Содержание к диссертации
Введение
Глава ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Данные о поражении грибами плавательного пузыря лососевых рыб 7
1.2 Особенности биологии и культивирования лососевых рыб, способствующие попаданию грибов в плавательный пузырь ....... 10
Г..З Характеристика грибов - возбудителей микоза плавательного пузыря лососевых рыб . » II
Г..4 Меры борьбы с микозом плавательного пузыря 14
Глава 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 16
2-1 Выделение грибов из плавательного пузыря лососевых рыб 16
2-1-1 Определение зараженности рыб грибагли методом посева плавательных пузырей ... 19
2.2 Выделение грибов из воздуха, воды и обрастаний стенок рыбоводных емкостей 23
2.3 Получение чистых культур грибов, их: хранение; и применяемые питательные среды ... 2.4 Определение стабильности грибов и особенности развития штаммов p. herbarum в воде
2.5 Определение чувствительности обрастаний грибов на панелях к формальдегиду и гипо-хлориту натрия 29
2*6 Постановка биопроб ЗО
2.7 Гистологические методы 32
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 32
Глава 3 КУЛЪТУРАЛЬН04ЮИ0ЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ГРИБОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ'. МИКОЗА ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 32
3.1 ACREMONIUM КГЫЕТБЕ Grutz; Gams 33
3.2 TObTPOCLADIUM IUPLATUM W. Gams 35
3*3 AUTERNARIA COHSORTTAIE CThflem) Hughes ... 38
3.4 MFARirai AVEHACETJM (Pr.) Sacc. var HERBARUM ((Tarda) S^cc. . 38
3*5 VObUTET.LA SAIMOUIS, spec, nov 39
3*6 PYREHOCHAETA ACICOLA (Lev.) Sacc 43
3.7 ЖОМА HERBARUM Westend .-. 46
3.7*1 Стабильные и нестабильные штаммы P. herbarum и их морфологические варианты ... 3.7*2 Особенности роста P. herbarum в воде . . 64
Глава 4 ПАТОГЕННОСТЬ ГРИБОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ МИКОЗЕ ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ 66
4.1 Патогенность Acremonium kiliense, Tolypocla-dium inflatum, Alternaria consortiale, Fusa-rium avenaceum var. herbarum, Volutella salmonis, Pyrenochaeta acicola для МОЛОДИ радужной', форели 67
4*2 Патогенность phoma herbarum и вирулентность
его штаммов 68
4.3 Токсичность культуральной жидкости штаммов
Phoma herbarum 74
Глава 5 ЭПИЗООТОЛОГИЯ МИКОЗА ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 77
5.1. Эксперимент по изучению микоза плавательного пузыря радужной- форели 89
Глава 6 ПАТОГЕНЕЗ И КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ПРИ МИКОЗЕ ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ 109
6 Л Реактивность организма радужной форели при
микозе плавательного пузыря НО
Глава 7 МЕРЫ БОРЬБЫ С МИКОЗОМ ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 124
7.1 Чувствительность обрастаний грибов к форма
лину и гипохлориту натрия 125
7.2 Определение периодичности дезинфекций . . . 129
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 133
ВЫВОДЫ І4Г
ЛИТЕРАТУРА 143
- Данные о поражении грибами плавательного пузыря лососевых рыб
- Выделение грибов из плавательного пузыря лососевых рыб
- ACREMONIUM КГЫЕТБЕ Grutz; Gams
- Патогенность Acremonium kiliense, Tolypocla-dium inflatum, Alternaria consortiale, Fusa-rium avenaceum var. herbarum, Volutella salmonis, Pyrenochaeta acicola для МОЛОДИ радужной', форели
- Эксперимент по изучению микоза плавательного пузыря радужной- форели
Данные о поражении грибами плавательного пузыря лососевых рыб
В доступной; литературе мы нашли только 5 небольших работ, в которых отражены исследования по грибным поражениям плавательного пузыря рыб /107, 112, 119, 128, 129/. Заболевание не имело определенного названия. Первый исследователь, Вуд (wood, 1968) назвал его: "грибы плавательного пузыря". В других: работах название характеризует возбудителя болезни -" phoma herbarum, гриб сапрофит растений как возбудитель заболевания рыб" /119/, "Патология МИКОЗОВ рыб. Sphaeropsida-les. phoma herbarum" /128/. Японские исследователи в двух статьях: описывают результаты изучения вспышки заболевания -"висцерального микоза" /107, 112/.
Этиологическим агентом заболевания все авторы считали грибы из порядка сферопсидальных, а конкретно вид Phoma herbarum. Однако Хатаи и Эгуса (Hatai a. Egusa, 1977) при эпизоотии висцерального микоза на инкубационном заводе в Японии выделили из мальков радужной форели и родуруса гриб, у которого при культивировании на питательных средах не было плодоношения, что не позволило определить его точное таксономическое положение, и все-таки авторы склонны считать, что это p. herbarum или родственный ему гриб.
Случаи заболевания описаны только для лососевых рыб: кижуча. COncorhynchus kisutch) /119, 129/, чавычи CO. tschawyscha) /119/, родуруса (О. rhodurus f. macrostomus) Д07, 112/ И радужной: форели CSalmo gairdneri) /107, 112, 119, 128/.
По данным Росса, Ясутаке И Лика CRoss, Yasutake а. 1/эек, 1975), более всего была поражена чавыча весеннего нереста, а потери в рыбопитомнике по выращиванию кижуча составили 2,6$. Так как гриб поражает плавательный пузырь у рыб в воз -расте до 100 дней, то Вуд Сwood, 1968) пришел к заключению, что заражение происходит на стадии поднятия на плав, когда плавательный пузырь заполняется впервые.
Вуд CWood, 1968) И РОСС, Ясутаке И ІИК CRoss, Yasutake a. ieek, 1975) обнаруживали в плавательном пузыре некоторых рыб незначительно развитый мицелий и на основании этого предполагали-, что рыбы способны к. самоизлечению.
Экспериментальное заражение грибом p. herbarum исследователям удавалось при распылении конидий над поверхностью воды, к которой поднимались подопытные рыбы для заглатывания воздуха, а также при скармливании малькам форели корма с добавлением конидий гриба и битого стекла. Однако зараженность была низкой - 4% при распылении и 0,5 при скармливании /119/. На наш взгляд, авторы, неправильно применяя термин "зараженность", искажают представление о вирулентности примененного ими в эксперименте штамма. Зараженность - это количество рыб в процентаж, в которых: попал возбудитель болезни. Авторы ее не определяли, по-видимому, из-за отсутствия метода. Приведенные ими цифры обозначают заболеваемость, то есть количество рыб в процентах, у которых болезнь проявилась, а она может проявиться у всех зараженных рыб, — тогда используемый штамм можно считать высоковирулентным, - или же только у незначительного числа рыб, в которых данный возбудитель попал, - значит, штамм слабовирулентный.
Выделение грибов из плавательного пузыря лососевых рыб
Исследуемой рыбы, соблюдая правила асептики, вскрывали брюшную полость, захватывали глазным пинцетом воздушный канал у глотіси, отрывали его и извлекали плавательный пузырь. У здоровыхсрыб он заполнен газом, имеет тонкую прозрачную стенку. При наличии в полости плавательного пузыря каких-либо мелких частиц плавательный пузырь помещали на стерильное предметное стекло и прижимали стерильным покровным стеклом. Препарат рассматривали под микроскопом. При обнаружении мицелия гриба разрывали стерильными препаровальными иглами стенку плавательного пузыря, извлекали мицелий и инокулировали его на плотную питательную среду. При наличии в полости плавательного пузыря крупного инородного образования плавательный пузырь помещали в стерильную чашку Петри, отделяли от образования небольшой кусочек и исследовали под микроскопом. Если это были гифы, то от образования отделяли не менее 5 небольших: кусочков и помещали их: на поверхность агаризирован-ныж питательных сред в чашках Петри или пробирках. Посевы выдерживали при комнатной температуре и естественном освещении или в термостате при +24С в течение 20 дней.
Однако обнаружить споры гриба, что необходимо для определения зараженности рыб грибом сразу после заражения, данным методом и методом микроскопии практически невозможно ввиду малых размеров этих спор. А это очень важно, так как судить о патогенности, а тем более о вирулентности грибов, не зная, попали они в рыбу или нет, нельзя. Это также необходимо для изучения путей заражения рыб. Для решения этого вопроса мы разработали новый метод — метод посева плавательных пузырей, который принят во ВНййПРХ,е и признан рационализаторским.
ACREMONIUM КГЫЕТБЕ Grutz; Gams
Гифы гриба в плавательном пузыре рыб тонкие, бесцветные., с редкими септами, ветвящиеся, 1,0-2,0 мкм толщиной. При не значительном надавливании на препарат мицелия гриба, выделенного из плавательного пузыря, часть гиф распадалась на фрагменты.
Культуры на питательных средах развивались медленно и за 10 дней культивирования достигали 15-20 мм в диаметре. Колонии были белые, плоские, прядистые, слегка мокнущие, с радиальными бороздами. При старении они приобретали розоватый оттенок и на- иг поверхности появлялся белый клочковатый воздушный мицелий. При микроскопии культуры обнаруживали несен-тированные, неразветвленные, отходящие от гифы под прямым углом конидиеноспы длиной 25,0-45,0 (70,0) мкм и диаметром 1,5-2»5 мкм. Конидии в слизистых: головкаж, эллиптические до цилиндрических: с закругленными концами,размером 1,0-1,6 х 3 1-5,3 мкм. На овсяном агаре за 8 дней культивирования образовывались интеркалярные и терминальные хламидо споры шаро;-видной или эллиптической: формы с толстой оболочкой диаметром 4,0-8г0 мкм. - 35 -3-2. TOLYFOCLADIUM ПШАТШ W. Gams
Мицелий гриба в плавательном пузыре рыб был развит хорошо, имел белый и желтоватый, цвет. Гифы бесцветные, тонкие (1,,0-1,5 мкм), с редкими септами. Органы размножения не обнаружены..
При выделении гриб хорошо рос на различных питательных средах; (агар Чапека, картофельно-декстрозный, сердечно-мозговой и овсяной; агары, агар "Д"). Макро- и микроскопическое: строение колоний на эасшк средах было сходным. Колонии росли довольно; медленно, достигая на ГО-й. день 20-30 мм. Они были куполообразные, пушистые или (редко) плоские, мучнистые, белые, с обратной стороны иногда желтоватые (рис. 4). Запах отсутствовал. Гифы, погруженные в питательную среду, имели толщину 0,8-6,0 мкм (чаще Г,0-2,0), гладкостенные ; не редко тонкие гифы приобретали спиралевидную форму. Гифы воздушного мицелия также бесцветные, гладкостенные, диаметром Г,3-4„5 мкм (чаще Г„9-2,0 мкм). От них отходили конидиеносцы размером Г,,7-2,5 х 32,0-50,0 мкм. По всей длине конидиеносца располагались фиалиды в виде мутовок или одиночно. Однако чаще мутовки фиалид находились на утолщенных; боковых клетках конидиеносца. Этл клетки имели размер 2,5-3,0 х 4,5-5,0 мкм. Кони-диеносец; заканчивался фиалидой удлиненной формы. Фиалиды имели расширенное основание (3,0-3 5 х 2,8-3,0 мкм) и тонкую, часто изогнутую шейку (0,6-0,3 х 3,5-5,5 мкм). Конидии собраны в головки, одноклеточные бесцветные гладкие, почти круглые или эллиптические, размером Г„4-2,0 х 2,0-2,5 мкм (рис.5).
Патогенность Acremonium kiliense, Tolypocla-dium inflatum, Alternaria consortiale, Fusa-rium avenaceum var. herbarum, Volutella salmonis, Pyrenochaeta acicola для МОЛОДИ радужной', форели
Приготовление грибного материала для заражения. Все имеющиеся в нашей коллекции изоляты каждого вида грибов пересевали на картофельно-декстрозный агар и культивировали при +24С в течение 15 суток, а гриб pyrenochaeta acicola - 30 суток до обильного спороношения. Затем с полученных культур делали смывы стерильной водой. Смывы культур одного вида гриба смешивали и приготавливали взвесь конидий, содержащую I млн клеток на I мл.
Порядок проведения биопробы. Личинок радужной, форели, предназначенных для эксперимента, после выхода из икры содержали в аквариумах: с приспособлением, препятствующим их всплытию к: поверхности воды для заглатывания воздуха. После того, как все личинки устремились к поверхности воды, их быстро разделили на 7 групп по 100 штук и поместили в литровые емкости. В одной емкости содержалась вода, а в взвесь конидий испытуемых видов грибов. В течение 3 часов личинки во всех группах наполнили плавательные пузыри воздухом и стали свободно держаться в толще воды. После этого каждую группу перевели в отдельный аквариум с проточной водой и наблюдали в течение 30 дней. Всех погибших в опыте и контроле рыб вскрывали, устанавливали причину гибели. Обнаруженные в плавательных пузырях гифы грибов высевали на агар Чапека и выросшие колонии грибов идентифицировали.
Результаты би о про бы. Гибель рыб от микоза плавательного пузыря началась на Г2 сутки. Данные по заболеваемости рыб микозом и реизоляции от них культур испытуемых грибов: приведены в табл.. 7.
Таким образом, осуществлены еще два критерия Коха (воспроизведение заболевания и выделение при этом от больных рыб испытуемых-видов грибов), на основании которых определена патогєнность данных видов грибов и доказана их этиологическая роль при микоза плавательного пузыря.
Эксперимент по изучению микоза плавательного пузыря радужной- форели
С целью выяснения некоторых звеньев в эпизоотологической цепи микоза плавательного пузыря нами был поставлен эксперимент.
Порядок проведения э кс пе риме нт а Схема эксперимента дана на рис 22. Еа Г этапе инкубировали икру радужной форели в лотковом аппарате, изготовленном из древесины, покрытой краской. На П этапе личинок разделили на 3 группы по 7 тыс штук. Рыб группы В Г поместили в новый деревянный бассейн, который в течение 20 дней до опыта был заполнен водой. В такой же бассейн, но ранее использованный Г месяц для выращивания рыбы, поместили группу- J 2. Группу- № 3 оставили в инкубационном аппарате. Во всех: емкостях: была одинаковая проточность и единый, водоисточник. Рыб регулярно; кормили гранулированным кормом РГМ-6М. В эших емкостях форель встала на плав, и затем в течение 23 дней подращивалась. За этот период проводили следующие исследования::
I. Определяли количество зачатков Phoma herbarum а) в воздухе методом седиментации, для чего пробы брали в 3 пунктах: у поверхности воды каждой емкости, 5 пунктах на полуи 5 пунктах на высоте І„5 м в помещении, где находились емкости ; б) в воде методом высева ее на агаризированнуго среду Чапека, для чего брали: по 2 пробы на водоподаче и вытоке, а также 6 проб в самой, емкости (в 2 пунктах:, у поверхности, в толще воды, у7дна). При этом каждую пробу, в которой предполагалось большое количество зачатков грибов, высевали на 3 чашки Петри. Первое определение количества зачатков p. herbarum провели в день массового подъема личинок на плав, затем 3 раза с интервалом 3 дня и Г раз на 20-й день.
2. Определяли зараженность грибом p. herbarum молоди радужной форели - а) методом посева плавательных пузырей, для этого ежедневно в течение 10 дней, начиная со дня массового поднятия личинок на плав, а также на 23-й день после него исследовали по 50 рыб из каждой группы ; б) методом визуального обнаружения гиф грибов в полости плавательного пузыря, для чего на 23-й день из каждой емкости было вскрыто по 300 рыб, обнаруженные гифы грибов высевали на агаризированную среду Чапека, культивировали и идентифицировали.
3. Определяли локализацию гриба p. herbarum в емкостях методом микроскопии проб, взятых со стенок емкостей.
На Ш этапе эксперимента каждую группу рыб разделили на две равные подгруппы. По одной подгруппе из каждой группы разместили в равноценных отсеках емкости "А", не бывшей в употреблении. Другие подгруппы расположили аналогичным образом, но в отсеках емкости "Б", ранее использованной для выращивания рыбы. В таких условиях рыбу содержали в течение 30 дней и: проводили следующие наблюдения:
