.

Одним из таких методов является окрашивание хромосом нуклеотидспецифичными флуорохромными агентами, что позволяет не только выявить гетерохроматиновый участок хромосомы, но и сделать заключение о его нуклеотидном составе.

Дополнительным признаком при сравнительном изучении кариотипов является расположение ядрышковых организаторов (NOR) на хромосомах изучаемых растений. Традиционно методом выявления транскрипционно активных в интерфазе ядрышковых организаторов является окрашивание метафазных хромосом нитратом серебра AgN03, который связывается с аргентофильными белками, расположенными преимущественно в этих районах хромосом. Выявить все ядрышковые организаторы помогает метод FISH-гибридизации хромосом с кластерами рибосомных генов (5,8S-18S-28SpPHK). Картина расположения ядрышковых организаторов может быть разная у разных видов или групп видов, поэтому этот признак заслуживает пристального внимания.

Несмотря на информативность вышеуказанных методов, кариотипы представителей Trilliaceae таким способом ранее практически не изучались.

Цель и задачи работы. Целью нашей работы было сравнительное кариологическое исследование представителей сем. Trilliaceae, установление систематических связей между ними. Для этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявление гетерохроматиновых сегментов хромосом с разным нуклеотидным составом при помощи метода дифференциального окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами. Построение цитологических карт хромосом.

2. Сравнительный анализ расположения ядрышковых организаторов, выявляемых методом окрашивания нитратом серебра и в некоторых случаях при помощи FISH-гибридизации, у разных видов.

3. Анализ геномного состава полиплоидных видов на основании цитологических карт хромосом.

4. Исследование нуклеотидного состава гетерохроматиновых районов хромосом, выявляющихся после прижизненного воздействия холодом (CSR-сегментов).

5. Анализ эволюционно. изменчивых последовательностей ITS кластеров генов рРНК у разных представителей сем Trilliaceae.

6) Совокупный анализ кариологических данных и данных молекулярной
систематики.

Научная новизна работы. При помощи метода окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами впервые изучены кариотипы и построены цитологические карты хромосом Trillium tschonoskii Maxim., межвидового гибрида Trillium х hagae Miyabe et Tatewaki {Trillium camschatcense x Trillium tschonoskii), Trillium rhombifolium Kora, Trillium erectum L, Trillium grandijlorum (Michx.) Salisb., Trillium recurvatum Beck, Paris incompleta Bieb., Paris quadrifolia L., Daiswa hainanensis (Merrill) Takht.

Впервые исследован геномный состав гексаплоидного вида Trillium rhombifolium, введена номенклатура его генома. Впервые на основании кариологического анализа показано, что гексаплоидный российский вид Trillium rhombifolium неидентичен гексаплоидному японскому виду Trillium hagae. Внесено предложение об изменении номенклатуры геномов Trillium tschonoskii и Trillium х hagae. Впервые показано, что роды Paris, Daiswa, Trillium демонстрируют различные и, предположительно, родоспецифичные типы дифференциальной исчерченности хромосом. Впервые показано, что у вида Trillium tschonoskii тип дифференциальной исчерченности хромосом наиболее приближен к типу исчерченности, характерному для рода Paris, что является дополнительным аргументом

в пользу вывода молекулярио-филогенетических исследований о межродовом гибридном происхождении этого вида.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены в виде устных и стендовых сообщений на IV Всероссийском совещании по кариологии и кариосистематике растений (С.-Петербург, 1999), VII Молодежной конференции ботаников (С.-Петербург, 2000); III Европейской цитогенетической конференции (Париж, 2001), XIV Всероссийиском симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (С.-Петербург, 2002), научной конференции БИН РАН "Молодые ученые -победители конкурса научных работ 2002 г." (17 февраля 2003 г.), XVII Ботаническом конгрессе (Вена, 2005), V международном совещании по кариологии, кариосистематике, молекулярной систематике растений (С. Петербург, 2005).

Прикладное значение. Материалы диссертации являются вкладом в изучение вопроса о строении и эволюции полиплоидных геномов цветковых растений, о локализации кластера рибосомных генов в ходе эволюции растительных видов, а также имеют значение для систематики растений.

Полученные сведения могут быть использованы при чтении курсов лекций по кариосистематике цветковых растений, цитологические карты хромосом могут быть учтены при систематических исследованиях как внутри семейства Trilliaceae, так и о местоположении этого семейства среди других семейств и таксонов. Полученные результаты также могут представлять интерес для садоводов, поскольку отдельные виды Trilliaceae являются декоративными растениями.

Объем работы. Диссертация представлена на 130 страницах, содержит 35 рисунков, 10 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав по материалам и методам исследования, полученным результатам и обсуждению, выводов. Прилагаемый список литературы включает 225 наименований, из которых 175 на иностранных языках.

2. Обзор литературы. 2.1. Систематика сем. Trilliaccae Cheval.

Семейство Trilliaceae Cheval. представляет собой реликтовое семейство однодольных растений, выделено и номенклатурно узаконено Е. Шевалье в 1827 году (Chevallier, 1827). До него систематик de Jusseau, так же как и его современники и последующие поколения систематиков располагали Триллиевые в составе семейств Liliaceae (de Jusseau, 1789; Watson, 1879; Bentham, Hooker, 1883; Engler, 1888; Torre, Harms, 1908), Paridaceae (Dumortier, 1829). Smilacaceae (Endlicher, 1836-1840), не выделяя их в отдельное семейство. Первый ученый, принявший точку зрения Шевалье, был Дж. Линдли (Lindley, 1842). Впоследствии в 1926 году Дж. Хатчинсон также рассматривал Trilliaceae, как отдельное семейство (Hutchinson, 1926). На протяжении длительных исследований местоположение Триллиевых в систематике растений менялось неоднократно. Одни систематики включали представителей Триллиевых в состав сем. Liliaceae Juss. (Комаров, 1935; Freeman, 1975; Wang, Tang, 1978; Цвелев, 1979). Другие рассматривали Trilliaceae как отдельное семейство, входящее в порядок Liliales (Hutchinson, 1973; Thorne, 1983, 1992) или Stemonales (Huber, 1969; Dahlgren, 1975) или Smilacales (Takhtajan, 1980; Тахтаджян, 1982) или Dioscoreales (Dalhgren et al.,1985; Тахтаджян, 1987). В последнее время разными систематиками на основе данных по структуре семян признается правомочность выделения сем. Trilliaceae в отдельный монотипный порядок Trilliales (впервые предложено Н. Хабером (Huber, 1969), поддержано А.Л. Тахтаджяном (Takhtajan, 1997) и Г.Г. Оганезовой (2000)).

Систематические отношения между таксонами внутри семейства также вызывали много вопросов. Изначально согласно большей части классификаций, основанных на строении цветка, семейство Trilliaceae включало в себя 2 рода: род Trillium L., имеющий трехлепестковый цветок, и род Paris L., цветки которого имеют от 4 до 11 лепестков. Род Trillium, самый большой в семействе (насчитывает приблизительно 41 вид), включает в себя 2 подрода: 1) подрод Trillium -. представлен видами с цветком на цветоножке ("pedicellate - flowered"), делится в свою очередь на 2 группы видов: виды с прямой цветоножкой ("erect") и виды с наклоненной цветоножкой ("declinate"); и 2) подрод Phyllantherum Raf., представлен сидячецветковыми видами, без цветоножки ("sessile-flowered"). Род Trillium имеет два очага распространения: Восточная Азия (от Западных Гималаев до Камчатки и Японии), где насчитывается 5 видов и предположительно 3 межвидовых гибрида из подрода Trillium - и Северная Америка, где произрастают 36 видов из обоих подродов (Freeman, 1969; Samejima, Samejima, 1987, 1991).

Род Paris sensu lato представлял собой единый большой таксон, объем которого долго не был четко определен. X. Хара (Нага, 1969) разделял род Paris sensu lato на 3 секции: Paris, Kinugasa, Euthyra. X. Ли (Li, 1984, 1986) Paris sensu lato разделил на 2 подрода: подрод Paris с тремя секциями {Paris, Kinugasa, Axiparis) и подрод Daiswa с 4-мя секциями (Daiswa, Dunniana, Marmorata, Fargesiana). А.Л. Тахтаджян (1982; Takhtajan, 1983) разделил род Paris sensu lato на три самостоятельных рода: Paris L. sensu stricto (6 видов), Kinugasa Tatewaki et Sato (1 вид), Daiswa Raf. (15 видов). M. Тамура в своей классификации семейства Trilliaceae поддержал классификацию А. Л. Тахтаджяна (Tamura, 1998). Род Paris sensu stricto является евроазиатским видом, распространен в Средиземноморье, Европе, на Кавказе, в Сибири и Восточной Азии (включая Дальний Восток России) (Тахтаджян, 1982).

Род Daiswa Raf. (насчитывает около 15 видов (Тахтаджян, 1982; Takhtajan, 1983)) как отдельный род был впервые предложен Ц. Рафинеском (Rafinesque, 1838, цит. по Takhtajan, 1983). До него Даисву рассматривали как секцию, объединяющую различные вариации высокополиморфного Paris polyphylla Smith и близких к нему видов. Однако предложение Рафинеска осталось незамеченным другими ботаниками. А.Р. Франшет в своей монографии о роде Paris не упомянул о роде Daiswa, но отметил ее синонимом Euthyra (A. R. Franchet, 1888, цит. по Takhtajan, 1983). Род Daiswa не был упомянут ни X. Хара (Нага, 1969), ни Ф. Ванем и Ц. Танем в их монографии о роде Paris в Китае (Wang, Tang, 1978). А.Л. Тахтаджян по ряду морфологических признаков семян и плодов признал как отдельный род Daiswa Raf., который ранее обозначался как комплекс P. polyphylla Smith (Takhtajan, 1983). Однако X. Ли вскоре вновь рассматривал Daiswa в пределах рода Paris sensu lato (Li, 1988). Виды рода Daiswa распространены в умеренной зоне Гималаев, в северо-восточной Индии, северной Бирме, в Китае, Вьетнаме (Тахтаджян, 1982).

Род Kinugasa Tatew.& Sato представляет собой монотипный род с единственным видом Kinugasa japonica (Franch. et Sav.) Tatewaki et Suto, который встречается в горных буковых и хвойных лесах северных и центральных районов о-ва Хонсю (Япония) на высоте 1000-2100 м над уровнем моря (Тахтаджян, 1982). Ранее этот вид определяли как Paris japonica Franch., но в 1935 году М. Татеваки и Т. Сато выделили его в отдельный род, так как его морфологические характеристики отличаются от морфологических характеристик типичных представителей Paris и Trillium. (Tatewaki, Suto, 1935).

Начиная исследования, изложенные в данной работе, мы взяли за основу классификацию А.Л. Тахтаджяна (1982; Takhtajan, 1983), подразумевая в составе сем. Trilliaceae 4 рода: Trillium L., Paris L. s. s., Daiswa Raf., Kinugasa Tatew.& Sato. В последнее время ряд исследователей (Kasempour Osaloo, Kawano, 1999; Kasempour Osaloo et al., 1999; Farmer, Schilling, 2002), основываясь на данных молекулярной систематики в

совокупности с морфологическими данными, вновь пересмотрели внутрисемейственные отношения Триллиевых, о чем будет сказано ниже.

2.2. Семейство Trilliaceae на территории России.

Для флоры России известны два рода сем. Trilliaceae: род Trillium (насчитывает в России 5 видов и 1 межвидовой гибрид) и род Paris (в России насчитывает 5 видов) (Черепанов, 1995).

Ниже приведена таблица видов сем Trilliaceae, встречающихся на территории России и их синонимика.

Табл. 2.1. Виды сем Trilliaceae, встречающиеся на территории России и их синонимика.

Род Trillium представлен видами: Т. camschatcense, распространенным на Камчатке, Курильских островах, Сахалине и в Хабаровском крае, Т. tschonoskii, встречающимся только на острове Сахалин и образующим триплоидные природные гибриды Т. х hagae с предыдущим видом, Т. rhombifolium, встречающимся в Приморье и морфологически сходным с японским видом Т. hagae Miyabe et Tatewaki, а также Т. apetalon (встречается в пределах южного Сахалина и южной и центральной части Курил) и Т. smallii (южный

Сахалин) (Гриф и др., 1977; Харкевич, 1988; Черепанов, 1995). Все российские виды относятся к восточноазиатской группе.

В отношении систематики Т. rhombifolium было сначала много неясного. В.Л.Комаров (1935) выделил этот вид как самостоятельный, потому что исследуемые экземпляры имели более широкие листья и более толстые корневища, но В.Н. Ворошилов (1966а, б) определил этот вид как Т. camschatcense.

С развитием цитогенетических методов стало возможным изучать виды на хромосомном уровне. В 1966 году А.П. Соколовская (1966) определила для Т. rhombifolium хромосомное число 2п ~ 30. В 1977 году В. Г. Гриф с соавторами подтвердили хромосомное число 2п=30 и, кроме того, установили, что Т. rhombifolium отличается от Т. camschatcense паттерном распределения гетерохроматиновых сегментов хромосом, о чем будет сказано ниже. Все это подтвердило правомочность выделения Т. rhombifolium в отдельный вид (Гриф и др., 1977).

Род Paris на территории России представлен видами: P. quadrifolia, P. incompleta, P. verticillata, P. manshurica, P. setchuensis. В Европейской части России произрастает P. quadrifolia. Также он произрастает на территории Сибири и Кавказа. На территории Северного Кавказа и части Закавказья (в пределах Российиской Федерации), а также на северо-востоке Турции (в районах, граничащих с Аджарией) произрастает субэндемичный вид P. incompleta. P. verticillata встречается на территории восточной Сибири и Дальнего Востока. На Дальнем Востоке также растут P. manschurica (Приморье, Амур), P. setchuensis (Mill, 1984; Харкевич, 1988; Черепанов, 1995; Байков, 2005).

2.3. Морфологические характеристики представителей сем. ТпШасеае.

Все виды Триллиевых - типичные мезофиты, предпочитающие влажные почвы. Они растут обычно в тенистых местах, в хвойных и лиственных лесах, на влажных местах среди кустарников.

Триллиевые - многолетние травы с длинным или коротким, горизонтальным или вертикальным моноподиальным корневищем, от верхушки которого ежегодно отходит 1-3 однолетних побегов. Стебель всегда простой, прямостоячий, короткий или высокий. Листья триллиевых в мутовках по 3 (триллиум) или по 4-22 (остальные роды) в верхней части стебля, сидячие или на черешках, от линейных до яйцевидных, эллиптических, округлых, ромбовидных. Жилкование листьев характеризуется большей или меньшей сетчатостью. Устьица аномоцитные. Сосуды только в корнях, с лестничной перфорацией. Цветки триллиевых всегда одиночные на верхушке стебля, обычно крупные, на прямой или редко

согнутой цветоножке или сидячие, обоеполые, актиноморфные, трехчленные или реже четырехчленные с двойным околоцветником или иногда безлепестные. Сегменты околоцветника свободные. Чашелистики обычно ланцетовидные, зеленые, сохраняющиеся до созревания плода. Лепестки от нитевидных до овальных или яйцевидных, опадающие или усыхающие после цветения. Тычинок 6-22 (у триллиума всегда 6), прикрепленные к основанию сегментов околоплодника, нити обычно короткие, тонкие, плоские, иногда с надсвязником. Пыльники прикреплены к нити основанием, продолговатые или нитевидные, раскрывающиеся продольной щелью. Пыльцевые зерна однобороздные. Гинецей паракарпный или реже синкарпный из 3-Ю плодолистиков (у триллиума всего 3 плодолистика), завязь верхняя, 1-гнездная или 3-4 гнездная. Столбики свободные или более-менее сросшиеся. Плоды более или менее мясистые, ягоды (p. Trillium) или коробочковидные (p. Daiswa). Семена с эндоспермом и с очень маленьким недоразвитым зародышем, эллипсоидальные, шаровидные, у p. Trillium снабженные белым придатком -строфиолой, у остальных родов придатки отсутствуют (Тахтаджян, 1982).

В следующих разделах приведены морфологические характеристики видов, использованных нами для кариосистематических исследований.

2.3.1. Морфологические характеристики Trillium camschatcense Ker.-Gawl.

(Samejima, Samejima, 1991):

Корневище плотное, короткое или длинное, цилиндрическое. Стеблей 1-3, редко больше, прямые, гладкие, зеленые, 7,7-50 см дл. Листьев 3, сидячие, от дельтовидно-круглых к ромбическо-овальным, редко ромбическо-ланцетовидные, верхушки от острых к заостренным, основания тупоугольные, 3,7-16,3 см дл., 3.4-17,4 см шир., основных жилок 3-5. Цветки на цветоножках, цветоножки прямые, 0,5-10 см дл. Чашелистики удлиненные или удлиненно - ланцетовидные, верхушки острые или заостренно-тупые, бледно-зеленые, 11-49 мм дл., 5-19 мм шир. Лепестков 3, овальные или овально-удлиненные, эллиптические или редко удлиненно-ланцетовидные, верхушки острые или заостренно-тупые, основания тупоугольные или клинообразные, белые, 18-62 мм дл., 7-36 мм шир. Тычинок 6, равные или длиннее пестика, прямые, 10-24 мм дл. Тычиночные нити линейные, расширенные к основанию, бледно-зеленые, 2-7 мм дл., пыльники линейные, 6-20 мм дл., пыльцевые мешки линейные, интрорзные, желтые, связник бледно-зеленый. Пестик 8-22 мм дл., 4-Ю мм шир., завязь коническая, цилиндрическая или коническо-яйцевидная, 3-гнездная, бледно-желтая или бледно-зеленовато-желтая, с темно-пурпурными точками или полосками к вершине, рыльце 3-долевое, доли закручены, желтоватые. Плоды от

яйцевидных к шарообразным, со стоячим рыльцем, зеленые, с пурпурными точками или темно-пурпурные, 9-30 мм дл., 6-22 мм шир.

Распространение: лиственные леса, равнины, склоны и террасы рек, о. Сахалин, Камчатка, Командорские о-ва, Курилы, Амур, Уссури, о-ва Хоккайдо, С. Хонсю, п-ов Корея, С.-В. Китай.

Примечание. По цвету завязи различаются 3 разновидности:

1) var. kamtschaticum Samejima - завязь бледно-зеленовато-желтая, в основании
рыльцев пестика темно-пурпурная, иногда с пурпурными точками. В этой вариации авторы
выделяют форму plenum - растения с двойным цветком, объясняя это тем, что аномалии в
числе листьев и цветков встречаются довольно часто,

2) var. kurilense Miyabe et Tatewaki - завязь темно-пурпурная,

3) var. soyanum Samejima - завязь бледно-желтовато-белая и зеленая в основании
рыльцев.

2.3.2. Морфологические характеристики Trillium tschonoskil Maxim.

(Samejima, Samejima, 1991).

Корневища плотные, короткие. Стеблей 1-2, прямые, неопушенные, зеленые или желтовато-зеленые, 12-45 см дл. Листьев 3, сидячие, в основном ромбическо-овальные или ромбические, верхушки заостренные, основания тупоугольные, 5,8-16 см дл., 5.5-18 см шир., основных жилок 3-5. Цветки одиночные, на прямой цветоножке 0,8-5,7 см дл. Чашелистики овально-удлиненные или овально-ланцетовидные, концы острые или заостренные, бледно-зеленые или желтовато-зеленые 12-33 мм дл., 5-14 мм шир. Лепестков 3, удлиненно-овальные, овальные или эллиптические, концы острые или заостренные, основания клинообразные, белые, 4-35 мм дл., 5-18 мм шир. Тычинок 6, прямые, равные или немного превышающие пестик, 7-13 мм дл. Тычиночные нити линейные, бледно-зеленовато-желтые, 3-6 мм дл., пыльники линейные, бледно-желтые.

Пыльцевые мешки 3-9 мм дл., интрорзные, связник бледно-зеленый. Пестик 6-15 мм, завязь яйцевидная или коническо-шарообразная, 3-гнездная, бледно-зеленовато-желтая или с малочисленными пурпурными точками или целиком темно-пурпурная, 5-12 мм дл., 4-9 мм шир., рыльце 3-долевое, закрученное, желтовато-белое. Плоды яйцеобразные, со стоячим рыльцем, зеленые 11-18 мм дл., 11-16 мм шир.

Распространение: лиственные, смешанные леса на равнинах, речные и горные склоны, смешанные леса субальпийских зон, о. 10. Сахалин, Япония - от о-ва Хоккайдо до о-ва Кюсю, п-ов Корея, о. Тайвань, Китай, Гималаи.

Примечание. В пределах этого вида выделяют 3 разновидности:

6. var. tschonoskii - завязь кремовая, иногда с маленькими пурпурными пятнами,

7. var. atrorubens Miyabe et Tatewaki - завязь имеет цвет от красновато-пурпурного к темно-пурпурному,

8. var. himalaicum Нага. В этой вариации авторы выделяют форму violaceum - растения с бледно-пурпурными лепестками.

2.3.3. Морфологические характеристики природного гибрида Trillium х hagae Miyabe

ct Tatewaki.

(Samejima, Samejima, 1991).

В смешанных популяциях Т. tschonoskii и Т. camschatcense на о-ве Хоккайдо иногда отмечаются стерильные растения с промежуточными морфологическими признаками. Это триплоидный гибрид Т. х hagae, произрастающий совместно с родительскими видами.

Корневище плотное, короткое, прямое, редко наклоненное. Стеблей 1-4, прямые, гладкие, зеленые, 21,5-49 см дл. Листьев 3, сидячие, ромбическо-округлые, остроконечные или немного заостренные к верхушкам, основания тупоугольные, 9,4-18,4 см дл., 9,1-24,3 см шир., основных жилок 3-5. Цветки одиночные, на цветоножках, цветоножки прямые, 1,9-7,4 см дл. Чашелистики удлиненно-ланцетовидные, верхушки острые или заостренно-тупые, бледно-зеленые 23-45 мм дл., 8-19 мм шир. Лепестков 3, широкие, овальные или овально-круглые, верхушки острые или заостренно-закругленные, основания тупоугольные, белые, 27-48 мм дл., 16-32 мм шир. Тычинки короче пестика, прямые, 12-17 мм дл., тычиночные нити линейные, бледно-зеленые, 3-6 мм дл., пыльцевые мешки линейные 8-13 мм дл., желтые, связник бледно-зеленый. Пестик 12-20 мм дл., завязь коническая или коническо-яйцевидная, 3-гнездная, бледно-желтая или зеленовато-желтая с темно-пурпурными точками, темно-пурпурная на верхушке, 9-18 мм дл., 7-12 мм шир., рыльце 3-долевое, доли закрученные, желтоватые. Плоды коническо-яйцевидные со стоячим рыльцем, зеленые или с пурпурными точками, в среднем 18 мм дл., 15 мм шир.

Распространение: лиственные леса, террасы рек, горные склоны о-вов Ю. Сахалин, Хоккайдо, С. Хонсю.

2.3.4. Морфологические характеристики Trillium rhombifoliutn Кот.

(Комаров, 1935; Гриф и др., 1977).

Корневища плотные, короткие. Листья неправильно ромбически-округлые или неправильно ромбически - широкоэллиптические, в верхней половине закругленные, вверху резко оттянутые в острую или заостренную треугольную верхушку, в нижней трети отчетливо закругленные, лишь у основания клиновидносуженные или закругленно-клиновидные, с наибольшей шириной выше середины или посередине листовой пластинки, 11,5-17 см дл., со средней дл. 13,8 см, 11,5-17,5 см шир., со средней шир.13,4 см, отношение длины к ширине = 1,03. Наружные листочки околоцветника продолговатые или узкоэллиптические, на верхушке отчетливо оттянутые, острые, более широкие, чем у Т. camtschatcense. Внутренние листочки околоцветника удлиненно-обратнояйцевидные, продолговато-обратнояйцевидные, реже продолговато-эллиптические или почти эллиптические, кверху обычно немного суженные, на верхушке островатые или тупые, нередко с очень коротким притуплённым носиком, к основанию слегка суженные, с наибольшей шириной выше середины листочка. Завязь сплошь белая, без темномалиновых пятен в основании рыльца. Тычинки достигают основания рылец (короче пестика), пыльники 6,5-9 мм дл., тычиночные нити (3) - 3,5-5 мм дл.

Распространение: лиственные леса, террасы рек, Южная часть российского Приморья, Китай (юг провинции Хэйлунцян, провинция Гирин), север п-ова Корея.

2.3.5. Морфологические характеристики Trillium erectum L.

(Samejima, Samejima, 1987).

Корневища плотные, короткие. Стебли прямые, гладкие, 14,0 - 44,0 см дл., светло-зеленые. Листья сидячие, широко-ромбические, верхушки заостренные, основания клинообразные, 6,0 - 17,2 см дл., 4,2 - 18,2 см шир., основных жилок 5. Цветоножка прямая, 1,5 - 9, 0 см дл. Чашелистики ланцетовидные, заостренные, бледно-зеленые, 15-39 мм дл., 6 - 18 мм шир. Лепестки от ланцетовидных до яйцевидно-ланцетовидных, острые или заостренные, 15-55 мм дл., длиннее, чем чашелистики, 6 - 28 мм шир., красновато-пурпурные или темно-пурпурные, розовые, кремовые, белые. Тычинки 5 - 16 мм дл., равные или превышающие длину пестика, тычиночные нити 2 - 6 мм дл., кремово-белые или розовые, пыльцевые мешки от бледно-желтых до серовато-пурпурных, 3 - 12 мм дл., длиннее, чем тычиночные нити. Пестик 7 - 15 мм дл., завязь шаровидная, яйцевидная, 4 -10 мм дл., 4 -10 мм шир., темно-пурпурная, 3-гнездная, рыльце 3-долевое, доли загнуты,

темно-пурпурная, 2 - 7 мм дл. Плоды яйцевидные, 12-16 мм дл., 10-15 мм шир., темно-пурпурные.

Распространение. Горные склоны лиственных, смешанных, хвойных лесов на востоке США.

Примечание. В пределах этого вида выделяют 2 разновидности:

9. var. erectum форма luteum Louis-Marie,

10. var. album (Michaux) Pursh.

2.3.6. Морфологические характеристики Trillium recurvatum Beck.

(Samejima, Samejima, 1987).

Корневища тонкие. Стебли прямые, гладкие, 14,0 - 50,0 см дл. Листья от ланцетовидных до широко-овальных или эллиптических 5,0 - 18,0 см дл., 2,4 - 7,2 см шир., неясно пятнистые, темнозеленые, верхушки острые или слабозаостренные, черешковые, дл. черешков 0,3 - 3 см. Чашелистики от ланцетовидных до овальных, 13 - 40 мм дл., 4 - 9 мм шир., верхушки острые, сильно загнутые в основании. Лепестки от ланцетовидных до овальных, 18-53 мм дл., 5 - 20 мм шир., прямые, верхушки от острых до тупоугольных, основания тонкие, от темно-пурпурных до чисто желтых. Тычинки 7 - 20 мм дл., превышающие длину пестика, сильно загнутые, тычиночные нити прямые, их длина составляет 1/3 или 1/2 длины тычинок, пыльцевые мешки интрорзные на связниках, 5-16 мм дл., связник удлиненный, вне пыльцевого мешка его длина составляет 0,5 — 2,0 мм в закругленном выступе. Пестик 4 - 12 мм дл., завязь от ромбовидной до яйцевидной, 2-8 мм дл., 3 -7 мм шир., 3-гнездная, рыльце расходящееся, концы загнуты, по длине оно примерно равно завязи. Плоды от яйцевидных до ромбовидных, с заметными крыльями.

Распространение. Лиственные леса на юго-восточном побережье США.

Примечание. В пределах этого вида описано 5 форм :

11. f. recurvatum Freeman,

12. f. luteum С lute,

13. f. shayi Palmer et Steyermark,

14. f. petaloideum Steyermark,

15. Lfoliosum Steyermark.

2.3.7. Морфологические характеристики Trillium grandiflorum Michaux

(Samejima, Samejima, 1987).

Корневища плотные, короткие. Стебли прямые, гладкие, 5,0 - 41,0 см дл., светло-зеленые. Листья широкие, ромбическо-яйцевидные, верхушки острые или заостренные, основания клинообразные, сидячие или почти сидячие, 5,1 - 17,4 см дл., 2,0 - 15,5 см шир., основных жилок 5. Цветоножка прямая или несколько наклоненная, 1,5 - 11,5 см дл. Чашелистики ланцетовидные, верхушки острые или заостренные, бледно-зеленые, 18-68 мм дл., 4 - 29 мм шир. Лепестки длиннее чашелистиков, от ланцетовидных до яйцевидных, верхушки тупоугольные или заостренные, с волнистыми краями, 30 - 85 мм дл., 9 - 47 мм шир., от белых к розовым, часто позднее превращающиеся в розово-пурпурные. Тычинки 9 - 29 мм дл., превышающие длину пестика, тычиночные нити 2 — 13 мм дл., короче пыльников, белые, пыльцевые мешки желтые, 5 - 16 мм дл. Пестик 5 - 27 мм дл., завязь шаровидно- яйцевидная, 3 - 18 мм дл., 3 -9 мм шир., бледно-зеленая, 3-гнездная, рыльце тонкое, 3-долевое, прямое или распластанное, 2 - 19 мм дл. Плоды шаровидные, слабо выраженная трехгнездность, 12 -17 мм дл., 9 -14 мм шир., темно-пурпурные.

Распространение: Богатые сырые почвы, скалистые склоны лиственных лесов на юго-востоке США.

2.3.8. Морфологические характеристики Paris quadrifolia L.

(Комаров, 1935;Цвелев, 1979)

Корневища тонкие, длинные, горизонтальные, ежегодно нарастающие своей верхушкой. Стебель голый, 15-35 см высотой, листья собраны мутовками, большей частью в числе 4 на верхушке стебля, обратно-яйцевидные, на коротких черешках, на верхушке узкозаостренные 5-14 см дл., 2-8 см шир. с тремя ясными жилками. Околоцветник двурядный, состоящий из 4 наружных ланцетовидных зеленых листочков и 4 внутренних, 15-32 мм дл. Цветки одиночные, прямостоячие, расположенные на верхушке стебля. Пыльники линейные, длиннее тычиночных нитей, заканчиваются наверху остистым заострением, равным пыльнику - надсвязником. Столбики в числе 4, сросшихся у основания, короче тычинок, переходящие в загнутые рыльца. Плод-сизовато-черная многосемянная ягода.

Распространение: смешанные, хвойные тенистые леса, Европа, Европейская часть России, Средиземноморье, Кавказ, Зап. Сибирь, Вост. Сибирь.

2.3.9. Морфологические характеристики Paris incotnpleta Bieb.

(Комаров, 1935).

Корневища длинные, горизонтальные, ежегодно нарастающие своей 'верхушкой. Растение 15-20 см высотой, листья обратно-яйцевидные или продолговато-овальные, 10-13 см дл., 8-2,5 см шир., светло-зеленые, с тремя ясными жилками, с нижней стороны матовые, кверху короткозаостренные, к основанию суженные в короткий черешок, собраны мутовками по 6-12 на концах стебля. Околоцветник состоит из 4 наружных ланцетных или яйцевидно-ланцетных листочков, 3-3,5 см в дл., 1-1,5 см в шир. Тычиночные нити значительно выше пыльников. Пыльники заканчиваются очень коротким заострением. Столбики значительно превышают тычинки. Плод - сизо-черная ягода.

Распространение: тенистые леса, до 2000 м над уровнем моря, Кавказ (Предкавказье, Дагестан, Зап. Закавказье), Сев.-Вост. Турция (Комаров, 1935; Mill, 1984).

2.3.10. Морфологические характеристики Daiswa hainanensis (Merrill) Takht.

(Takhtajan, 1983).

Растение высотой 2 м. Стебель толстый. Листьев 6-7, блестящие, от узких до продолговато-узких, верхушки листьев резко заостренные, основания тупоугольные или постепенно сужающиеся, 5 жилок, с 2-мя латеральными жилками с каждой стороны главной жилки, 23-29 см дл., 13-15 см шир., черешок 6-8 см дл. Цветоножка 45-150 см дл. Чашелистиков 6 (8), ланцетовидные, заостренные, пленочные, 5-7,5 см дл. Лепестков 6, нитевидные, зеленые, до 10 см дл. Тычинок 24 (до 34), зеленые или каштановые, тычиночные нити около 1,2 см дл., пыльники линейные, около 2 см дл., свободная часть связника 3,5-4,5 мм дл. Завязь пурпурная, с 6-ю узкими продольными крыльями (3-гнездная), столбиков 6, объединенных в основании. Распространение: тенистые леса, Китай, о-в Хайнань, С. Вьетнам.

2.4. Начальные этапы кариосистематического и цитогенетического изучения

семейства Trilliaceae Cheval.

Цитологическое изучение сем. Trilliaceae началось в 30-е годы 20-ого века (на тот момент - трибы Parideae Engl., состоящей из 2-х родов: Paris и Trillium). К. Гото и И. Стоу в 1930 г. определили для трибы Parideae основное хромосомное число Х=5 (Gotoh, Stow, 1930). Т. Хага в своей работе, посвященной сравнительному изучению трибы Paridae с

филогенетической точки зрения (Haga, 1934) впервые дал классификацию хромосом этой трибы в соответствии с их длиной: А - большой метацентрик, В - средний метацентрик, С -субметацентрик (у некоторых видов - субакроцентрик), D - акроцентрик, Е - малый метацентрик. Для американских видов принята несколько иная хромосомная классификация, нежели для азиатских (табл.2.2) (Dyer, 1964):

Табл. 2.2. Классификация хромосом сем Trilliaceae (Dyer, 1964).

Восточноазиатские Триллиумы, как уже упоминалось, характеризуются высокой плоидностью (тетра- и гексаплоиды), за исключением диплоида Т. camschatcense. Поэтому встал вопрос о происхождении полиплоидов, строении их геномов и филогенетических связях между ними. Начиная с 30-х годов ХХ-ого века было начато скрупулезное изучение этой группы японскими исследователями как на морфологическом, так и на цитологическом уровне, и на сегодняшний день накоплено множество данных по этому вопросу.

Работы первых исследователей японских Триллиумов Н. Мацура и Т. Хага (Matsuura, 1934, 1937а, б, в, 1938а, б, в; Haga, 1934, 1937, 1942) дали начало трем направлениям дальнейшего их изучения:

16. использование растений Триллиумов (особенно Т. camschatcense) как модельного объекта для цитогенетических исследований. Растения сем. Trilliaceae обладают самыми большими среди эукариот хромосомами: средняя длина хромосомы составляет 50 мкм, а впоследствии было показано, что среднее количество ДНК на гаплоидный геном = 45 пг (Ingle et al., 1975; Гриф и др., 1980). Эти характеристики делают хромосомы удобным модельным объектом для цитогенетики,

17. филогения и эволюция Триллиумов,

18. использование растений Т. camschatcense как модели для изучения генетических процессов в популяции.

Работы Т. Хага, посвященные филогенетическим связям между восточноазиатскими

видами рода Trillium были опубликованы под общим названием "Геном и полиплоидия рода Trillium. I-VI." (Genom and polyploidy in the genus Trillium. I-VI") с 1936 no 1956 годы. H. Мацура использовал Т. camschatcense как объект для исследования цитогенетических феноменов, и его работы, объединенные под общим названием "Изучение хромосом Trillium kamtschaticum Pall. I-XXX" ("Chromosome studied on Trillium kamtschaticum Pall. I-XXX") были опубликованы с 1935 по 1962 годы.

Позже, когда был изобретен метод дифференциального окрашивания хромосом при помощи предхолодовой обработки (Darlington, La Cour, 1940), внимание многих исследователей привлекло изучение внутри- и межпопуляционных генетических процессов. Опять-таки удобным объектом для этого стал диплоидный Т. camschatcense. Анализ внутривидового полиморфизма дифференциальной исчерченности хромосом у этого вида был скрупулезно проведен М. Курабайаши с соавторами с 1956 по 1970 годы (цикл статей под общим названием "Эволюция и разнообразие рода Trillium. 1-Х" (Evolution and variation in Trillium. 1-Х"). Первая монография, посвященная восточно-азиатским Триллиумам, была опубликована в 1962 году Дж. Самеджима и К. Самеджима (Samejima, Samejima, 1962). После этого были изучены следующие аспекты филогении и эволюции японских Триллиумов: 1) генетическое изучение японских полиплоидных видов (Watanabe, Kayano, 1971; Uchino, 1973; Haga et al., 1974a, 6; Saho, 1974a, 6; Uchino, 1980a, б и др.), 2) изучение жизненного цикла (Ohara and Kawano, 1986а, б, 1987 и др.), 3) филогенетическое изучение с использованием новых методик, таких, как анализ ДНК и изозимов, данных палинологии (Ihara, 1981, Yakura et al., 1983; Takahashi, 1982, 1983). Также в 1982 году Т. Хага и Р. Чаннеллом было проведено сравнительное изучение японских и американских видов Триллиумов, что способствовало лучшему пониманию эволюции этого рода как целого таксона (Haga, Channell, 1982).

Кар и ос и стем этическое изучение рода Paris, принадлежащего к трибе Parideae, было начато Т. Хага в 1934 году одновременно с изучением рода Trillium. С помощью метода рутинного окрашивания хромосом были определены число, размеры, морфология хромосом Paris japonica Franch. (в современной систематике - Kinugasa japonica) (2n=40), Paris tetraphylla A. Gray (2n=10). Эта работа показала, что роды Paris и Trillium имеют единый план строения кариотипа, в котором можно выделить А, В, С, D, Е -типы хромосом (Haga, 1934). Сходство типов хромосом в роде Paris было подтверждено в 1941 году К. Дарлингтоном на основе изучения поведения хромосом в первом мейотическом делении (Darlington, 1941). В 1937 году Т. Хага, исследуя кариотип Р hexaphylla Cham., выделил 6 его разновидностей (4 - в диплоидных формах (2п=10) и 2 - в триплоидных (2п=15)), различающихся длиной плеч хромосом С и D (Haga, 1937а). Сравнения морфологии

хромосом как меж-, так и внутриродовые дали основания предположить, что полиплоиды этой трибы, возможно, возникают путем гибридизации между видами отдельного рода (Haga, 1934, 1937).

Много работ было посвящено P. quadrifolia (2п=4Х=20), начиная с работ Тишлера и Гото (Gotoh, 1933; Tischler, 1934). При помощи методов С-бэндинга и CSR-бэндинга его изучали Полна (Polya, 1950), Малахова (Малахова и др., 1979), Лаан и Ли (Laane and Lie, 1985; Laan, 1990), А.Козлова (1974, 1980; Козлова и др., 1976а, б). В этих работах было показано наличие у P. quadrifolia рас разной степени плоидности, отмечены мелкие, точечные блоки гетерохроматина, выявленные при помощи С-окрашивания и полимофизм распределения гетерохроматиновых С-сегментов между некоторыми расами.

Paris incompleta был исследован В.И. Быстровой методом рутинного окрашивания. Было показано, что кариотип этого вида соответствует базовому кариотипу Триллиевых. Отмечен гетероморфизм спутничных хромосом, который свойственен ближайшему виду P. verticillata Bieb. (Быстрова, 1968).

Азиатские виды Парисов были изучены многими китайскими и ^японскими исследователями. В 80-е годы XX века китайские цитологи описали кариотипы 16 видов восточноазиатских Парисов: почти все они были диплоидами и некоторые из них имели добавочные хромосомы (Gu, Li, 1988; Li et al., 1988)). Согласно H. Ли с соавторами (Li et al., 1988) внутри базового кариотипа можно выделить 2 типа: 1) "тропический" тип -содержит 6 метацентрических хромосом и 4 телоцентрические хромосомы и 2) "умеренный" тип - содержит 6 метацентрических хромосом, 2 субтелоцентрические и 2 телоцентрические хромосомы или же 6 метацентриков и 4 субтелоцентрика. К "тропическому" типу относятся 13 видов, произрастающих в тропических и субтропических регионах Азии, все они диплоиды, к "умеренному" типу относятся 6 видов, произрастающих в умеренных областях Евразии, в том числе P. quadrifolia, а также Kinugasa japonica (Franch. et Sav.) Tatewaki et Suto (2n=40), который ограничен Восточной Японией.

До открытия методов дифференциального окрашивания, для того, чтобы изучить строение геномов полиплоидов, проводили анализ поведения хромосом в мейозе, в первом мейотическом делении Ml. Изучение поведения хромосом в мейозе, проведенное Т.Хага в 1937 г. (Haga, 1937) на растениях Т. camschatcense, Т. smallii, Т. tschonoskii и Т. х hagae (природном межвидовом гибриде между Т. camschatcense и Т. tschonoskii) позволило предположить геномную композицию этих видов и ввести номенклатуру геномов. Особый интерес представляло изучение поведения хромосом в мейозе у природного триплоидного гибрида Т. х hagae, который встречается в смешанных популяциях Т. camschatcense и

Т. tschonoskii. Диплоидный набор 2п этого гибрида равен 15 и четко классифицируется на 3 группы по 5 хромосом. Эти группы представляют собой сумму гаплоидных наборов хромосом Т. camschatcense (п=5) и Т. tschonoskii (п=10). В первом мейотическом делении при коньюгации у Т. х hagae в 86,0% случаев наблюдали 5 бивалентов и 5 унивалентов; 4, 3, 2, 1 бивалентов встречались соответственно в 9.3%, 4.9%, 0%, 0,6% случаев. В 21,6% и 3,1% случаев образуются 1-2 тривалента. Хага интерпретировал это следующим образом: коньюгируют вероятнее всего хромосомы, принадлежащие к родственным геномам, а неспаренным остается геном, имеющий низкую степень гомологии с первыми. На основании этого он ввел обозначения: геном Т. camschatcense обозначил KiKi, геном Т. х hagae К1К2Т, где хромосомы геномов Ki и Кг коньюгируют между собой, а хромосомы генома Т остаются неспаренными, геном Т. tschonoskii - К2К2ТТ (т.е. один из субгеномов Т. tschonoskii более близок к геному Т. camschatcense, чем к другому субгеному). Триваленты можно интерпретировать как результат частичной коньюгации между К- и Т-геномами, они имеют низкую степень гомологии. Также на основании морфологических признаков и поведения хромосом в мейозе Хага определил 1 из 2 субгеномов 71 smallii (обозначил S), отличный от К и Т (Haga,1937).

Таким образом, на основании поведения хромосом в I мейотическом делении у межвидовых гибридов были идентифицированы следующие геномы:

Табл. 2.3. Номенклатура геномов видов сем. Trilliaceae, изученных на основании поведения хромосом в I мейотическом делении (Haga, 1937).

2.5. Методы дифференциального окрашивания хромосом растений. 2.5.1. Метод холодового окрашивания хромосом - CSR-метод.

Быстрое накопление данных и развитие кариосистематики в конце 30-х - начале 40-х годов совпало с открытием первого способа дифференциального окрашивания хромосом.

Одним из первых способов дифференциального окрашивания хромосом был метод холодовой деконденсации гетерохроматиновых сегментов, ныне известный как CSR-метод (cold sensitive region). Этот до сих пор малоизученный феномен был впервые описан Е.Н. Шмаргонь на хромосомах ржи (1938) и Н.Г. Кахидзе на хромосомах Crepis capillaris (1939), однако получил широкую известность благодаря исследованиям К. Дарлингтона и Л. Ла Кура, выполненным на хромосомах Триллиевых (Darlington, La Cour, 1940). Суть его

заключается в том, что молодые корни помещают в холод при 0С на 72 часа, тем самым подвергая делящиеся клетки корневой меристемы холодовому воздействию. Затем фиксируют по Карнуа в течение 24 часов и окрашивают по Фельгену (сперва проводят гидролиз хромосом, затем окрашивают препараты сернистой кислотой и/или реактивом Шиффа (Гриф, 1977). Под воздействием низких температур (около 0С) в течение 48-96 часов в метафазных хромосомах растений выявляются фельген-отрицательные участки, названные первоначально h-сегментами (от слова heterochromatin), соответствующие гетерохроматину (впоследствии названные CSR-сегментами). На цитологических препаратах хромосом они выглядят более светлыми по сравнению с другими участками хромосом и в целом хромосома имеет дифференциальную исчерченность. Было предложено несколько гипотез для объяснения этого явления. Долгое время господствовали теории "нуклеинового голодания", предложенная Дарлингтоном и Ла Куром (Darlington, La Cour, 1938, 1940) и "неполной спирализации", выдвинутой Г.Б.Вильсоном и Е. Р. Бутроидом (Wilson, Boothroyd, 1941). Авторы этих теорий утверждали, что при пониженных температурах продолжается деление клеток, сопровождающееся нарушением синтеза ДНК, т. е., в современных терминах, локальной недорепликацией ДНК h-сегментов (по Дарлингтону) или нарушением спирализации ДНП (по Вильсону и Бутройду). Эти нарушения происходят в интерфазе-профазе замедленно идущего митоза и приводят к выявлению гетерохроматиновых сегментов в метафазе. Детальное изучение воздействия низких температур на митоз, проведенное В. Г. Грифом с соавторами на хромосомах Тcamschatcense, показало, что при воздействии холодом происходит остановка митоза (Гриф, Валович., 1977, 1978). Следовательно, гетерохроматиновые сегменты появляются в полностью сформированных метафазных хромосомах, в клетках, которые от начала и до конца воздействия низкой температурой находятся в метафазе. В этом случае не происходит нарушения синтеза ДНК или спирализации, т. к. и то и другое было завершено до начала воздействия холодом (Гриф, Валович, 1978). Кроме того, было показано, что воздействие холодом не приводит к изменению относительной длины и центромерного индекса хромосом (Гриф, Свешникова, 1975). Все эти данные противоречат теориям Дарлингтона и Вильсона, которые допускают деление клеток при воздействии холодом. Известно, что при переносе материала с выявленными h-сегментами из холода обратно в оптимальные условия наблюдается очень быстрое восстановление этих участков так, что при окраске по Фельгену гетерохроматиновые сегменты вновь становятся неотличимыми от эухроматиновых участков метафазных хромосом. Причем этот процесс происходит значительно быстрее, чем выявление сегментов при охлаждении. Если для максимального выявления h-сегментов

требуется 72-96 часов охлаждения, то для восстановления достаточно 3-7 часов (Wilson, Boothroyd, 1941; Haga, Kurabayashi, 1953; La Cour et al., 1956; Dyer, 1964). Эти данные свидетельствовали в пользу предположения о деспирализации гетерохроматиновых сегментов метафазных хромосом под влиянием холода и восстановлении их структуры при переносе в оптимальные условия. (Гриф, Валович, 1977; Grif, 2000).

Для проверки этого предположения В.Г. Грифом и Е.М. Валович (1977, 1978) был поставлен эксперимент по изучению динамики радиоактивной ЗН-тимидиновой метки в метафазных хромосомах Т. camschatcense при воздействии холодом и после него. Результаты показали, что после холодового воздействия в течение 92 часов количество зерен метки над гетерохроматиновыми сегментами метафазных хромосом уменьшалось приблизительно в 6 раз, тогда как над эухроматиновыми сегментами количество зерен метки оставалось практически неизменным. При переносе корней Т. camschatcense обратно в оптимальные условия после окончания холодового воздействия количество зерен метки над h-сегментами уже через 4 часа становилось практически таким же, как и над эухроматином и таким же, как было в контроле до начала воздействия холодом. Результаты этого опыта убедительно доказывали, что появление h-сегментов связано, возможно, с деспирализацией этих участков под воздействием холода. При деспирализации петли (нити) ДНК (ДНП), отходящие от этих участков в цитоплазму микроскопически невидимы, их слабая метка практически неотличима от присутствующей в цитоплазме фоновой метки. При переносе обратно в оптимальные условия происходит обратный процесс спирализации, уплотнение петлей (нитей) ДНК (ДНП) и количество зерен метки восстанавливается. Далее авторы предположили, что деспирализация h-сегментов может быть связана с функциональной активностью гетерохроматина в экстремальных условиях. Возможно, что происходит активизация транскрипции этих участков, что приводит к дополнительному синтезу веществ, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки в экстремальных условиях (Гриф, Валович, 1978).

Метод холодового бэндирования хромосом все же ограничен в применении, т. к. дает результаты только у немногих объектов. Главная его особенность - воздействие стрессовым фактором (холодом) на нефиксированные хромосомы. Цитохимические методы дифференциального окрашивания более универсальны и позволяют выявлять гетерохроматиновые сегменты хромосом практически у всех исследуемых объектов.

2.5.2. Дифференциальное окрашивание хромосом с помощью С-метода.

Одним из основных методов окрашивания фиксированных хромосом является С-метод. Начиная с 1972 года, этот метод применялся при исследовании кариотипов растений (Vosa, Marchi, 1972). С-метод представляет собой окрашивание хромосом, выявляющее блоки гетерохроматина без холодовой предобработки хромосом. Зафиксированные корни инкубируют в насыщенном растворе Ва(ОН)2, где происходит денатурация ДНК, затем промывают в цитратном буфере (происходит ренатурация ДНК) и окрашивают красителем Гимза, представляющим собой сложный комплекс метиленового синего, азура и эозина. Известно много модификаций этого метода (Lavania, 1978; Miyamoto, Kurita, 1990; Uchino, Wang, 1996). Одним из интересных вопросов стал вопрос о соответствии паттернов гетерохроматиновых сегментов (рисунков дифференциальной исчерченности хромосом), выявляемых при разных методах окрашивания. Исследования различных авторов показали, что в некоторых случаях между CSR-сегментами и С-сегментами существует корреляция. У ряда растений, таких, как Trillium erectum (Casperson et al., 1968), Trillium grandiflorum (Schweizer, 1973), Scilla siberica (Schweizer, 1973; Vosa, 1973), Fritillaria lanceolata и F. recurva (Schweizer, 1973), Adoxa moschatella (Greilhuber, 1979) позитивные С-сегменты совпадали с CSR-сегментами. С. Такехиза и С. Уцуми (Takehisa, Utsumi, 1973), а в России Л.И.Свешникова и В. Г. Гриф в 1981 году, работая с Т. camschatcense, показали, что С-метод выявляет не только CSR-сегменты, но и другие гетерохроматиновые районы хромосом. Или иными словами, CSR-сегменты окрашиваются как С-бэнды, но не все С-бэнды выявляются как CSR-сегменты (Свешникова, Гриф, 1981). То же самое было показано для двух американских видов Триллиумов (Chinnappa, Morton, 1978), для родов Galanthus, Leucojum (Свешникова, Гриф, 1981), для 5 видов Cestrum (Berg, Greilhuber, 1992, 1993а, б), для Paris tetraphylla (Uchino, Wang, 1996). Таким образом, корреляция между позитивными С-бэндами и CSR-бэндами остается неясной. А. Учино и Л. Вань (Uchino, Wang, 1996), а также Л. И. Свешникова и В. Г. Гриф (1981) объясняли это разными свойствами гетерохроматина в данных локусах: одни сегменты реагируют на CSR-и С-окрашивание, другие - только на С-окрашивание.

Тем не менее, оба метода, как CSR-окрашивание, так и С-окрашивание пригодны для целей сравнительной кариологии, использование каждого позволяет выявить видовую специфичность дифференциальной исчерченности хромосом.

2.5.3. Дифференциальное окрашивание хромосом с помощью флуоресцентных нуклеотидспецифичных красителей (Q-окрашивание).

В 1968 году при изучении одного из видов Триллиевых - Trillium erection L. Касперсоном был открыт феномен линейной неоднородности хромосом высших эукариот, выявляемой при окрашивании хромосом флуоресцирующим красителем акрихин-ипритом, так называемая Q -исчерченность (Casperson et al., 1968). Впоследствии были разработаны методы, позволяющие не только выявлять участки гетерохроматина по длине хромосомы, но и определять их молекулярную композицию, т. е. насыщенность аденин-тимин (AT) и гуанин-цитозин (GC) парами оснований. Для этой цели используются флуорохромы. Для выявления АТ-пар оснований используется Hoechst 33258 (производное бензимидазола) (Н-33258) и DAPJ (4, 6 диамидино-2-фенилиндол), встраивающиеся в малую бороздку ДНК и связывающиеся с кластерами из 3-4 рядом лежащих пар нуклеотидов (Schweizer, 1976, 1981). Блоки GC-обогащенного гетерохроматина выявляются с помощью хромомицина A3 (СМА) или оливомицина. Чем больше число ГЦ-пар, тем большим будет число молекул флуорохрома, связывающихся с данным участком хромосомы и, следовательно, тем ярче флуоресценция.

Результаты флуорохромного бэндинга на хромосомах Т. camschatcense были изучены А. А. Беляевым и Н. Н. Беляевой в 1991 году и А. А. Беляевым с соавт. в 1995 году (Беляев, Беляева, 1991, 1991а; Belyaev et al., 1995). Они изучали также взаимное расположение Q-, С- и CSR-паттернов. Результаты показали, что паттерн Q-сегментов, получаемый при окрашивании хромосом красителем Hoechst-33258 или DAPI полностью совпадает с С-паттерном, получаемым при окрашивании красителем Гимза. На основании этого был сделан вывод о преимущественно АТ-обогащенном гетерохроматине хромосом Т. camschatcense. В отношении GC-обогащенного гетерохроматина были получены интересные данные. Первоначально те же авторы не обнаружили положительной реакции окрашивания хромомицином A3. Затем, спустя год, при повторном просмотре тех же препаратов, они выявили малочисленные точечные прителомерные сегменты почти на всех хромосомах и пару крупных сегментов (прицентромерный на коротком плече хромосомы С и прителомерный на коротком плече хромосомы D). Некоторые сегменты выявлялись при обоих способах окрашивания, это указывает на насыщенность гетерохроматина в равной степени как AT, так и GC-парами оснований. Сравнение расположения Q-паттернов и CSR-паттернов показало их общее сходство при некоторых различиях и разное качественное состояние. При окрашивании Н33258 выявляется больший объем гетерохроматина, чем при холодовом окрашивании, т. е. выявляются маленькие гетерохроматиновые блоки, которые

не видны на CSR-паттернах. На флуорохромных паттернах границы гетерохроматиновых сегментов более четкие, сами они однородные, без точек и узких полос, выявляемых холодом. На взгляд авторов, такое различие обусловлено разной природой исчерченности: применение красителей отражает особенности химического строения хромосом, а воздействие холодом является реакцией хроматина на воздействие экстремальным фактором. Такие различия свидетельствуют о функциональной неоднородности гетерохроматина (Беляев, Беляева, 1991, 1991а).

Окрашивание хромосом флуоресцирующим агентом акрихином или его производным - акрихинипритом, которые связываются с АТ-парами, показало яркую флуоресценцию в CSR-районах в сравнении с эухроматином у Т. erectum (Casperson et al., 1968), тусклую флуоресценцию у P. polyphylla (Filion, Vosa, 1980; Smith, Ingram, 1986) и некоторых видов Tulbagia (Vosa, 1970, 1973). Однако детального сопоставления рисунка Q-и CSR-бэндинга в этих случаях не проводилось. Подобное исследование позднее было проведено Берг и Грейлхубером (Berg, Greilhuber, 1992, 1993а, б). На хромосомах 5 видов p. Cestrum (Solanaceae) продемонстрировано, что большинство CSR-сегментов у этих видов являются АТ-обогащенными. Эти сегменты ярко флуоресцировали после окрашивания DAPI и затухали после окрашивания хромомицином A3. На других объектах такие сравнения не проводились.

2.5.4. Выявление ядрышковых организаторов (NOR) при помощи окрашивания хромосом азотнокислым серебром.

Дополнительным признаком при сравнительном изучении кариотипов является расположение ядрышковых организаторов (NOR) на хромосомах изучаемых растений. Ядрышковый организатор представляет собой участок ДНК хромосомы, в котором в интерфазе идет интенсивная транскрипция предшественника рибосомной РНК (про-рРНК), который затем подвергается процессингу с образованием зрелых 5,8S, 18S, 28S -рРНК. Последовательности генов рРНК эволюционно консервативны, число генов, кодирующих рРНК, колеблется от сотен до нескольких тысяч в зависимости от вида эукариот. Они находятся в одной или нескольких хромосомах в областях с характерной морфологией, названных ядрышковыми организаторами. Во время интерфазы эти участки объединяются в ядрышки - структуры, в которых идет интенсивная транскрипция генов рРНК, процессинг про-рРНК и сборка рибосом.

Традиционно методом выявления транскрипционно активных в интерфазе ядрышковых организаторов является окрашивание метафазных хромосом нитратом серебра (AgNOa),

который связывается с аргентофильными белками, расположенными преимущественно в этих районах хромосом. Выявить все ядрышковые организаторы помогает метод FISH-гибридизации хромосом с кластерами рибосомных генов (5,8S-18S-28SpPHK). Картина расположения ядрышковых организаторов может быть разная у разных видов или групп видов, поэтому этот признак заслуживает пристального внимания (Сингер, Берг, 1998).

2.6. Роль CSR-метода в кариосистематике сем. ТгППасеае.

Картина распределения гетерохроматиновых сегментов и их число и размеры в хромосомах постоянны для каждого вида и являются своеобразным "паспортом" вида. С помощью CSR-метода были изучены гетерохроматиновые сегменты хромосом ряда растений: Paris, Trillium (Darlington, La Cour, 1938, 1940; Kurabayashi, 1948; Shaw, 1959; Dyer 1964; Fukuda, 1973; Свешникова, Гриф, 1981), Fritillaria, Vicia (Pelc, La Cour, 1960; Dyer, 1963), Crepis capillaris (Гриф, 1963), Tulbaghia (Vosa, 1966), Scilla (Baumann, 1971) и др. Больших успехов в использовании метода холодового выявления гетерохроматиновых сегментов добились японские цитологи, о чем было сказано выше. Ими проведен кариологический и геномный анализ не только всех японских видов и гибридов рода Trillium, но и популяционный анализ вида Т. camschatcense из многих мест обитания, а также популяционный анализ некоторых американских видов. Состав геномов представлен в табл. 2.4.

Табл. 2.4. Виды и межвидовые гибриды p. Trillium, произрастающие в Японии и состав их геномов, выявленный при помощи CSR-бэндинга (Samejima, Samejima, 1991).

2.6.1. Полиморфизм CSR-ссгмснтов Т. camschatcense Ker.-Gawl. (KjKi).

С помощью метода холодового бэндинга были подробно исследованы кариотипы Т. camschatcense в различных популяциях островов Японии. Анализ распределения CSR-сегментов (или паттернов CSR-сегментов - рисунков дифференциальной исчерченности хромосом) показал высокий полиморфизм как внутри популяций, так и между ними. По хромосоме А было выявлено 23-75 типов паттернов, по хромосоме В - 14-21 типов, по хромосоме С - 9-17, по хромосоме Д - 8-17, по хромосоме Е - 8-20 (Haga, Kurabayashi, 1954; Kurabayashi, 1954, 1957, 1958; Fukuda, Kozuka, 1958; Fukuda, 1962). Такое многообразие японские цитологи обьясияют происходящими в популяциях хромосомными перестройками (дефишенси и делеции малых хромосомных сегментов, транслокации, а также кроссинговер между различными хромосомными типами) (Haga, Kurabayashi, 1954).

Несмотря на высокий полиморфизм паттернов CSR-сегментов, оказалось возможным определенные их типы приурочить к определенным популяциям. Авторы сочли целесообразным разделить популяции Т. camschatcense на 3 группы: Северную, Южную, Восточную (Kurabayashi, 1958). Им свойственны соответственно северные, южные, восточные типы паттернов (обозначают N, S, Е-тип). Также есть еще NE, SE, NS-типы, характерные для севера и востока, юга и востока, севера и юга.

Северная группа популяций расположена на острове Хоккайдо. Она характеризуется тем, что имеет маленькое количество паттернов, но эти паттерны распространены более чем в половине популяций, т.е. группа высокогомогенна.

Восточная группа занимает восточный Хоккайдо. Здесь популяции гетерогенны по сравнению с северной группой, имеют большее число паттернов. Популяции большие и мало изолированные друг от друга.

Южная группа популяций распространена на северном Хонсю и южном Хоккайдо. Здесь распределение Т. camschatcense более дискретно, более разграничено и прерывисто. Популяции подразделяются на субпопуляции, которые отграничены друг от друга и в каждой происходит закрепление определенного типа паттерна, т.е. они гомогенны, а в целом в южной группе получается более разнообразная картина паттернов, чем на севере и востоке. Имеется некий географический градиент по паттернам хромосом от северо-востока до юго-запада. В этом направлении происходит изменение типов и частот паттернов, тем

самым обуславливая полиморфизм. Фиксация определенных паттернов происходит на юго-западе. Именно эти популяции имеют высокий индекс гомозиготности. Вероятно, этот факт объясняется тем, что на юге очень давно стало развиваться сельское хозяйство и лесоводство, что привело к изоляции популяций и субпопуляций друг от друга (Haga, Kurabayashi, 1954).

Интересное сочетание групп представлено в долине Ишикари. Здесь состыкуются 3 вышеназванные группы и отмечен высокий полиморфизм. На севере этой долины прослеживается влияние северной группы, на юге - южной.

Для удобства оценки полиморфизма популяции первоначально был введен индекс гомогенности (Haga, Kurabayashi, 1954; Kurabayashi, 1958). Он представляет собой усредненное значение индексов, вычисленных для 5 типов хромосом (А-Е). Гомологичные хромосомы, имеющие одинаковый рисунок CSR-исчерченности обозначают как имеющие "гомозиготное состояние", а гомологичные хромосомы, имеющие разный рисунок исчерченности, - "гетерозиготное состояние". Индекс гомогенности равен :

(число гомоморфных пар хромосом / общее число пар / число паттернов)хЮО% Если индекс=100% (популяция Кузакаи), это означает, что все растения имеют одинаковый рисунок дифференциальной исчерченности, т. е. популяция гомогенна. Если индекс низкий (популяции Самани 5%, Сизунаи 7%), это означает, что в этой популяции высокая гетерозиготность по каждому типу хромосом. Степень гомозиготности коррелирует с размером популяции: в маленьких популяциях (Кузакаи, Ино - несколько сотен растений) высокая гомозиготность (100% и 78% соответственно), в больших (Аккези, Сизунаи, Самани - десятки тысяч растений) - низкая (14%, 7%, 5% соответственно), зато возрастает гетерозиготность. Это объясняется тем, что с увеличением размера популяции увеличивается частота хромосомных перестроек. Также отмечено, что разные хромосомные паттерны распределены в популяциях неравномерно. По-видимому, в популяциях закрепление одного типа паттерна происходит с одной стороны, случайно, благодаря дрейфу генов или блоков генов, имеющих значение для адаптации, а с другой - идет естественный отбор в популяциях (Haga, Kurabayashi, 1954).

Наряду с индексом гомозиготности была введена другая оценка степени полиморфизма популяций - NTC (Total number of chromosome types found in a sample of a given population - общее число обнаруженных хромосомных типов в данной популяции /5), где 5 - число пар гомологичных хромосом (Kurabayashi, 1958). Генетическая гомогенность в природных популяциях Т. camschatcense обуславливается размером популяции, длительностью и интенсивностью изоляции. Ведущая сила для снижения значения NTC -это слуайный генетический дрейф (Hiraizumi, 1956). В больших и мало изолированных

популяциях (тысячи и десятки тысяч особей) NTC большой -3,2-4,2. В средних популяциях (тысяча или несколько тысяч) NTC имеет среднее значение - 2,2-3,2. В малых и дискретных популяциях значение NTC снижается до 1-2,1. Иными словами, в малых и ограниченных популяциях происходит закрепление одного, реже нескольких типов паттернов, тогда как в больших и слабо изолированных популяциях число паттернов достигает нескольких десятков. Географическая дифференциация, раскрытая посредством холодового бэндинга, может быть также выведена из сравнения средних значений морфологических характеристик растений Т. camschatcense (длина клеток устьиц, соотношение длины и ширины лепестков, чашелистиков, листьев, соотношение высоты и диаметра плодов). И хотя степень внутрипопуляционного полиморфизма высока, наблюдается следующая тенденция: растения южных популяций имеют более узкие листья, чашелистики, лепестки, чем растения северных популяций. А растения восточных популяций имеют более широкие лепестки и более крупные плоды (Samejima, 1958).

Среди российских исследователей-цитологов CSR-бэндинг у Т. camschatcense изучал В. Г. Гриф с соавторами в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова, г. Ленинград (Санкт-Петербург). Ими опубликован целый цикл работ по действию низких температур на хроматин и количество ДНК Т. camschatcense (Гриф, 1966; Гриф, Свешникова, 1975; Гриф и др., 1977; Гриф, Валович, 1977, 1978; Гриф, 1980; Свешникова, Гриф, 1981; Гриф и др., 1985, 1987). Они также исследовали кариотипы растений из разных популяций Приморского края: о-вов Сахалин и Кунашир. Анализ CSR-паттернов показал, что эти популяции незначительно различаются между собой по CSR-паттернам (Гриф и др., 1977).

2.6.2. Полиморфизм CSR- сегментов Т. rhombifolium Кот.

В.Г. Грифом с соавторами (1977) был проведен анализ растений Т. rhombifolium, который В. Н. Ворошиловым был отнесен к Т. camschatcense (Ворошилов, 1966а, 6). Анализ CSR-паттернов кариотипов обоих видов позволил ориентировочно установить их систематические отношения. Выяснилось, что в кариотипе Т. rhombifolium содержится 4 из 5 хромосом Т. camschatcense (имеется в виду гаплоидный кариотип) и 4 хромосомы от Т. tschonoskii, остальные 7 идентифицировать не удалось. Так, вторая хромосома Т. rhombifolium по всем признакам (размеры, центромерный индекс, расположение и величина CSR-сегментов) идентична первой хромосоме Т. camschatcense. Пятая хромосома Т. rhombifolium сходна со второй хромосомой Т. camschatcense, седьмая - с четвертой, одиннадцатая - с пятой. Что касается третьей хромосомы Т. camschatcense, то ее короткое плечо по паттерну CSR-сегментов сходно с коротким плечом четвертой хромосомы

Т. rhombifolium, однако хромосомы различаются большими плечами. В этом случае вполне можно допустить наличие хромосомной перестройки, в результате которой третья хромосома камчатского типа получила новые характеристики и стала неузнаваемой. Таким образом, Т. rhombifolium является гибридогенным видом, одним из родителей которого был Т. camschatcense, другим - Т. tschonoskii. Основанием для последнего утверждения служит сходство рисунка CSR-бэндинга третьей хромосомы Т. rhombifolium с первой хромосомой Т. tschonoskii, восьмой с третьей, тринадцатой с четвертой, пятнадцатой с пятой. Остальные хромосомы Т. rhombifolium остаются неидентифицированными, вероятно, они принадлежали третьему предку Т. rhombifolium (Гриф и др., 1977). Здесь следует отметить, что Т. rhombifolium по морфологическим характеристикам сходен с аллогексаплоидным видом Т. hagae (2п=6х=30), произрастающим в Японии на о-ве Хоккайдо. Геном Т. hagae является прямой совокупностью генома Т. camschatcense и геномов Т. tschonoskii. Это было показано с помощью CSR-бэндинга: гексаплоидный кариотип Т. hagae состоит из 5 пар хромосом Т. camschatcense и 10 пар Т. tschonoskii. Такой состав генома указывает на гибридогенное происхождение вида Т. hagae (Haga, Kurabayashi, 1953; Haga, 1956; Гриф и др., 1977).

2.6.3. Полиморфизм CSR-сегментов Т. tschonoskii Maxim. (К2К2ТТ).

Это тетраплоидный вид (4х=20), его геном обозначают как К2К2ТТ, т. е. состоящий из двух геномов: К2К2 и ТТ, причем эти диплоидные геномы как самостоятельные виды в настоящее время не существуют (Haga, 1934; Samejima, Samejima, 1987). В отличие от популяций Т. camschatcense исследованные популяции Т. tschonoskii не показывают высокой вариабельности по паттернам CSR-сегментов. А. Учино (Uchino, 1985, 1985а) исследовал 4 популяции (одна - на острове Хоккайдо, три - на острове Кюсю) и выявил лишь 2 типа хромосомы А (А1 и А2), 2 типа хромосомы В (В\, В4), 3 типа хромосомы С (Cj-Сз), 3 типа хромосомы Д (Ді, Дз), 2 типа хромосомы Е (Ej, Е2).

Все 20 хромосом А-Е классифицируются на 2 субгенома Кг и Т, в каждом по 5 пар гомологичных хромосом, причем в обоих субгеномах наблюдается полиморфизм по паттернам CSR-сегментов (Haga, 1953; 1956; Uchino, 1985, 1985а).

Это свидетельствует о том, что предполагаемые вымершие предки с геномами К2К2 и ТТ также были полиморфными.

Все исследованные растения демонстрировали 100% гомозиготность по всем 10 парам гомологичных хромосом А-Е. Такая структура популяции указывает на то, что растения по большей части - самоопылители, в популяциях происходит инбридинг. Поэтому в

популяциях наблюдалось малое число паттернов CSR-сегментов. В 4 исследованных популяциях было выделено 7 CSR-паттернов, которые встречаются с разной частотой в разных популяциях. В 3 популяциях о-ва Кюсю имеются общие CSR-паттерны. В популяциях Шикоцу (о-в Хоккайдо) распространены 2 CSR-паттерна, которые не встречаются в упомянутых трех. Отсутствие общих CSR-паттернов между популяциями разных островов может указывать на то, что диплоидные предки Т. tschonoskii о-ва Кюсю отличались от диплоидных предков Т. tschonoskii о-ва Хоккайдо. Автор считает, что такое различие может пролить свет на происхождение Т. tschonoskii. Этот тетраплоидный вид рассматривается как аллополиплоид, возникший на основе обьединения геномов К2К2 и ТТ, ныне не существующих (Uchino и др., 1985).

2.6.4. Полиморфизм CSR-ссгмснтов Т. х hagae (Зх) Miyabe et Tatewaki (KiK₂T) и Т. hagae (6х) Miyabe et Tatewaki (К^КгКгТТ).

Выше уже было изложено, что Т. х hagae является триплоидным стерильным гибридом между Т. tschonoskii и Т. camschatcense. Анализ кариотипов с учетом CSR-сегментов подтвердил гибридогенную природу этих растений, выявленную Т. Хага в 1937 году: 5 хромосом идентифицируются как принадлежащие геному Т. camschatcense, а 10 -геному Т. tschonoskii (Haga, 1937; Haga, Kurabayashi, 1953; Haga, 1956; Samejima, Samejima, 1962). Этот гибрид образуется спонтанно в местах обильного произрастания Т. tschonoskii и Т. camschatcense. Полиморфизм паттернов CSR-сегментов этого гибрида зависит от степени полиморфизма родительских геномов произрастающих рядом растений. В основном это касается Кі-генома Т. camschatcense, поскольку К{Т геном Т. tschonoskii, как уже упоминалось, не столь полиморфен. В тех популяциях, где растения Т. camschatcense гомозиготны по всем 5 парам хромосом, К| геном в составе гибрида также гомозиготен и имеет тот же паттерн CSR-сегментов, что и Т. camschatcense (например, популяция Кузакаи). В больших популяциях, где растения Т. camschatcense демонстрируют высокий полиморфизм паттернов CSR-сегментов, строение Ki генома в гибридах тоже будет варьировать от растения к растению внутри популяции (популяции Самани, Тойони) (Haga, 1956). Наряду с триплоидными гибридами в этих смешанных популяциях встречались гексаплоидные фертильные особи. В основном они встречались в единичных экземплярах, но были популяции с высокой плотностью Т. hagae. В настоящее время численность растений Т. hagae такова, что позволяет говорить об отдельном виде (Haga, 1974). Предполагается, что процесс видообразования гексаплоидных форм Т. hagae проходит в несколько этапов: гибридизация между видами, удвоение генома триплоидного гибрида

T.xhagae, миграция (Haga, 1974). В пользу удвоения генома говорит тот факт, что гексаплоиды гомозиготны по К) геному, хотя рисунок CSR-сегментов этого генома у разных растений разный (Haga, 1956).

2.6.5. Полиморфизм CSR-сегментов Т. apetalon Makino (SSUU),

Т. smallii Maximowicz (K,KjSSUU или K₂K₂SSUU), Т. xyezoense Tatewaki (KiSU), Т. x miyabeanum Tatewaki (K₂TSU).

Эти виды имеют в своем составе комплексный SU-геном, причем геномы S и U, как самостоятельные виды, в настоящее время не существуют.

Тетраплоидный вид Т. apetalon Makino (2п=20) является эндемиком малых ограниченных районов Дальневосточных окраин Евразии (Юж. Сахалин, средняя часть Курил) и Японии. Среди исследованных посредством холодового бэндинга 7 популяций было выявлено 7 паттернов хромосомы А, 18 паттернов хромосомы В, 10 паттернов хромосомы С, 7 паттернов хромосомы D, 12 паттернов хромосомы Е, т. е. наблюдался внутри- и межпопуляционный полиморфизм по локализации CSR-сегментов (Haga et al., 1974а). Все растения были гомозиготны по всем 5 парам хромосом А-Е, что говорит о преимущественном самоопылении у этого вида. Это подтверждается и морфологическими признаками: у цветков длина тычинок равна или немного больше длины пестиков. Иногда в популяциях встречаются и гетерокариотипы - итог случайного перекрестного опыления. Случайное перекрестное опыление и последующее самоопыление гибридного кариотипа приводят к увеличению числа различных гомокариотипов в популяциях (Haga et al., 1984; Uchino, Kanazawa, 1988). Методом анализа частот встречаемости различных типов CSR-паттернов хромосомы SU-геномного комплекса были классифицированы на 2 субгенома S и U, причем в каждом субгеноме наблюдался полиморфизм по распределению CSR-сегментов. На основании этого можно было сделать вывод о хромосомном полиморфизме диплоидных вымерших предков этого вида с геномами SS и UU (Haga, 1974; Haga et al., 1984; Uchino etal., 1986).

Популяции гексаплоидного Т. smallii располагаются с высокой плотностью на юго-западе Хоккайдо, часто совместно с популяциями Т. apetalon (Uchino, 1980а, б, Uchino et al., 1987). Исследование кариотипической структуры популяций с помощью CSR-бэндинга показало, что 2 из 3 пар гомологичных хромосом А-Е Т. smallii идентичны хромосомам Т. apetalon, который произрастает совместно с Т. smallii. Т. е. в смешанных популяциях Т. smallii и Т. apetalon хромосомы, принадлежащие геномному комплексу SU, показывают сходную картину бэндинга. Оставшаяся 1 пара гомологичных хромосом по паттерну CSR-

сегментов чаще совпадает с хромосомами Т. camschatcense, т. е. принадлежит Кі-геному и демонстрирует высокий полиморфизм. Однако есть данные, что иногда эта оставшаяся пара хромосом демонстрирует паттерн CSR-сегментов, схожий с паттерном Кг генома Т. tschonoskii (Uchino, 1980а, б). Полиморфизм CSR-паттернов SU-комплекса, обнаруженный у Т. apetalon, встречается также и у Г. smallii. Эти факты говорят в пользу гибридного происхождения Т. smallii: вероятнее всего, он возник путем гибридизации между предковыми формами ныне существующих Т. camschatcense и Т. apetalon (Uchino, 1980а, б). Косвенным доказательством гибридогенного происхождения Т. smallii является наличие в популяциях гибридов Т. xyezoense (KiSU) и Т. х miyabeanum (K2TSU). Т. xyezoense- это стерильный гибрид между Т. apetalon и Т. camschatcense. Обычно два родительских вида разделены периодом цветения, поэтому такие гибриды образуются крайне редко. Большая часть пыльцевых зерен и семян стерильна. Т. х miyabeanum - это природный гибрид между Т. apetalon и Т. tschonoskii. Пыльцевые зерна частично фертильны. По морфологическим признакам этот гибрид похож на Т. smallii (Samejima, Samejima, 1991).

Большая часть растений у Т. smallii, как и у Г. apetalon были гомозиготами по всем парам гомологичных хромосом.. Но тем не менее кариотипы особей отличались друг от друга, что свидетельствует о преимущественном самоопылении у этих видов (Uchino, 1980а, б, Uchino et al., 1987).

2.6.6. Полиморфизм CSR-сегментов североамериканских видов Trillium.

Североамериканские виды Триллиумов также скрупулезно изучались японскими и американскими цитологами с помощью CSR-бэндинга. Сравнительный анализ паттернов CSR-сегментов, проведенный К. Дарлингтоном и Г. Шоу, а затем Дайером (Darlington, Shaw, 1959; Dyer, 1964) показал, что кариотипы североамериканских Триллиумов соответствуют базовому, все имеют диплоидный набор хромосом 2n=I0, а CSR-сегменты распределяются по всей длине хромосом, в том числе в дистальной части плеч. Они относительно малочисленны и редко полностью деспирализованы. У японских видов, наоборот, CSR-сегменты обычно выглядят или как маленькие сегменты, разделенные небольшими эухроматиновыми районами, или как очень протяженные, все они имеют проксимальное расположение. По паттернам CSR-сегментов наблюдается меж- и внутривидовой полиморфизм, также, как и у восточноазиатских Триллиумов (Kurabayashi, 1963; Dyer, 1964; Fukuda, 1970, 1973; Fukuda, Grant, 1980; Ihara, Ihara, 1982).

В работе Ихара (Ihara, Ihara, 1982) даны сравнительные описания кариотипов

12 североамериканских видов Триллиумов, а также их тип микроспорогенеза. Еще ранее эти авторы разделили североамериканские Триллиумы на три группы в соответствии с морфологией их пестика (Ihara, Ihara, 1978). Кариологические исследования подтвердили правомочность такого деления.

Представители группы Grandiflorum имеют разнообразную форму завязи: от шарообразной до конической и скипетрообразной, столбик короткий, почти незаметный, заканчивается щупальцеподобным рыльцем. Отличительные черты кариотипа этой группы - это самая длинная хромосома метацентрик А, маленькое короткое плечо субметацентрической хромосомы С и самая короткая хромосома-субметацентрик Е, хотя у самого Т. grandiflorum Michaux длина субметацентрика Е средняя, наименьшей является акроцентрическая хромосома D. Эта группа может быть поделена на подгруппы Т. nivale и Т. rivale согласно размеру коротких плеч С-хромосом: у представителей подгруппы Т. rivale оно короче, чем у представителей Т. nivale. Предположительно, стадия зиготены-пахитены в процессе микроспорогенеза приходится на октябрь.

Представители группы Pusillum имеют сросшийся столбик или сросшуюся удлиненную часть пестика, форма завязи округлая, квадратная, скипетрообразная. Кариотип характеризуется самой длинной хромосомой субметацентриком В, самой маленькой хромосомой акроцентриком D, причем ее короткое плечо больше, чем у группы Grandiflorum, субметацентрик Е имеет средние размеры. Время стадии зиготены-пахитены приходится на октябрь.

Группа Erectum делится на два комплекса: комплекс Т. erectum и T.flexipes.

У представителей группы Erectum комплекса Т. erectum (характеризуются от шарообразной до колбообразной завязью и очень коротким, почти невидимым столбиком) самая длинная хромосома метацентрик А, длина хромосомы Е варьирует от самой малой до средней. Растения комплекса Т. flexipes (колбообразная форма завязи, короткий столбик, разнообразная форма рыльца) обладают также самой большой А-хромосомой, а длина Е-хромосомы средняя.

Авторы также отмечают, что все кариотипы видов подрода Phyllantherum Raf. имеют в основном CSR-паттерн, похожий на CSR-паттерн кариотипов видов группы Erectum, хотя CSR-паттерны очень вариабельны за исключением обоих плеч хромосомы А и длинного плеча хромосомы С (Ihara, Ihara, 1982).

Что касается отдельных видов североамериканских Триллиумов, то в плане CSR-бэндинга наиболее изучены Т. erectum L., Т. ovatum Purch, Т. grandiflorum Michaux, Т. sessile L. (Kurabayashi, 1963; Dyer, 1964; Fukuda, 1973; Fukuda, Grant, 1980; Ihara, Ihara, 1982).

При исследовании CSR-паттернов Т. erection было выявлено 11 типов хромосомы А, 8 - В, 8-С, 4 - Д, 7 - Е. Только 16% от всех гомологичных пар были гомозиготами по CSR-паттернам, остальные - гетерозиготы, что указывает на большую частоту хромосомных перестроек (Dyer, 1964). При сравнительном анализе кариотипов Т. camschatcense и Т. erectum наблюдались сходные CSR-паттерны у хромосом А и D. Примечательно, что эти типы общих паттернов встречаются в популяциях Т. camschatcense, расположенных на южной границе ареала (о. Хонсю) (Fukuda, Kozuka, 1958) и в популяциях Т. erectum, также расположенных на крайних южных границах своего ареала. Возможно, что эти паттерны были свойственны предковым кариотипам и являются наиболее стабильными (Dyer, 1964).

При изучении кариотипов с помощью холодового бэндинга у Т. ovatum было выявлено 18 CSR-паттернов хромосомы А, 58 паттернов хромосомы В, 132 паттерна хромосомы С, 43 паттерна хромосомы D, 46 паттернов хромосомы Е. В отличие от восточноазиатского вида Т. camschatcense, у которого по распределению гетерохроматиновых CSR-сегментов наиболее вариабельна А-хромосома, а хромосома С -наименее вариабельна, у Т. ovatum, наоборот, А-хромосома более стабильная, а хромосома С характеризуется высокой вариабельностью (Fukuda, 1969, 1973). Как уже упоминалось, разные паттерны имеют разное адаптивное значение (Haga, Kurabayashi, 1954). По частоте определенных паттернов наиболее вариабельных хромосом (А - для Т. camschatcense, С -для Т. ovatum) оба вида можно разделить на расы: у Т. camschatcense - Северный Хоккайдо, Южный Хоккайдо, Восточный Хоккайдо (Япония) и у Г. ovatum Тихоокеанское побережье и Скалистый Горный регион (Северная Америка). Популяции, гетерогенные по CSR-паттернам хромосом А и С встречаются в Восточном Хоккайдо и в Скалистом Горном регионе, а гомогенные - в Северном и Южном Хоккайдо и на Тихоокеанском побережье (Fukuda, 1969, 1973, Fukuda, Channell, 1975). Что касается CSR-паттернов других хромосом у Т. ovatum, здесь также имеются межпопуляционные различия между двумя регионами. Шесть проанализированных популяций Тихоокеанского побережья были гомогенными по распределению гетерохроматиновых CSR-сегментов в собственных пределах, но имели различия между собой. 8 проанализированных популяций Скалистого Горного района были гетерогенны по CSR-паттернам внутри себя и между собой. Здесь также имеется большой процент гетероморфных пар некоторых хромосом. Согласно формуле

F = (% гомоморфных пар хромосом-Ері ) / 1-Epj

(где Pi- частота паттерна і данной хромосомы, a Pj- частота паттерна j данной хромосомы, f-коэффициент инбридинга), популяции Тихоокеанского побережья более инбредны (f=0,3-0,35), чем популяции Горного региона (f=0,l-0,2).

Морфологические данные, основанные на форме листа, показывают вариации,

параллельные вариациям хромосомного CSR-бэндинга. У популяций Тихоокеанского побережья форма листа не варьирует в такой степени, как у популяций Скалистого Горного региона. Такие различия между двумя группами популяций могут быть обусловлены приспособленностью к различным климатическим условиям. Тихоокеанское побережье характеризуется влажными секвойными и пихтовыми (пихта Дугласа) лесами. В Скалистом Горном регионе растения растут по большей части на открытых воздушных пространствах, под соснами Ponderosa и Lodgepole. Популяционная гетерогенность Горного региона может отражать колебания климатических и палеогеологических условий, тогда как популяционная гомогенность Тихоокеанского побережья может отражать стабильные условия в течение длительного периода времени (Fukuda, Channell, 1975).

Т. grandiflorum произрастает в районе Больших озер Северной Америки, распространяется в сторону гор Аппалачи. С помощью холодового бэндинга было исследовано 25 популяций. По паттернам CSR-сегментов было выявлено 7 типов хромосомы А, 8 типов для хромосомы В, 9 - для С, 35 - для D, 11 - для Е. Паттерны CSR-сегментов хромосом А-Е имели небольшие различия как внутри популяций, так и между ними, за исключением хромосомы D, которая оказалась наиболее вариабельной. В этом отличие этого вида от Т. camschatcense и Т. ovatmum, у которых наиболее вариабельные хромосомы А и С соответственно. Более гомогенные по паттерну CSR-сегментов популяции произрастают на севере ареала этого вида. В 4 из 25 популяций были обнаружены добавочные хромосомы. Предполагается, что предковые формы Т. grandiflorum произрастали в плейоцене и плейстоцене в кленовых и дубовых лесах и в настоящее время среда обитания этого вида не изменилась. В процессе естественного отбора популяции с гомогенными хромосомными CSR-паттернами обособились в районе Больших озер, где климатические услвия более мягкие и постоянные. Популяции с гетерогенными хромосомными CSR-паттернами произрастают в горах с изменчивыми климатическими условиями (Fukuda, Grant, 1980).

Т. sessile L., как и Т. ovaium, произрастает на западе США практически во всех тихоокеанских штатах. CSR-бэндинг показал характерный для этого рода полиморфизм Холодовых сегментов как внутри-, так и между популяциями. Степень вариабельности уменьшается от юга к северу. Полная фиксация кариотипов происходит на северной границе ареала этого вида (Kurabayashi, 1963).

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что гетерогенность CSR-паттернов отражает хромосомные перестройки, происходящие в популяциях. Эти перестройки, в свою очередь, отражают микроэволюционные процессы, происходящие в популяциях, как результат приспособления вида к изменчивым условиям окружающей

РОССИЙСКАЯ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА

среды.

Fukuda в 2001 году (Fukuda, 2001а) исследуя популяции еще одного североамериканского вида Т. mdulatum Willdenow, использовал другую формулу коэффициента инбридинга:

F=(H-Ho)/H, гдеН-1-Еріі²,

в которой Н - наблюдаемая доля гетерозиготных пар хромосом, Но - наблюдаемая доля гомозиготных пар хромосом, РІ - частота хромосомного паттерна І. Согласно этой формуле, американские виды Т. grandijlomm (f=0,3511), Т. erectum (f=0,5007), Т. recurvatum Beck (f=0,4237), Tovatum (14),2913), T undulatum (f=0,2727) более гомогенны по паттернам CSR-сегментов, чем восточноазиатский вид Т. camschatcense (Fukuda 1969, 1970, 1988,

1989).

Хромосомный анализ Т. undulatum выявил 7 CSR-паттернов хромосомы А, 8-хромосомы В, 8 - хромосомы С, 8 - хромосомы D, 11 - хромосомы Е, т. е. популяции Т. undulatum также характеризуются изменчивостью хромосомной CSR-исчерченности. CSR-паттерн этого вида похож на CSR-паттерн гималайского вида Т. govanianum Wallich ex Royle (Fukuda, 2001a). Хромосомы типа А этих видов имеют один гетерохроматиновый сегмент на одном из плеч. Хромосомы С и D этих видов также похожи по рисунку CSR-сегментов. В случае хромосом В и Е есть некоторые особенности: хромосомы В и Е Т. govanianum есть результат перестройки хромосом В и Е Т. undulatum. Из этого видно, что вышеупомянутые виды имеют общий геном, который был обозначен как G. Такие данные ставят интересную проблему об эволюционных направлениях внутри рода Trullium: каким образом виды, столь разобщенные географически и разной плоидности сохраняют сходный тип паттерна. Ответ, по мнению автора, следует искать в палеонтологических данных. В меловом периоде в Северном полушарии был теплый и влажный климат. В Третичный период флора Центральной и Южной Азии и Северной Америки распространилась в виде некоего широкого пояса от одного континента к другому через Тихий океан (которого тогда не было). В Верхнем Меловом периоде возникли многие однодольные растения, которые получили развитие в Третичный период. Ныне существующие виды Триллиумов произрастали совместно с широколиственными и некоторыми хвойными деревьями. Считают, что диплоидный предок Т. undulatum мог мигрировать из Северной Америки в Центральную Азию совместно с широколиственными деревьями в Третичный период. Этот диплоидный предок имел общий с Т. govanianum G-геном. Впоследствии во время оледенения в Четвертичный период могла произойти полиплоидизация восточноазиатских видов, как результат приспособления к изменившимся условиям, ставшим более суровыми

в Азии, чем в Северной Америке (Fukuda, 2001а, б).

Интересными оказались результаты изучения CSR-бэндинга у тетраплоида (2п=20) Т. govanianum который произрастает в Гималаях. И. Фукуда показал, что паттерны CSR-сегментов стабильны и практически не наблюдается полиморфизма среди изученных растений. Каждый тип хромосом А-Е состоит из двух гомологичных пар, каждая гомологичная пара имеет свой паттерн CSR-сегментов. Это указывает на то, что Т. govanianum является аллотетраплоидом, состоящим из двух геномов. Детальный анализ бэндинга хромосом показал, что один геном (G-геном) происходит от группы Trillium (по паттернам CSR-сегментов похож на геном Т. tschonoski'i), а другой (D-геном) происходит от группы Daiswa (паттерн CSR-сегментов похож на паттерн CSR-сегментов генома Daiswa polyphylla). На этом основании был сделан вывод о межродовом гибридном происхождении Т. govanianum (Fukuda, 20016).

В обзоре М. Охары (Ohara, 1989) сравнительному изучению подверглись 27 видов рода Trillium, произрастающих в Японии и на востоке Северной Америки. Они показали значительные различия по некоторым характеристикам жизненного цикла (структура популяции, репродуктивные характеристики: репродуктивное распределение, число яйцеклеток, репродуктивную производительность, размер побегов и т. д.). Также значительные различия наблюдались между видами подродов Phyllantherum и Trillium. Виды подрода Trillium показывают большую индивидуальную биомассу (в граммах), больший репродуктивный выход, меньше энергии вкладывают в единственный побег (Ra) и у них более мелкие семена. Сидячецветковые виды характеризуются меньшей индивидуальной биомассой, меньшей производительностью, высоким Ra и крупными семенами. Результат анализа главных репродуктивных характеристик показал, что морфологическая и географическая дифференциация рода Триллиум тесно коррелирует со способом дифференциации в жизненном цикле и демографическими параметрами.

2.7. Использование С- и Q- методов дифференциального окрашивания в

кариосистематике сем. Trilliaceae.

2.1 Л. Полиморфизм С- и Q- сегментов у видов рода Trillium.

Как уже было изложено, применение любого из методов дифференциального окрашивания дает достоверную информацию о разнородности кариотипов и может использоваться для целей систематики таксонов. Представляется интересным сравнить результаты, полученные разными способами окрашивания. В предыдущей главе было сказано о высокой степени полиморфизма CSR-сегментов, выявляемой у рода Trillium,

особенно у Т. camschatcense, что является свидетельством перекрестного опыления и распространяющихся хромосомных перестройках у этого вида. К сожалению, в литературе мало данных о кариосистематике видов рода Trillium, проведенной при помощи других методов окрашивания. Японские исследователи, которые внесли весомый вклад в развитие систематики Trilliaceae, а в особенности рода Trillium, оперировали преимущественно методом CSR-окрашивания.

С помощью С-бэндинга были изучены популяции Т. camschatcense, произрастающие на территории российского Дальнего Востока (Гриф и др., 1985). Результаты окрашивания показали четкие различия по С-паттернам между 4-мя популяциями: п-ов Камчатка, Хабаровский край, о. Сахалин, о. Кунашир. Но наибольшие различия, а также различия по морфологии цветка были отмечены между популяциями камчатско-хабаровской и сахалинско-кунаширской. По мнению автора, такие различия давали основание выделить сахалинско-кунаширские популяции в отдельный вид, но дальнейшего развития эта работа не получила.

Применение флуорохромного бэндинга (Н33258) по отношению к Т. camschatcense из популяций Камчатки показало широкую вариабельность гетерохроматиновых сегментов не только на внутрипопуляционном уровне, но и на внутриорганизмеином. А.А. Беляев, Е. О. Пунина, В. Г. Гриф (Belyayev et al., 1995) разделили гетерохроматиновые сегменты на «основные» и «дополнительные». Было выявлено по 2 основных типа Н-паттернов (Hoechst-pattern) у хромосом А, В, D и по одному основному типу у С и Е хромосом. Однако в пределах каждого растения были обнаружены хромосомы с Н-паттернами, отличными от основных типов, которые могли быть результатом соматических хромосомных аббераций (инверсий, делеций, дупликаций), возникающих de novo в организме. Эти паттерны были названы "дополнительными" и выявились в количестве: 5 -у хромосомы А, 2 - у хромосом В, С, 4 - у хромосом D и Е. Интересно отметить, что эти перестройки затрагивают малую часть хромосомных плеч, не меняя центромерного индекса и длины хромосомы. По количеству типов Н-паттернов хромосома А наиболее вариабельная, хромосома С наиболее стабильная, что согласуется с результатами японских цитологов по CSR-паттернам (Fukuda, 1969, 1973). Если предположить, что соматические мутации могут возникать в генеративных тканях и передаваться следующим поколениям, то внутри популяций возникает некая совокупность особей, обладающая определенной хромосомной перестройкой и этот феномен, вероятно, играет роль в высоком полиморфизме паттернов Н-сегментов. Несомненно, что хромосомные мутации и, как следствие, высокий полиморфизм Н-сегментов могут быть одним из важных факторов микроэволюционных процессов у Т. camschatcense (Belyayev et al., 1995). Сопоставление Q-

и С-паттернов у Т. camschatcense показало, что гетерохроматиновые блоки, выявляемые методом С-окрашивания совпадают по локализации с Н(<3)-сегментами (Belyayev et al., 1995).

2.7.2. Полиморфизм С-сегментов у видов рода Paris.

По сравнению с Триллиумами литературных данных о полиморфизме CSR-сегментов у растений рода Paris не так и много. В основном его изучали с помощью методов рутинного окрашивания и С-окрашивания.

Дж. Миамото с соавторами с помощью С-окрашивания изучил кариотипы 18 таксонов рода Paris, произрастающих в Китае и Японии (Miyamoto et al., 1992). Каждый вид демонстрировал единственный и неповторимый С-паттерн, обнаружить различия между упомянутыми в главе 2.4 "тропическими" и "умеренными" кариотипами не представлялось возможным. Авторам удалось выявить несколько типов паттернов, специфичных для P. tetraphylla A. Gray и для P. verticillata Bieb. В комплексе P. polyphylla Smith (который А.Л. Тахтаджян в 1983 году выделил в отдельный род Daiswa (Merrill) Takht.) наблюдался полиморфизм по С-паттернам между внутривидовыми таксонами, хотя между некоторыми вариациями P. polyphylla на отдельных хромосомах наблюдался сходный бэндинг. Немногим ранее, в 1990 году Дж. Миамото и С. Курита (Miyamoto, Kurita, 1990), изучая С-бэндинг Paris tetraphylla (4 формы) из 38 популяций Японии, не выявил заметных различий между формами по распределению С-сегментов. Он с соавторами выделил у хромосомы А -3 типа С-паттерна, у хромосомы В, С, Е - 4 типа, у хромосомы D - 2 типа. В разных популяциях с разными климатическими и экологическими условиями наблюдался приоритет разных паттернов, что указывает на их адаптационное значение и разная частота гетероморфных по рисунку С-исчерченности пар хромосом. Но в основном хромосомы были гомоморфными. По мнению Дж. Миамото и С. Курита (Miyamoto, Kurita, 1990), такое состояние дел указывает на непостоянство систем размножения: в одних популяциях превалирует вегетативное размножение или самоопыление, в других - перекрестное опыление. Некоторое сходство по С-паттернам между 2 популяциями Paris tetraphylla о-ва Кюсю обнаружили А.Учино и Л. Вань (Uchino, Wang, 1997). Они объяснили это сходством климатических условий, включая время вегетации, и тем, что С-паттерны распределяются в популяциях сообразно адаптационной способности организмов, и стало быть, в популяциях с одинаковыми климатическими условиями С-паттерны будут похожи.

Общим итогом вышеприведенных работ является вывод о полиморфизме С-сегментов не только между видами, но и на внутривидовом уровне.

Здесь уместно привести данные о кариотипе рода Kinugasa Tatewaki and Suto. M. Татеваки и Т. Сато в 1935 году выделили из рода Paris отдельный монотипный род Kinugasa (К. japonica), единственный представитель которого обладает морфологическими признаками, промежуточными по значениям между типичными Paris и Trillium (Tatewaki, Suto, 1935). Японские и китайские исследователи оставляют его в границах рода Paris как вид P.japonica (Miyamoto et al., 1992). Октоплоидный кариотип (2п=8х=40) этого вида соответствует типичному кариотипу рода Paris, на это указывают в том числе акроцентрические хромосомы, которые несут спутники на коротких плечах. В отличие от хромосом растений рода Trillium хромосомы растений Kinugasa japonica (речь идет о средних и малых метацентриках) не демонстрируют большие С- и CSR-сегменты на коротких плечах, но большой метацентрик по С- и CSR- паттерну похож на свой гомеолог Т. erectum. Субметацентрическая и акроцентрическая хромосомы Kinugasa japonica имели каждая свой С- и CSR-паттерн, которые были в некоторой степени похожи на паттерны субметацентрика и акроцентрика P. tetraphylla, P. vielnamense, P. polyphylla Smith var. yunnanensis (Franchet) Handel-Mazzetti, T. erectum, T. grandijlorum, T. camschatcense. Эти наблюдения подтверждают предположение о том, что Kinugasa japonica может иметь общего предка с видами p. Trillium и p. Paris (Miyamoto et al., 1992).

У P. quadrifolia, как показано К. Дарлингтоном (Darlington, 1941), гетерохроматин не выявляется после длительной холодовой предобработки хромосом. По-видимому, зоны деконденсации гетерохроматина (CSR- сегменты) настолько малы, что их невозможно заметить на фоне конденсированного эухроматина. Косвенным доказательством этого служат данные А. А. Козловой (Козлова, 1974, 1980; Козлова и др., 1976а, б), которая проводила С-окрашивание на хромосомах P. quadrifolia из 22 западно-сибирских популяций (Томская, Кемеровская, Горно-Алтайская, Восточно-Казахстанская области). По ее данным, среди растений P. quadrifolia в популяциях Западной Сибири можно выявить 4 полиплоидные расы: Зх=15, 4х=20, 5х=25, 6х=30, причем наиболее распространены триплоиды. У этого растения (триплоидные и тетраплоидные расы) при С-окрашивании наблюдаются в основном мелкие точечные блоки гетерохроматина с разной степенью выраженности в разных группах хромосом. Стабильные более крупные С-блоки расположены в районе центромеры, они, по-видимому, выполняют защитную функцию в эволюции. На постоянные точечные центромерные и теломерные С-блоки гетерохроматина указывают и Дж. Миамото с С. Курита (Miyamoto, Kurita, 1990) у P. tetraphylla. Хромосомы А и Д типов обнаруживают достаточную меж- и внутрипопуляционную стабильность по количеству и распределению С- блоков, в то время как гомеологи группы С чрезвычайно вариабельны. В целом же триплоидная и тетраплоидная расы имели сходное расположение

гетерохроматиновых районов.

2.7.3. Полиморфизм гетерохроматиновых сегментов, выявляемых различными методами дифференциального окрашивания, у видов Daiswa Raf.

Первые исследования по дифференциальному окрашиванию хромосом у представителей рода Daiswa (напомним, что этот род был выделен в отдельный таксон А. Л. Тахтаджяном в 1983 году (Takhtajan, 1983), ранее он назывался Paris polyphylla Smith) были осуществлены К.Дарлингтоном и Л. Ла Куром в 1938 году (Darlington, La Cour, 1938). Но в этой работе хромосомы растений послужили скорее объектом для отработки и усовершенствования методов.

Различные дифференциальные окрашивания (С- и Q-) кариотипов рода Daiswa проводили Г. Филион и Г. Воза (Filion, Vosa, 1980), М. Смит и Р. Ингрэм (Smith, Ingram, 1986), а также китайские и японские цитологи (Miyamoto et al., 1992).

М. Смит и Р. Ингрэм при помощи С-бэндинга показали, что 1) у 5 видов (D. thibetica, D. yunnanensis, D. chinensis, D. pubescens, D. violaceae Levi.) по крайней мере одна пара гомологичных хромосом гетероморфна по С-паттерну, 2) наблюдается полиморфизм по С- паттернам между внутривидовыми таксонами и стабильность выявления прицентромерных С-блоков, 3) у D. yunnanensis и D. pubescens наблюдаются добавочные хромосомы. Отмечено также отсутствие дистальных С-блоков, хотя при Q-бэндировании или при бэндировании с кислотной предобработкой дистальные гетерохроматиновые блоки выявляются (Darlington, La Cour, 1938; Fillion, Vosa, 1980). Дистальный гетерохроматин при С-окрашивании наблюдается только в районе ядрышковых организаторов (теломер короткого плеча С-пары хромосом) и иногда на коротком плече одной из акроцентрических пар хромосом (Smith, Ingram, 1986).

Данные Дж. Миамото с соавторами послужили подтверждением некоторых выводов М. Смита и Р. Ингрэма. Как уже упоминалось в предыдущей главе, они исследовали 18 таксонов рода Paris при помощи С-окрашивания и в пределах этого рода наблюдали полиморфизм по С-паттернам. Все виды рода Daiswa также демонстрировали каждый свой С-бэндинг, хотя между некоторыми видами на отдельных хромосомах наблюдались сходные паттерны. В отличие от предыдущих авторов, японские цитологи обнаружили прителомерные С-блоки гетерохроматина у D. yunnanensis на одном из плечей всех трех пар метацентрических хромосом (Miyamoto et al., 1992).

Сопоставление данных С- и Q-окрашивания (окрашивания акрихинипритом) кариотипов представителей рода Daiswa по данным М. Смита и Р. Ингрэма показало, что

прицентромерные С-блоки на акроцентрических хромосомах соответствуют тем сайтам, где происходит затухание флуоресценции, а на добавочных хромосомах с большими С-блоками было заметно ее усиление. Такое противоречие было объяснено разными качественными характеристиками ДНК гетерохроматиновых сегментов акроцентрических и добавочных хромосом (Smith, Ingram, 1986).

2.8. Молекулярная систематика сем. Trilliaceae.

С развитием современных методов науки стало возможным строить систематические и филогенетические отношения между таксонами на принципиально новом уровне: не только на основе морфологических признаков, но и на основе цитологических и молекулярных признаков. В качестве молекулярных признаков использовали последовательности rbcL-генов (Kazempour Osaloo, Kawano, 1999), matK-генов (Kazempour Osaloo, Kawano, 1999; Kazempour Osaloo et al., 1999), а также последовательности ITS районов 18-26S рРНК-генов (Farmer, Schilling, 2002). На основании изучения этих последовательностей с помощью математических методов можно строить филогенетические деревья. В 1999 году С. Каземпур-Осалоо и С. Кавано были построены филогенетические деревья на основе результатов анализа последовательностей rbcL и matK-генов, а также ITS-последовательностей, раскрывающие взаимосвязи внутри семейства Trilliaceae (Kazempour Osaloo, Kawano, 1999). Так как rbcL-ген эволюционирует медленнее, чем matK-ген и ITS, то дерево, построенное на основании исследования последовательности rbcL-гена имеет меньшее разрешение, чем другие. Деревья, построенные на основании изучения последовательностей matK-генов и ITS, по своей топологии в общем совпадали (были конгруэнтны). Молекулярные данные показали, что Paris s. s., Kinugasa, Daiswa формируют отдельные группы со слабой поддержкой (bootstrap=60-69), что говорит в пользу выделения этих таксонов в самостоятельные роды. Внутри клады Paris s. s. два вида - P. tetraphylla и P. incompleta представляют собой родственные виды (bootstrap=89-99), хотя оба эндемичны, ареал первого ограничен Японией, а второй произрастает на Кавказе и северо-Востоке Турции. Родство их косвенно подтверждается морфологией: несмотря на их географическую разобщенность, они обладают некоторыми сходными морфологическими признаками (отсутствие лепестков и свободная часть связника над пыльником, совместно с P. quadrifolia их D-хромосомы с субтерм и нал ыюй центромерой имеют спутник) (Kazempour Osaloo, Kawano, 1999). Другой неожиданностью молекулярного анализа С. Каземпур-Осалоо и С. Кавано было выявление тесного родства между Kinugasa japonica и видами Daiswa (bootstrap=89).

Наиболее результативными оказываются исследования систематики и филогении растений, когда применяется не одна категория признаков, а целый их комплекс.

В 2002 году С. Фармер и Э. Шиллинг использовали комбинированный анализ последовательностей ITS и matK генов совместно с анализом ПО морфологических признаков для определения филогенетических отношений между таксонами внутри Trilliaceae (Farmer, Schilling, 2002). Для кладистического анализа было отобрано 70 видов семейства Trilliaceae. Результаты показали, что семейство Trilliaceae как по морфологическим признакам, так и по молекулярным делится на 2 рода: Paris sensu lato и Trillium. Paris sensu lato представляет монофилетическую ветвь. Он четко отличается от Trillium синапоморфией таких признаков, как более узкие листья, нитевидные лепестки, моносулькатное, эллиптической формы пыльцевое зерно. Молекулярный кладистический анализ подтверждает правомочность разделения Paris s. 1. на 2 сестринские клады: Paris sensu stricto и Kinugasa+Daiswa. Эти таксоны монофилетичны и различаются между собой в молекулярном отношении 3-мя инделями и 2-мя заменами пар оснований в последовательностях ITS и 2-мя заменами в последовательностях matK-гена. Клада Kinugasa+Daiswa также представляет собой монофилетическую ветвь, это подтверждается молекулярным и комбинированным анализом, но противоречит морфологической классификации, т. к. по морфологии некоторых признаков Kinugasa ближе к Paris s. s., чем к Daiswa. Тем не менее данные анализа последовательностей ITS и matK-генов подтверждают тесное родство между Kinugasa и Daiswa. Daiswa также представляет собой монофилетичную сестринскую группу по отношению к Paris s.s. Три этих таксона на основании молекулярных данных были включены в состав Paris s.I., что противоречит морфологической классификации, предложенной А.Л. Тахтаджяном.

Результаты молекулярных анализов, также как и морфологические данные полностью подтверждают монофилию рода Trillium. Разделение его на подроды происходит не совсем четко, как разделение Paris sensu lato.. Как уже было изложено, род Trillium делится на подроды Phyllantherum и Trillium. Trillium subg. Phyllantherum по результатам кладистического анализа хорошо определяется как монофилетическая ветвь, тогда как Trillium subg. Trillium обычно формирует парафилетическую группу. Trillium subg. Phyllantherum, кроме сидячих цветков, без цветоножки, имеет ряд апоморфных признаков: поперечное или вертикальное положение лепестков, цвет тычиночной нити, цвет завязи, которые помогают легко идентифицировать эту группу (Farmer, Schilling, 2002). По результатам анализа последовательности matK-гена хлоропластной ДНК, проведенного С. Каземпур-Осалоо с соавторами в 1999 году, Trillium subg. Trillium состоит из трех различных групп: 1) группа Erectum, 2) группа Grandijlorum, 3) группа Pusillum. Такое

Систематика сем. Trilliaceae Cheval

Семейство Trilliaceae Cheval. представляет собой реликтовое семейство однодольных растений, выделено и номенклатурно узаконено Е. Шевалье в 1827 году (Chevallier, 1827). До него систематик de Jusseau, так же как и его современники и последующие поколения систематиков располагали Триллиевые в составе семейств Liliaceae (de Jusseau, 1789; Watson, 1879; Bentham, Hooker, 1883; Engler, 1888; Torre, Harms, 1908), Paridaceae (Dumortier, 1829). Smilacaceae (Endlicher, 1836-1840), не выделяя их в отдельное семейство. Первый ученый, принявший точку зрения Шевалье, был Дж. Линдли (Lindley, 1842). Впоследствии в 1926 году Дж. Хатчинсон также рассматривал Trilliaceae, как отдельное семейство (Hutchinson, 1926). На протяжении длительных исследований местоположение Триллиевых в систематике растений менялось неоднократно. Одни систематики включали представителей Триллиевых в состав сем. Liliaceae Juss. (Комаров, 1935; Freeman, 1975; Wang, Tang, 1978; Цвелев, 1979). Другие рассматривали Trilliaceae как отдельное семейство, входящее в порядок Liliales (Hutchinson, 1973; Thorne, 1983, 1992) или Stemonales (Huber, 1969; Dahlgren, 1975) или Smilacales (Takhtajan, 1980; Тахтаджян, 1982) или Dioscoreales (Dalhgren et al.,1985; Тахтаджян, 1987). В последнее время разными систематиками на основе данных по структуре семян признается правомочность выделения сем. Trilliaceae в отдельный монотипный порядок Trilliales (впервые предложено Н. Хабером (Huber, 1969), поддержано А.Л. Тахтаджяном (Takhtajan, 1997) и Г.Г. Оганезовой (2000)).

Систематические отношения между таксонами внутри семейства также вызывали много вопросов. Изначально согласно большей части классификаций, основанных на строении цветка, семейство Trilliaceae включало в себя 2 рода: род Trillium L., имеющий трехлепестковый цветок, и род Paris L., цветки которого имеют от 4 до 11 лепестков. Род Trillium, самый большой в семействе (насчитывает приблизительно 41 вид), включает в себя 2 подрода: 1) подрод Trillium -. представлен видами с цветком на цветоножке ("pedicellate - flowered"), делится в свою очередь на 2 группы видов: виды с прямой цветоножкой ("erect") и виды с наклоненной цветоножкой ("declinate"); и 2) подрод Phyllantherum Raf., представлен сидячецветковыми видами, без цветоножки ("sessile-flowered"). Род Trillium имеет два очага распространения: Восточная Азия (от Западных Гималаев до Камчатки и Японии), где насчитывается 5 видов и предположительно 3 межвидовых гибрида из подрода Trillium - и Северная Америка, где произрастают 36 видов из обоих подродов (Freeman, 1969; Samejima, Samejima, 1987, 1991).

Род Paris sensu lato представлял собой единый большой таксон, объем которого долго не был четко определен. X. Хара (Нага, 1969) разделял род Paris sensu lato на 3 секции: Paris, Kinugasa, Euthyra. X. Ли (Li, 1984, 1986) Paris sensu lato разделил на 2 подрода: подрод Paris с тремя секциями {Paris, Kinugasa, Axiparis) и подрод Daiswa с 4-мя секциями (Daiswa, Dunniana, Marmorata, Fargesiana). А.Л. Тахтаджян (1982; Takhtajan, 1983) разделил род Paris sensu lato на три самостоятельных рода: Paris L. sensu stricto (6 видов), Kinugasa Tatewaki et Sato (1 вид), Daiswa Raf. (15 видов). M. Тамура в своей классификации семейства Trilliaceae поддержал классификацию А. Л. Тахтаджяна (Tamura, 1998). Род Paris sensu stricto является евроазиатским видом, распространен в Средиземноморье, Европе, на Кавказе, в Сибири и Восточной Азии (включая Дальний Восток России) (Тахтаджян, 1982).

Род Daiswa Raf. (насчитывает около 15 видов (Тахтаджян, 1982; Takhtajan, 1983)) как отдельный род был впервые предложен Ц. Рафинеском (Rafinesque, 1838, цит. по Takhtajan, 1983). До него Даисву рассматривали как секцию, объединяющую различные вариации высокополиморфного Paris polyphylla Smith и близких к нему видов. Однако предложение Рафинеска осталось незамеченным другими ботаниками. А.Р. Франшет в своей монографии о роде Paris не упомянул о роде Daiswa, но отметил ее синонимом Euthyra (A. R. Franchet, 1888, цит. по Takhtajan, 1983). Род Daiswa не был упомянут ни X. Хара (Нага, 1969), ни Ф. Ванем и Ц. Танем в их монографии о роде Paris в Китае (Wang, Tang, 1978). А.Л. Тахтаджян по ряду морфологических признаков семян и плодов признал как отдельный род Daiswa Raf., который ранее обозначался как комплекс P. polyphylla Smith (Takhtajan, 1983). Однако X. Ли вскоре вновь рассматривал Daiswa в пределах рода Paris sensu lato (Li, 1988). Виды рода Daiswa распространены в умеренной зоне Гималаев, в северо-восточной Индии, северной Бирме, в Китае, Вьетнаме (Тахтаджян, 1982).

Род Kinugasa Tatew.& Sato представляет собой монотипный род с единственным видом Kinugasa japonica (Franch. et Sav.) Tatewaki et Suto, который встречается в горных буковых и хвойных лесах северных и центральных районов о-ва Хонсю (Япония) на высоте 1000-2100 м над уровнем моря (Тахтаджян, 1982). Ранее этот вид определяли как Paris japonica Franch., но в 1935 году М. Татеваки и Т. Сато выделили его в отдельный род, так как его морфологические характеристики отличаются от морфологических характеристик типичных представителей Paris и Trillium. (Tatewaki, Suto, 1935).

Начиная исследования, изложенные в данной работе, мы взяли за основу классификацию А.Л. Тахтаджяна (1982; Takhtajan, 1983), подразумевая в составе сем. Trilliaceae 4 рода: Trillium L., Paris L. s. s., Daiswa Raf., Kinugasa Tatew.& Sato. В последнее время ряд исследователей (Kasempour Osaloo, Kawano, 1999; Kasempour Osaloo et al., 1999; Farmer, Schilling, 2002), основываясь на данных молекулярной систематики в совокупности с морфологическими данными, вновь пересмотрели внутрисемейственные отношения Триллиевых, о чем будет сказано ниже.

Морфологические характеристики Trillium rhombifolium Кот

Корневища плотные, короткие. Стебли прямые, гладкие, 14,0 - 44,0 см дл., светло-зеленые. Листья сидячие, широко-ромбические, верхушки заостренные, основания клинообразные, 6,0 - 17,2 см дл., 4,2 - 18,2 см шир., основных жилок 5. Цветоножка прямая, 1,5 - 9, 0 см дл. Чашелистики ланцетовидные, заостренные, бледно-зеленые, 15-39 мм дл., 6 - 18 мм шир. Лепестки от ланцетовидных до яйцевидно-ланцетовидных, острые или заостренные, 15-55 мм дл., длиннее, чем чашелистики, 6 - 28 мм шир., красновато-пурпурные или темно-пурпурные, розовые, кремовые, белые. Тычинки 5 - 16 мм дл., равные или превышающие длину пестика, тычиночные нити 2 - 6 мм дл., кремово-белые или розовые, пыльцевые мешки от бледно-желтых до серовато-пурпурных, 3 - 12 мм дл., длиннее, чем тычиночные нити. Пестик 7 - 15 мм дл., завязь шаровидная, яйцевидная, 4 -10 мм дл., 4 -10 мм шир., темно-пурпурная, 3-гнездная, рыльце 3-долевое, доли загнуты, темно-пурпурная, 2 - 7 мм дл. Плоды яйцевидные, 12-16 мм дл., 10-15 мм шир., темно-пурпурные.

Распространение. Горные склоны лиственных, смешанных, хвойных лесов на востоке США. Примечание. В пределах этого вида выделяют 2 разновидности: 1) var. erectum форма luteum Louis-Marie, 2) var. album (Michaux) Pursh. 2.3.6. Морфологические характеристики Trillium recurvatum Beck. (Samejima, Samejima, 1987).

Корневища тонкие. Стебли прямые, гладкие, 14,0 - 50,0 см дл. Листья от ланцетовидных до широко-овальных или эллиптических 5,0 - 18,0 см дл., 2,4 - 7,2 см шир., неясно пятнистые, темнозеленые, верхушки острые или слабозаостренные, черешковые, дл. черешков 0,3 - 3 см. Чашелистики от ланцетовидных до овальных, 13 - 40 мм дл., 4 - 9 мм шир., верхушки острые, сильно загнутые в основании. Лепестки от ланцетовидных до овальных, 18-53 мм дл., 5 - 20 мм шир., прямые, верхушки от острых до тупоугольных, основания тонкие, от темно-пурпурных до чисто желтых. Тычинки 7 - 20 мм дл., превышающие длину пестика, сильно загнутые, тычиночные нити прямые, их длина составляет 1/3 или 1/2 длины тычинок, пыльцевые мешки интрорзные на связниках, 5-16 мм дл., связник удлиненный, вне пыльцевого мешка его длина составляет 0,5 — 2,0 мм в закругленном выступе. Пестик 4 - 12 мм дл., завязь от ромбовидной до яйцевидной, 2-8 мм дл., 3 -7 мм шир., 3-гнездная, рыльце расходящееся, концы загнуты, по длине оно примерно равно завязи. Плоды от яйцевидных до ромбовидных, с заметными крыльями.

Распространение. Лиственные леса на юго-восточном побережье США. Примечание. В пределах этого вида описано 5 форм : 1) f. recurvatum Freeman, 2) f. luteum С lute, 3) f. shayi Palmer et Steyermark, 4) f. petaloideum Steyermark, 5) Lfoliosum Steyermark.

Корневища плотные, короткие. Стебли прямые, гладкие, 5,0 - 41,0 см дл., светло-зеленые. Листья широкие, ромбическо-яйцевидные, верхушки острые или заостренные, основания клинообразные, сидячие или почти сидячие, 5,1 - 17,4 см дл., 2,0 - 15,5 см шир., основных жилок 5. Цветоножка прямая или несколько наклоненная, 1,5 - 11,5 см дл. Чашелистики ланцетовидные, верхушки острые или заостренные, бледно-зеленые, 18-68 мм дл., 4 - 29 мм шир. Лепестки длиннее чашелистиков, от ланцетовидных до яйцевидных, верхушки тупоугольные или заостренные, с волнистыми краями, 30 - 85 мм дл., 9 - 47 мм шир., от белых к розовым, часто позднее превращающиеся в розово-пурпурные. Тычинки 9 - 29 мм дл., превышающие длину пестика, тычиночные нити 2 — 13 мм дл., короче пыльников, белые, пыльцевые мешки желтые, 5 - 16 мм дл. Пестик 5 - 27 мм дл., завязь шаровидно- яйцевидная, 3 - 18 мм дл., 3 -9 мм шир., бледно-зеленая, 3-гнездная, рыльце тонкое, 3-долевое, прямое или распластанное, 2 - 19 мм дл. Плоды шаровидные, слабо выраженная трехгнездность, 12 -17 мм дл., 9 -14 мм шир., темно-пурпурные.

Распространение: Богатые сырые почвы, скалистые склоны лиственных лесов на юго-востоке США.

Корневища тонкие, длинные, горизонтальные, ежегодно нарастающие своей верхушкой. Стебель голый, 15-35 см высотой, листья собраны мутовками, большей частью в числе 4 на верхушке стебля, обратно-яйцевидные, на коротких черешках, на верхушке узкозаостренные 5-14 см дл., 2-8 см шир. с тремя ясными жилками. Околоцветник двурядный, состоящий из 4 наружных ланцетовидных зеленых листочков и 4 внутренних, 15-32 мм дл. Цветки одиночные, прямостоячие, расположенные на верхушке стебля. Пыльники линейные, длиннее тычиночных нитей, заканчиваются наверху остистым заострением, равным пыльнику - надсвязником. Столбики в числе 4, сросшихся у основания, короче тычинок, переходящие в загнутые рыльца. Плод-сизовато-черная многосемянная ягода.

FISH-гибридизация

Перед окраской флуорохромами препараты высушивали на воздухе при комнатной температуре не менее двух суток. Окрашивание препаратов хромосом флуорохромными красителями Hoechst 33258 (Serva) (Н33258) или DAPI (Serva) и хромомицином A3 (Serva) (СМА) и контрастирование препаратов контрастирующими агентами актиномицином Д (Reanal) (AMD) и дистамицином A (Serva) (DA) проводили, как описано у Швайцера и Амброса (Schweizer, 1976; Schweizer, Ambros, 1994) с незначительными модификациями.

Чтобы покрасить препараты хромосом АТ-специфичным флуорохромом Hoechst 33258 (Н33258) или DAPI, сперва препараты инкубировали в буфере №1 Зеренсена (рН=7,0) или буфере №1 Мак-Ильвейна (рН=7,0) 5 мин, потом инкубировали в растворе Н33258 (0,01мг/мл вышеназванного буфера) 5-7 мин в темноте, при комнатной температуре, в заключение инкубировали 5 мин в буфере №2 такого же состава. Высушивали препарат на воздухе в темноте.

Для контрастирования препаратов хромосом GC-специфичным агентом актиномицином Д (AMD) сам раствор AMD (0,3 мг/мл, растворен в 10 мМ Na-фосфатном буфере, содержащим 1мМ EDTA) наносили непосредственно на препарат в количестве 30 мкл, накрывали покровным стеклом, выдерживали в темноте 2-3 мин при комнатной температуре, после чего покровные стекла аккуратно смывали проточной водой и препарат высушивали на воздухе в темноте.

Чтобы покрасить препараты хромосом GC-специфичным флуорохромом хромомицином A3, сам раствор СМА в концентрации 0,5 мг/мл (раствор - смесь буфера Мак-Ильвейна, рН=7,0 и дистиллированной воды 1:1, содержащий 5мМ MgCb) наносили непосредственно на препарат в количестве 30 мкл под покровное стекло и выдерживали в темноте во влажной камере 2-2,5 часа при комнатной температуре, после чего смывали покровное стекло проточной водой и высушивали на воздухе в темноте.

Для контрастирования препаратов хромосом АТ-специфичным агентом дистамицином А раствор DA (0,1 мг/мл буфера Мак-Ильвейна, рН=7,0) наносили на препарат под покровное стекло по 30 мкл. Выдерживали в темноте 5-7 мин при комнатной температуре. Затем покровное стекло смывали проточной водой и препарат высушивали на воздухе в темноте.

Все окрашенные препараты заключали в смесь буфера Мак-Ильвейна (рН=4,2) с глицерином 1:1, в таком состоянии хранили их в темноте при комнатной температуре. Окрашенные флуорохромами препараты митотических хромосом исследовали с помощью флуоресцентных микроскопов "Opton" и LEICA DMRXA (центр «Хромас» БиНИИ СПбГУ), изображение фиксировали с помощью оптической или цифровой фотокамеры NIKON Coolpix 4500, а также вводили в компьютер при помощи телевизионной камеры Chip ER CCD Camera. Изображения с фотонегативов вводили в компьютер при помощи сканера.

Анализ изображений хромосом и построение цитологических карт осуществляли с помощью специализированной программы хромосомного анализа VideoTest-Kario 1.3 (Muravenko et al., 1998; Пунина и др., 1999).

Ag-NOR окрашивание препаратов хромосом проводили по методу Хауэлла и Блэка (Howell, Black, 1980). Под покровное стекло на препарат наносили 200 мкл смеси 2% раствора желатины и муравьиной кислоты (на 100 мл желатины - 1 мл кислоты) и 100 мкл 50% раствора нитрата серебра AgN03 на деионизированной воде. Инкубировали во влажной камере 15-20 мин при 37С, после чего удаляли покровное стекло и высушивали препараты на воздухе при комнатной температуре.

С-окрашивание препаратов хромосом проводили по методу Воза и Марчи (Vosa, Marchi, 1972) с незначительными модификациями. Сперва препараты обрабатывали свежеприготовленным насыщенным раствором Ва(ОН)г в течение 6 мин при температуре 60С. Затем споласкивали 15 сек в 0,2Н HCL при конатной температуре, промывали проточной водой и высушивали на воздухе. После этого препараты инкубировали в 2xSSC (рН=7,0) 1 час при 60С, затем промывали проточной водой 15 сек и высушивали на воздухе. Высушенные препараты окрашивали 2% красителем Гимза (Мегк) на фосфатном буфере Зеренсена с рН=6,8, контролируя степень окрашивания под микроскопом. После окрашивания препараты споласкивали дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре.

CSR-окрашивание проводили по общепринятому методу с некоторыми модификациями. Молодые корни помещали в воду, охлажденную до 0С на 72 часа. Затем фиксировали в 0,5% колхицине в течение 3 часов и помещали в фиксатор, состоящий из 3 частей спирта и 1 части ледяной уксусной кислоты. Потом материал окрашивали ацетокармином, а также по Фельгену (1 час гидролиза 5Н HCL) и приготовляли давленые препараты, которые сразу же просматривали. Для последующего окрашивания препаратов флуорохромами Н33258, DAPI, СМА с окрашенных ацетокармином препаратов при помощи жидкого азота снимали покровные стекла, и препараты высушивали при комнатной температуре в течение двух суток.

Окрашенные препараты заключали в синтетические нейтральные материалы, исследовали с помощью светового микроскопа NU (Carl Zeiss Jena), вводили в компьютер при помощи телевизионной камеры Chip ER CCD Camera. Изображения хромосом анализировали с помощью компьютерной программы хромосомного анализа VideoTest-Kario 1.3 (Muravenko et al., 1998; Пунина и др., 1999).

Анализ кариотипа Т. camschatcense

Кариотип Т. camschatcense (2п=10) по морфологическим параметрам (относительная длина и центромерный индекс хромосом) полностью соответствует базовому кариотипу, характерному для представителей сем. Trilliaceae (рис. 4.1).

Дифференциальное окрашивание хромосом этого вида АТ-специфичными флуорохромами Н33258 и DAPI выявляет многочисленные ярко флуоресцирующие сегменты гетерохроматина с разнообразной локализацией и размерами (рис. 4.2, а). Обращают на себя внимание особенно крупные прицентромерные блоки на длинных плечах хромосом А- и D-типов. В некоторых случаях такой же крупный прицентромерный блок отмечался и на С-хромосоме. При окрашивании тех же препаратов GC-специфичным флуорохромом СМА эти районы затухали, и выявлялось несколько мелких ярко флуоресцирующих блоков, расположенных преимущественно в теломерных районах хромосом (рис. 4.2, б). Расположение этих блоков соответствует расположению ядрышкообразующих локусов (NOR), выявленных нами при окраске хромосом Т. camschatcense азотнокислым серебром (рис. 4.3, б), (Мякошина и др., 2002). Интересно, что хромосома А-типа имеет 2 кластера NOR на обоих плечах. У Т. camschatcense при окрашивании ядра азотнокислым серебром выявляются 5-12 ядрышек (рис. 4.3, а), (Мякошина и др., 2002). Отметим, что миниатюрные спутники в районах NOR у изученных нами видов Trillium при монохромном окрашивании хромосом наблюдаются очень редко и нерегулярно. Характерная особенность дифференциальной исчерченности хромосом Trillium, связанная с их огромными размерами - наличие гетерохроматиновых блоков двух типов: широких, имеющих вид полосы и точковидных, размеры которых меньше диаметра хроматиды. Эти два типа блоков схематически отражены нами на рис. 4.4.

Контрастирование препаратов AMD и DA не выявило никаких дополнительных блоков на хромосомах Т. camschatcense.

Гетерохроматиновые районы хромосом Т. camschatcense ранее изучались неоднократно при помощи CSR-метода и С-метода дифференциального окрашивания (см. соответствующие главы Обзора литературы). Полученные нами результаты в целом согласуются с результатами других исследователей. Так, в частности, локализация крупных АТ-обогащенных блоков совпадает с локализацией CSR-сегментов, описанных ранее другими авторами (Беляев, Беляева, 1991; Belyayev etal., 1995).

Нами также был отмечен и полиморфизм хромосом по рисунку дифференциальной исчерченности, описанный ранее для других географических точек произрастания этого вида (Haga, Kurabayashi, 1953, 1954; Haga, 1956; Kurabayashi, 1957; Fukuda, Kozuka, 1958; Haga, 1969; Fukuda, 1973; Гриф и др., 1985; Belyayev et al., 1995). Поскольку в цели данной работы не входил количественный учет всех отмечаемых вариантов рисунка хромосомной исчерченности, мы построили обобщенную цитологическую карту хромосом этого вида, показав на ней наиболее типичные варианты расположения AT- и GC-обогащенных гетерохроматиновых сегментов (рис.4.4.

Дифференциальное окрашивание хромосом Т. tschonoskii (2п=20) АТ-специфичным флуорохромом Н33258 также выявило многочисленные ярко флуоресцирующие сегменты гетерохроматина с разнообразной локализацией (рис. 4.5 а). При окрашивании тех же препаратов GC-специфичным флуорохромом СМА эти районы затухали, и выявлялось несколько мелких ярко флуоресцирующих блоков, расположенных преимущественно в теломерных районах хромосом (рис. 4.5 б).

Некоторые сегменты ярко флуоресцировали при обоих способах окрашивания, что, вероятнее всего указывает на чередование коротких AT- и GC-обогащенных треков ДНК в таких гетерохроматиновых районах. Контрастирование препаратов AMD и DA не выявляет каких-либо дополнительных блоков на хромосомах Т. tschonoskii.

Локализация наиболее крупных АТ-обогащенных сегментов в основном совпадает с расположением CSR-бэндов, выявленных японскими исследователями (Haga, Kurabayashi, 1953; Haga, 1956; Uchino, 1985, 1985a). А. Учино был описан полиморфизм CSR-сегментов у обоих геномов Т. tschonoskii (Uchino, 1985, 1985а). При этом подчеркивалось, что гомологичные хромосомы одного растения всегда идентичны по паттернам CSR-сегментов в отличие от хромосом Т. camschatcense, что свидетельствует о высокой степени гомозиготности Т. tschonoskii вследствие преобладания самоопыления у этого вида. В нашем исследовании не было отмечено сколько-нибудь заметного полиморфизма гетерохроматиновых районов хромосом у Т. tschonoskii. Цитологическая карта хромосом Т. tschonoskii представлена на рис. 4.7.

Ядрышкообразующие районы (NOR) на этой схеме показаны в соответствии с результатами окрашивания хромосом азотнокислым серебром (рис.4.6, б) (Мякошина и др., 2002). Все эти районы демонстрируют яркую флуоресценцию при окрашивании СМА. У Т. tschonoskii при окрашивании ядер азотнокислым серебром выявляется 7-12 ядрышек (рис.4.6, а) (Мякошина и др., 2002).

Как уже было сказано выше, на о-ве Хоккайдо в смешанных популяциях Т. tschonoskii и Т. camschatcense встречаются растения с промежуточными морфологическими признаками и соматическим числом хромосом 2п=15. Анализ кариотипов этих растений с учетом распределения CSR-сегментов показал гибридогенную природу этих растений: 5 хромосом идентифицируются как принадлежащие геному Т. camschatcense, а 10 - как принадлежащие геномам Т. tschonoskii (Haga, Kurabayashi, 1953; Haga, 1956). Эти гибриды получили название Trillium х hagae Miyabe et Tatewaki (Miyabe, Tatewaki, 1936).

На о. Сахалин также в смешанных популяциях указанных видов присутствуют растения с промежуточными морфологическими признаками, у которых соматическое число хромосом 2n = 15. Нам удалось провести анализ кариотипа одного такого растения при помощи окрашивания хромосом АТ-специфичным флуорохромом Н33258 (рис.4.8,4.9).

В кариотипе хорошо идентифицируются 5 хромосом гаплоидного генома Т. camschatcense и 10 хромосом обоих геномов Т. tschonoskii. Это доказывает, что данное растение произошло в результате межвидовой гибридизации Т. tschonoskii х Т. camschatcense, следовательно, его можно идентифицировать как Т. х hagae. Обращает на себя внимание то, что хромосомы Т. camschatcense в цитоплазме гибрида несколько длиннее, чем хромосомы Т. tschonoskii. Локализация NOR на этом объекте нами не проводилась.

Похожие диссертации на Кариосистематическое изучение представителей семейства Trilliaceae Cheval

Палиноморфологические изучения армянских представителей семейства Scrophulariaceae A.L. de JussieuПогосова, Альбина Вартановна

КАРПОЛОГО СИСТЕМАТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРИБЫ TRIPOLIEAE ВГОNN. (FABAGEAE) ДАГЕСТАНАЭмиров, Сиражутдин Ахмедович

Кариосистематическое изучение кавказских представителей рода Tulipa L.Данелия, Ирина Мелитоновна

Сравнительно-анатомическое изучение коры представителей сем. Araliaceae Durande и близких таксоновКотина Екатерина Леонидовна

Изучение свойств белков семян представителей порядка Cycadales engl. и оценка их взаимоотношений с другими голосеменными и покрытосеменными на основе биохимических признаковЗолкин Сергей Юрьевич

Изучение эффекта стимуляции, индуцированного химическими мутагенами у представителей рода лохКозловский, Борис Леонидович

Сравнительное изучение морфологических признаков и активности ингибиторов трипсина у представителей рода Hedysarum L. Черникова Татьяна Сергеевна

Эмбриология некоторых представителей семейства Onagraceae Виэльунска-Войтась Ориэта

Сравнительная анатомия вегетативных органов представителей семейства Ambranthaceae Juss. Тимохин Александр Константинович

ВЛИЯНИЕ ПЛОЩАДЕЙ ПИТАНИЯ НА ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОРФОГЕНЕЗ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА СЕЛЬДЕРЕЙНЫХ (КОРИАНДРА, КЕРВЕЛЯ, УКРОПА И МОРКОВИ)Габдулинова, Камиля Гапбасовна