Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологические и биохимические особенности представителей рода Ribes L (обзор литературы) 10
1.1. Интродукция представителей рода Ribes L. на юго-западе Центральночерноземной зоны 10
1.2. Сиситематическое положение рода Ribes L 14
1.3. Ботанические и экологические особенности представителей рода Ribes L 17
1.4. Некоторые биологически активные вещества плодов растений рода Ribes L 24
1.4.1. Содержание и значение Сахаров и сухих растворимых веществ 24
1.4.2. Синтез органических кислот и их биологическая роль 26
1.4.3. Особенности строения, биосинтеза антоцианов и их биологическая активность 31
1.4.4. Особенности строения, биосинтеза каротиноидов и их биологическая активность 37
1.4.5. Особенности строения, биосинтеза триглицеридов жирных кислот семян и их биологическая активность 41
1.5. Практические аспекты использования плодов смородины для промышленной переработки 45
Глава 2. Условия, материалы и методы проведения исследований 49
2.1. Физико-географические условия Белгородской области 49
2.2. Погодные условия в годы проведения исследований 52
2.3. Объекты исследований 54
2.4. Методы и методики исследований 56
Глава 3. Фенологические особенности видов рода Ribes L. при интродукции 67
3.1. Начало вегетации видов 70
3.2. Сроки цветения представителей рода Ribes L 77
3.3. Сроки созревания смородин 78
3.4. Листопад видов po%aRibes L 79
3.5. Феноритмика интродуцированных сортообразцов Ribes nigrum L 81
Глава 4. Биоморфологические и анатомические аспекты представителей Ribes L 85
4.1. Биологические основы продуктивности образцов Ribes nigrum L 85
4.2. Засухоустойчивость сортообразцов Ribes nigrum L. в условиях Белгородской области 90
4.3. Анатомо-биохимические особенности плодов растений рода Ribes L 93
Глава 5. Химический состав плодов растений рода Ribes L. при интродукции 100
5.1. Содержание сухих растворимых веществ и Сахаров 100
5.2. Органические кислоты плодов растений рода Ribes L 105
5.2.1. Качественный состав органических кислот 105
5.2.2. Количественные характеристики накопления кислот 106
5.2.3. Содержание аскорбиновой кислоты 109
5.3. Антоциановый комплекс плодов некоторых представителей рода Ribes L 114
5.3.1. Качественный состав антоцианового комплекса 114
5.3.2. Количественная характеристика содержания антоцианов в плодах представителей рода Ribes L 127
5.3.3. Динамика накопления антоцианов в плодах различных сортообразцов смородины черной 132
5.4. Качественное и количественное накопление каротиноидов 138
5.5. Качественный анализ триглицеридов жирных кислот семян 143
Глава 6. Практические аспекты использования плодов смородины черной для промышленной переработки 146
6.1. Сохранность аскорбиновой кислоты при хранении 146
6.2. Влияние различных условий хранения на сохранность антоцианового комплекса смородины черной 148
6.3. Использование антоцианов плодов черной смородины в качестве красителей для прохладительных напитков 153
Выводы 156
Список литературы 158
Приложения 186
- Ботанические и экологические особенности представителей рода Ribes L
- Начало вегетации видов
- Качественный состав антоцианового комплекса
- Использование антоцианов плодов черной смородины в качестве красителей для прохладительных напитков
Введение к работе
Актуальность исследования. Род Смородина (Ribes L., 1734) принадлежит к семейству Grossulariaceae, включает 150 видов (Цвелев, 1981; Черепанов, 1981, 1995; Тахтаджян, 1987; Brennan, 1997) и является одним из наиболее широко распространенных в мире. Смородина черная и красная относятся к ягодным культурам, пользующимся заслуженным спросом, так. как их плоды обладают диетическими и лечебно-профилактическими свойствами. Они содержат комплекс значимых биологически активных веществ (БАВ), таких как: витамины, микроэлементы, сахара и пектиновые вещества. Однако в настоящее время сортимент этих традиционных видов в Белгородской области требует обновления и расширения, также необходимо увеличение видового разнообразия. В последнее время смородины особенно привлекают внимание ученых в связи с высоким уровнем накопления в плодах антоциа-нов, значимость которых для лечения и профилактики заболеваний зрительного аппарата общепризнанна (Nakaishi, 2000; Watzl, 2002; Kong, 2003). Кроме того, в семенах смородины присутствует уникальное масло, содержащее а- и у-линоленовые кислоты, имеющие важное значение для здоровья человека (Вагге, 2001; Simondkova, 2002). Интродукция растений рода Ribes с использованием новых видов для создания культизаров с комплексом ценных хозяйственно-биологических признаков и адаптированных к местным условиям является актуальной в настоящее время (Огольцова, 1992; Сорокопудов, Мелькумова, 2003; Кумннов, Жидехина, 2004; Аладина, 2007). Зависимость накопления БАВ растениями от условий выращивания делает актуальными исследования особенностей биологии и биохимии смородин в целом и новых культиваров рода Ribes в частности. Использование современных высокоэффективных аналитических технологий при исследовании комплекса БАЗ позволяет выявить закономерности их биосинтеза и накопления, что старыми традиционными методами невозможно выполнить. При разнообразной переработке плодов необходимо учитывать содержание БАВ в получаемых продуктах и их сохранность при различных условиях хранения.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключается в выявлении биологических и биохимических особенностей растений рода Ribes L. при интродукции в Белгородской области.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
выявить фенологические особенности представителей рода Ribes в условиях Белгородской области;
провести биоморфологический анализ сортообразцов Ribes nigrum L.;
выявить анатомические особенности плодов и локализацию в них пигментов у представителей четырех подродов рода Ribes;
исследовать химический состав плодов растений рода Ribes;
изучить динамику накопления некоторых БАВ в плодах при созревании и хранении на примере отдельных сортов смородины черной;
сопоставить ферментативную активность и определить особенности биосинтеза антоцианов и каротиноидов в плодах представителей подродов Eucoreosma Jancz., Ribesia (Berl.) Jancz., Symphocalyx Berl., Berisia (Spach) Jancz.;
провести оценку использования антоцианов плодов Ribes nigrum L. в качестве пищевых красителей.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение биологических особенностей растений четырех подродов рода Ribes. Выявлены закономерности феноритмики представителей рода Ribes в условиях Белгородской области. На примере сортов разного эколого-географического и генетического происхождения Ribes nigrum установлено, что использование характеристики побегов, продуктивности и засухоустойчивости позволяет выявить наиболее адаптированные сортообразцы. На основании впервые проведенного сравнительного анатомического изучения плодов представителей четырех подродов рода Ribes установлены особенности их строения и выявлена локализация различных пигментов в разных частях клеток и тканей плодов. Установлены сроки максимального накопления антоцианов. Сравнительное изучение накопления БАВ (сахаров, аскорбиновой кислоты, антоцианов, каро-тиноидов, триглицеридов) в плодах различных смородин позволило выявить виды, перспективные для использования в пищевой и фармацевтической промышленности, доказать родство внутри подрода, рода и высокую степень родства с крыжовниками. Выявлены оптимальные условия для сохранности БАВ при длительном хранении плодов и продуктов их переработки.
Научно-практическая значимость. Полученные сведения являются основой при отборе перспективных для возделывания видов и культиваров смородин с комплексом хозяйственно-ценных признаков. Материалы по содержанию БАВ в растениях рода Ribes представляют практический интерес, так как позволяют выделить источники для получения высококачественных плодов с наибольшим накоплением БАВ. Результаты исследования изменчивости содержания БАВ в зависимости от условий произрастания и сроков сбора сырья следует учитызать при разработке мер по их рациональному использованию. Данные по методам переработки и условиям хранения могут использоваться в пищевой и фармацевтической промышленности для выбора оптимальных технологий переработки и хранения антоциан-содержащего сырья.
Результаты исследований включены в учебные курсы «Хроматографи-ческие и ионообменные методы» и «Спектральные методы анализа биологически активных веществ», используются при проведении лабораторных практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ при непосредственном участии автора.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы представлены на: II Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2005); Международной молодежной научно-практической конференции (Белгород, 2006); III Международной научно-практической конференции "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности" (Санкт-Петербург, 2007); II научно-практической региональной конференции (Липецк, 2007); III и IV Международных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов (Владикавказ, 2006, 2008); 63-ей региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2008); V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар - Уфа, 2008); Меж-
дународной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование, производство» (Воронеж, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, три из которых в изданиях Перечня ВАК РФ.
Декларация личного участия автора. Автор лично осуществил сбор объектов, провел полевые и лабораторные эксперименты, провел морфомет-рические, анатомические, спектрофотометрические и хроматографические исследования. Обработка полученных данных, их интерпретация, оформление проведены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора составил 30-80%. Исследования поддержаны грантом: «Скрининг видового разнообразия растений семейства Grossulariaceae Mill. Ботанического сада Белгородского государственного университета как методологическая основа создания адаптированного сортимента для условий Среднерусской возвышенности». Регистрационный номер: 2.2.3.1/349.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 185 страницах, включает 40 рисунков и 29 таблиц. Список литературы содержит 290 наименований, из которых 92 - на иностранных языках.
Основные положения, выносимые на защиту:
Морфологические и фенологические параметры интродуцентов рода Ribes L. позволяют выделить перспективные виды и сорта для выращивания в условиях Белгородской области.
Качественный состав БАВ плодов (антоцианы, каротиноиды) изученных интродуцентов зависит от их видовой принадлежности; количественное содержание (антоцианы, сахара, аскорбиновая кислота) определяется видовой принадлежностью и стадией зрелости плодов.
Антоцианы смородины черной накапливаются в кожице плодов, сохраняются при сушке плодов в естественных условиях более 90% и являются перспективным источником для получения активной субстанции для медицинской и пищевой промышленности.
Ботанические и экологические особенности представителей рода Ribes L
Видовые особенности рода изложены с использованием специальных литературных источников, определителей, справочников (Флора СССР, 1945; Бочкарникова, 1976; Жизнь растений, 1981; Кичина, 1984; Равкин, 1987; Флора Сибири, 1994; Огольцова и др., 2000). Это холодостойкие мезофитные растения — представители голарктического царства (Тахтаджян, 1978), входящие в состав голарктической флоры. Жизненная форма растений смородины - геоксильный кустарник (Серебряков, 1952), т.е. побеги формирования возникают из почек возобновления, находящихся ниже уровня почвы. Растения достигают 1,5 м высоты, с простыми очередными 3-5-лопастными листьями, снабженными желтоватыми желёзками с эфирным маслом, выделяющими ароматические вещества. Формула цветка Са5 Со5 А5 G(2). Цветки актиноморфные, обоеполые, пятичленные. Околоцветник двойной, чашечка состоит из 5 свободных чашелистиков, венчик — из 5 лепестков, которые чаще мельче чашелистиков. Тычинок пять, пестик с нижней одногнездной завязью, содержащей многочисленные семяпочки. Плоды - сочные многосемянные ягоды, которые имеют на верхушке засохшую чашечку. Ягоды типичных смородин чаще шаровидные, голые, а ягоды крыжовников имеют широкоэллипсоидальную форму, и, как правило, покрыты железистыми волосками. Семена с эндоспермом. Эти растения произрастают в диком виде в лесной зоне, на севере доходят до 68 с.ш., встречаются по сырым местам и широко представлены в культуре, являются медоносами и имеют важное пищевое значение, а отдельные виды смородины отличаются ещё и декоративными качествами.
Смородина черная (R. nigrum L.) относится к подроду Eucoreosma (Jancz.) Berger. R. nigrum включает три подвида: европейский R nigrum ssp. europeum L., сибирский R nigrum ssp. sibiricum Wolf, и скандинавский R. nigrum ssp. scandinavicum. Основу культурного сортимента составляют сорта, полученные с участием этих подвидов, а также смородины дикуши — R. dikuscha Fisch.
Смородина черная - кустарник высотой до 1,5-2 м. Куст состоит из нескольких десятков разновозрастных ветвей, но главного стебля нет. Более короткий срок жизни ветвей, у форм смородины дикуши и сибирского подвида смородины черной, а продолжительный - у форм европейского подвида (Куминов, Жидехина, 2003). Смородина не образует корневой поросли.
! Прикорневые, или нулевые побеги появляются из почек возобновления в основании ветвей и имеют высоту 0,8 - 1 м.
Европейский подвид смородины черной (R. nigrum ssp. europaeum) -растение умеренного климата. Этот подвид растпространен почти на всей европейской части России (и стран бывшего СССР, кроме Крыма), Урала и Западносибирской низменности, и на Востоке доходит до Енисея, но уже у Оби встречается с сибирским подвидом, на севере - до 66-68 с.ш. Распространен в горах Средней Азии, где также встречается с сибирским подвидом. Местообитанием подвида являются окраины болот, берега рек и ручьев, влажные леса и их опушки, влажные луга. Встречается одиночно или небольшими зарослями. Для этого подвида характерна широкая изменчивость по вегетативным органам и цветкам, плоды же варьируют слабо. Фенотипическое проявление признаков европейского подвида: поздняя вегетация, сжатый куст, позднее вступление в плодоношение. У сортов с явными признаками европейского подвида ростовые процессы имеют затяжной характер.
Сибирский подвид смородины черной (R. nigrum ssp. sibiricum) -распространен в Западной и Восточной Сибири, юго-западе Бурятии, в горах Средней Азии. Местообитанием, этого подвида в Сибири являются предгорья и горные районы с таежной растительностью. Растет преимущественно в верхних зонах северо-восточных склонов, под пологом леса, а также по берегам и островам рек, около болот, там, где умеренное освещение и значительное снегонакопление. Сибирской подвид смородины черной характеризуется сильно раскидистыми кустами, высотою 50-160 см, значительным варьированием окраски плодов, легкой их осыпаемостью. В Томской области Д. А. Андрейченко (1952) выделены буроплодные и зеленоплодные формы, относящиеся к сибирскому подвиду. Ягоды некоторых из них имели хороший вкус, тонкую кожицу.
Смородина дикуша (R. dikuscha Fisch.) встречается в Якутии, Хабаровском крае, в Читинской и Амурской областях, на севере Камчатской области, на юге Бурятии и редко в Приморском крае. Дикуша занимает довольно обширный сетчатый или ленточно-островной ареал между 55 - 68 с.ш. Это растение холодного климата, равнинных мест. Местообитание ее отнесено к водоразделам рек, островам с кратковременным затоплением, песчаным или песчано-галечным наносам. Требовательна к почве. Выносит затенение, произрастая в разреженном пролеске, в пойменных, лиственных лесах. Этот вид имеет большое разнообразие форм по высоте куста от 0,3 до 1,5 - 2 м. Вкус ягод обычно кислый. Характерным признаком вида является сизый налет на ягодах. Смородмна дикуша морозостойка, ей присуща ранняя вегетация (Равкин, t 1987), скороплодность и урожайность (Бочкарникова, 1973; Сорокопудов, Мелькумова, 2003). Неблагоприятными климатическими факторами для нее являются высокие летние температуры и недостаток влаги, резкая континентальность климата, бесснежность зим. Многие формы в природных условиях имеют неосыпающиеся ягоды, которые обычно завяливаются и долго остаются на кусте.
Для сортов, производных сибирского подвида смородины черной и смородины дикуши, характерен сильный рост побегов в конце мая - июне, а затем полное затухание. У сортов производных от сибирского и европейского подвидов максимальное нарастание приростов имеет два максимума — июнь и июль. На следующий год из почек появляются ответвления. На ответвлениях первого порядка образуются ответвления второго, третьего и четвертого порядков, что определяет возраст ветвей. Темпы роста побегов в первые годы жизни во многом определяют дальнейшее развитие ветвей, их долговечность и продуктивность (Андрейченко, 1952; Куминов, 1980; Куминов, Жидехина, 2003).
Смородина американская (R. americanum Mill.) относится к подроду Encoreosma (Jancz.) Berger, произрастает в восточной и центральной части Северной Америки, во влажных лесах, зарослях кустарников, на болотах, по берегам рек, влажных оврагов, глубоких ущелий. Этот вид имеет довольно высокие (до 1,5 м) кустарники с очень раскидистыми побегами. Характерно значительное варьирование морфологических признаков. Наиболее привлекательны в декоративном плане растения с крупными и мелкими листьями. Отличается поздним цветением, цветки колокольчатые зеленовато желтые. Плоды диаметром около 10 мм, богаты витаминами и сахарами. Высокие урожаи смородина американская дает в среднеазиатских республиках, главным образом в Узбекистане. В Государственном Ботаническом саду (ГБС) растения этого вида вегетируют с конца апреля до начала октября. Растут быстро, концы побегов укореняются при соприкосновении с землей. Цветут обильно, с третьей декады мая вплоть до начала июня, 17 дней. Плодоносят с 3 лет, ягоды созревают в последней декаде августа. Зимостойкость средняя. (Древесные растения... , 2005).
Смородина альпийская (R. alpinum L.) принадлежит к подроду Berisia (Spach) Jancz., в природе встречается в северо-западных областях европейской части России, в Карпатах, на Кавказе, в Скандинавии, Средней и Южной Европе, в лесах, среди кустарников, по берегам рек, на равнине и в горах до субальпийского пояса, на скалах. Кустарник до 2,5 м высотой с бурыми побегами, трехлопастными темно-зелеными листьями, до 4 см длиной, острозубчатыми по краю, сверху блестящими, снизу более светлыми, гладкими или рассеянно-волосистыми. Цветки мелкие зеленоватые; в кистях до 4 см длиной из 2-20 цветков; тычиночные - в коротких, пестичные - в достаточно длинных. Плоды красные - шаровидные или слегка продолговатые ягоды (до 0,9 см), безвкусные. Смородина альпийская нетребовательна к почве, мирится с небольшим засолением, может расти на каменистых участках, она также зимостойка и жаростойка. Один из немногих видов, прекрасно переносящих фигурную стрижку. В условиях Подмосковья вегетирует с середины апреля до начала октября. Темп роста средний. Цветет с 3-5 лет, ежегодно, обильно, с начала мая и до третьей декады, 16 дней. Плодоносит с 4-5 лет, обильно, плоды созревают в середине июля и долго не опадают. (Древесные растения... , 2005)
Смородина золотистая (R. аигеит Pursh.) относится к подроду Symphocalyx Berl., растет в западной части Северной Америки, в горах, в сырых местах, по долинам и берегам рек, озер. Представляет собой высокий, маловетвистый кустарник, до 2 м высотой, с округлой кроной. Листья трехлопастные до 5 см длиной глянцевые желто-зеленые летом и краснеющие осенью. Золотисто желтые, мелкие цветки с приятным, сильным ароматом собраны в короткие кисти. Продолжительность цветения 15-20 дней. Плоды — шаровидные ягоды, до 0,8 см (от оранжево-желтых и пурпурно-коричневых до почти черных), кисло-сладкие, съедобные. У смородины золотистой ягоды обычно крупнее, чем у черной: яркие, блестящие, с сухим длинным околоцветником. Однако одним из недостатков золотистой смородины является ее низкая самоплодность. Плодоносит с 5-6 лет. Имеет ряд крупноплодных форм и сортов.
Начало вегетации видов
Начало роста смородины зависит от сроков наступления весны, а также от состояния физиологического (органического) покоя растений. Черная смородина имеет короткий органический покой и удерживается в состоянии вынужденного покоя при длительном морозномпериоде.
Боковые почки кустарников черной смородины в Западной Европе вообще прекращают рост с конца июля, и затем наступает зимний покой, в течение которого никакое морфологическое развитие не происходит (Lantin, 1973). Чтобы прерывать состояние покоя, требуется охлаждение в течение 12-15 недель при 2С. В некоторых районах зимние температуры могут быть слишком высокими, чтобы соответствовать условиям.зимовки-(Lantin, 1973). Подобная- ситуация может быть характерна для красных смородин. Кроме того, растения и отдельные почки на них отличаются по состоянию органического покоя, таким образом, переменные холодные и умеренные условия могут привести к более раннему распусканию почек, в то время как другие на тех же самых растениях остаются бездействующими (Lantin, 1973). Это неизбежно приводит к неравному росту и, в конечном счете, неравномерному созреванию плодов на растениях. Еще должны быть приняты во внимание последствия — раннее пробуждение почек может привести к большому ущербу при весенних заморозках (Lantin, 1973).
Известно, что изменение фенологического состояния растений связано с климатическими условиями места произрастания и климатическими условиями естественной ( среды происхождения и произрастания вида. Эколого-географические закономерности изменчивости многих признаков растений (в том числе и сезонного развития) при перенесении их из разных мест ареала изучались в классических работах G. Turesson (1925), W.M. Hiesey (19942) и др. Г. Турессоном установлено, что на севере у растений наблюдается раннее цветение и умеренный рост, на юге — позднее цветение с более высоким ростом, на западе — позднее цветение и низкий рост, на востоке — раннее цветение и высокий рост (Brennan, 1997). В сезонном развитии смородины при перенесении в одинаковые условия культуры при интродукции наблюдаются те же закономерности.
Наиболее сильное влияние на наступление фенофаз оказывает температура в первой половине вегетационного периода (Культиасов, 1982). При оценке температурных условий данной местности пользуются показателем суммы эффективных температур (за порог вегетации для смородин приняли температуру +2С) (Семенченко, 1979; Brennan, 1997).
На начало вегетации- в условиях Белгородской области большое влияние оказывают погодные условия в конце марта - начале апреля месяца, когда после отрицательных температур февраля идет постепенное потепление. Начало вегетации у растений, относящихся к подродам Eucoreosma и Berisia, наступает в третьей декаде марта (рис. 3.1). У растений подрода Ribesia, а также растений R. аигеит, относящихся к подроду Symphocalyx, разница-между органическим и вынужденным покоем меньше, чем у R. nigrum, поэтому они незначительно реагируют на оттепели и позже начинают рост.
В 2005-2006 гг. у сортов R. nigrum, имеющих разное эколого-географическое происхождение, вегетация начиналась в I - II декадах апреля (см. рис. 3.1), при достижении суммы эффективных температур 48 - 191 С (табл. 3.1). Позднему вступлению в фазу вегетации растений черной смородины в 2006 г. предшествовала холодная погода в феврале и марте месяце с большим количеством осадков (температура в марте по сравнению с 2005 г. ниже на 5,9С).
В 2007-2008 гг. исследований вегетация у растений рода Ribes (R. nigrum и R. americanum) начиналась в II - III декадах марта, что на 12-15 дней раньше обычного наступления периода вегетации (Сорокопудов и др., 2009). Это изменение начала вегетации отражает реакцию растений на изменения условий среды, так как в период 2007-2008 гг. наблюдалась достаточно ранняя весна и высокая солнечная активность, температура днем в марте часто достигала +10 + 12С и иногда доходила даже до + 15 + 17С. У сортов, полученных путем гибридизации R. nigrum ssp. scandinavicum и R. nigrum ssp. europaeum x R. nigrum ssp. sibiricum x R. dikuscha, - вегетация начинается рано: в конце второй — начале первой половины третьей декадах марта, - при небольшом количестве тепла, когда сумма эффективных среднесуточных температур составила 46 - 121 С (см. табл. 3.1). У этих растений умеренная климатическая зона Ботанического сада БелГУ является совпадающей с их естестенным ареалом, в результате этого проявляются свойства, приобретенные на протяжении всего филогенетического развития вида. С позиции оценки термического режима суммой температур некоторое ускорение прохождения фаз в эти годы так же связано с высокой солнечной активностью и достаточно высокими для этого периода температурами, в таких условиях быстрее может накопиться необходимая для роста сумма температур.
Наиболее ранняя вегетация растений в 2008 г. наблюдалась у R. americanum во второй декаде марта. В то время как в 2007 г. вегетация отмечена только с третьей декады. Для R. americanum показатель суммы эффективных температур для начала вегетации отмечен при 79 - 106С, однако в 2008 г. вегетация началась на 13 дней раньше, чем в 2007 г., при накоплении тепла 86 - 97С.
В 2007-2008 гг. исследований сроки прохождения фазы начала вегетации в условиях лесостепи Белгородской области у R. alpinum, относящейся к подроду Berisia, совпадают со сроками у R. nigrum (см. рис. 3.1), но значительно отличаются от сроков, представленных для Новосибирской (Сорокопудов, Соловьева, 2008) и Московской областей (Древесные растения..., 2005). Начало вегетации отмечается достаточно рано, в третьей декаде марта, при накоплении 87-11ГС (см. табл. 3.1).
Самое позднее начало вегетации наблюдалось у R. аигеит, относящейся к подроду Symphocalyx, в 2007 г. при этом сумма эффективных температур составляла 218-327С. Для марта 2007 года характерны низкие положительные среднесуточные температуры и практически отсутствие осадков. Растения R. аигеит отреагировали на погодные условия 2007 года, при этом разница прохождения фенологических фаз отразила некоторые особенности физиологии, приобретенные на протяжении всего филогенетического развития. В 2008 г. вегетация началась достаточно рано, как и у остальных представителей родр. Ribes, раньше обычного на 10-15 дней.
За годы исследований вегетация у изучаемых образцов подрода Ribesia обычно начиналась в I—II- декадах апреля при сумме эффективных среднесуточных температур 113 - 174С (см. табл. 3.1). В 2006 г. в марте наблюдались отрицательные среднесуточные температуры, и количество осадков превышало норму на 50%, и предшествующий февраль так же отличался жесткими условиями с низкими отрицательными температурами в сочетании с большим количеством осадков. Поэтому в 2006 г. начало вегетации растений подрода Ribesia наблюдалось позже1 на 5 - 10 дней при сумме эффективных температур 124 - 154С. В условиях 2008 года у всех образцов вегетация началась раньше на 1-6 дней. У таких сортов как. Нива, Виксне, начало вегетации отмечено в последних числах марта, при этом сумма эффективных среднесуточных температур составила 146 - 153 С. Это связано с тем, что в марте 2008 года максимальные дневные температуры часто достигали отметки + 12С, а иногда доходили до +17С.
В. 2007-2008 гг. наиболее постоянные сроки вступления в фазу начала вегетации наблюдались у культиваров подрода Ribesia и образцов.R. nigrum. Одними из первых начинают вегетацию растения R. атегісапит, за ними при благоприятных условиях.— растения R. аигеит и R. alpinum, при этом R. alpinwn меньше зависит от погодных условий.
Таким образом, начало вегетации зависит от комплекса метеорологических факторов, предшествующих данной фазе развития растений. Для наступления вегетации растениям требуется определенная сумма среднесуточных положительных температур. Отклонения в сроках начала вегетации по виду из-за погодных условий составляли до трех недель, однако в течение одного сезона разница в сроках начала вегетации для различных видов находилась в пределах двух недель.
Качественный состав антоцианового комплекса
Исследования по определению антоцианов в плодах представителей рода Ribes проводили в образцах, собранных в ботаническом саду БелГУ.
Анализ результатов определения качественного состава антоцианов (методом ВЭЖХ) показал, что набор главных компонентов оказывается неизменным для плодов всех сортов R. nigrum с черной окраской, вне зависимости от происхождения и региона выращивания. Генетически детерминированное подавление синтеза метилтрансфераз, приводящих к появлению в антоциановых комплексах производных пеонидина или мальвидина и петунидина (Дейнека и др., 2008), является важной биохимической характеристикой R. nigrum. Обнаружение в некоторых случаях в плодах R. nigrum небольшого количества производных петунидина и пеонидина (Slimestad et al., 2002) лишь подтверждает этот вывод. В доступных нам видах смородин с красными плодами гидроксилирование кольца В заканчивается- на дигидрокверцетине (предшественнике цианидина), и дигидромирицетин (предшественник дельфинидина) не синтезируется.
На хроматограммах экстрактов плодов всех исследованных сортов R. nigrum, выращенных в Белгородской области, обнаружены четыре основных пика, идентифицируемые как 3-рутинозиды и 3-глюкозиды цианидина и дельфинидина (рис. 5.4). Содержание дельфинидиновых компонентов заметно выше, чем цианидиновых.
Хроматографический профиль антоцианового комплекса плодов R. nigrum оказался практически неизменным во всех опубликованных работах, несмотря на то, что использовались различные стационарные обращенные фазы и различные элюенты. mV
Все измерения с использованием метода ВЭЖХ в данной работе проводили в изократическом режиме, т.е. при постоянстве состава элюата по концентрации кислоты и органического модификатора. Градиентный режим при таких исследованиях может содержать значительную систематическую погрешность. Дело в том, что спектральные характеристики всех веществ зависят от состава растворителя. Особенно это относится к антоцианам, растворы которых при условиях ВЭЖХ определения представляют собой смесь нескольких форм (флавилиевой формы, псевдооснования, цис и транс-халконов), которые меняются в зависимости от рН (Дейнека и др., 2009).
Вследствие обычной недоступности стандартных образцов требующихся антоцианов общепринято спектрофотометрическое определение (Giusti et al., 2001) их общего содержания в пересчете на цианидин-3-глюкозид, а мольное соотношение между индивидуальными антоцианами оценивали по соотношению площадей соответствующих пиков (табл. 5.7 и 5.8).
Для большей части растений R. nigrum характерно преобладание пигментов дельфинидинового ряда, и только у сорта Июньская Кондрашовой - цианидинового (см. табл. 5.7). При этом связь с количественными изменениями в содержании антоцианов не найдена.
В таблице 5.7 и 5.8 приведены два параметра, первый из которых оценивает активность флавонол-гидроксилаз (как суммарная доля производных более гидроксилированного антоцианидина - дельфинидина, Dp), а второй - активность ферментов, отвечающих за присоединение рамнозы к глюкозидному радикалу обоих антоцианидин-3-глюкозидов (Rut -сумма долей 3-рутинозидов).
Относительное количество основных антоцианов мало зависело от степени созревания. Доля рутинозидных компонентов значительно превышает долю глюкозидных компонентов, что свидетельствует о наличии рамнозилтрансферазных ферментов. Это особенно важно в связи с открытием участия рамнозилтрансфераз в защитных механизмах молекулярной природы, что обеспечило возможность разработки принципиально новых стратегий борьбы с заболеваниями растений (Шахбазов и др., 2006). На модельной культуре табака показано, что трансгенные растения, экспрессирующие рамнозилтрансферазу, проявляют высокую степень толерантности к загрязнению почвы нефтепродуктами (Бричкова и др., 2002).
Результаты исследований свидетельствуют о том, что основными антоцианами черноплодных представителей рода Ribes являются глюкозиды и рутинозиды дельфинидина и цианидина, хотя и в различном соотношении (табл. 5.10). При этом весь синтез сосредоточен исключительно в кожице ягод, что говорит о локализации соотвествующих ферментов исключительно в этой части плода. Этот факт подтверждают и исследования отдельно кожицы ягод, где обнаружено такое же соотношение индивидуальных компонентов антоцианового комплекса (табл. 5.11).
При сравнении R. nigrum ssp. sibiricum (рис. 5.5) с сортами R. nigrum, имеющими сложное происхождение, в том числе и с участием R. nigrum ssp. sibiricum (см. табл. 5.10), обнаружена интересная особенность: доля дельфинидиновых компонентов ниже доли цианидиновых компонентов, что, во-первых, свидетельствует о менее высокой активности флавонол-3 ,5 -гидроксилаз, а во-вторых, является отличительной особенностью внутри вида R. nigrum. Из всех исследованных сортов смородины черной, только один сорт Июньская Кондрашовой (сложного происхождения - с участием трех подвидов смородины черной и смородины дикуши) имеет такое же соотношение антоцианидинов, во всех остальных доля дельфинидиновых компонентов превышает долю цианидиновых. Причем это не связано с количественными изменениями в содержании антоцианов. Это может говорить о ферметном различии растений на стадиях преобразования дигидрофлавонолов: для большинства характерен переход дигидрокемпферол —» дигидромирицитин, но у R. nigrum ssp. sibiricum в большей степени идет и в направлении дигидрокемпферол —» дигидрокверцетин. Еще одной особенностью R. nigrum является высокая активность ферментов, отвечающих за присоединение рамнозы к глюкозидному радикалу обоих антоцианидин-3-глюкози дов, которая приводит к образованию рутинозидов, составляющих в сумме до 93% от суммы всех гликозидов.
Антоцианы R. aureum образованы почти исключительно цианидином (глюкозид и рутинозид) (см. табл. 5.10 и 5.11), а доля дельфинидиновых гликозидов в ряде образцов сводится к минорным компонетам (см. рис. 5.5), т.е. смородину золотистую отличает практически отсутствие дельфинидиновых оснований (это также характерно для крыжовника). Такой состав антоциановых компонентов может характеризовать ферментативную систему смородины золотистой отсутствием флавонол-3 ,5 -гидроксилаз. Доли глюкозидных и рутинозидных составляющих в разные годы наблюдений приблизительно равны, с возможным небольшим преобладанием 3-рутинозидов.
Пигменты R. americanum, также как смородины черной, образованы четырьмя компонентами (см. рис. 5.5), по соотношению глюкозидных и рутинозидных гликозидов в плодах смородина американская занимает промежуточное положение между плодами R. nigrum и R. aureum, но ближе к черной смородине (табл. 5.12).
Использование антоцианов плодов черной смородины в качестве красителей для прохладительных напитков
Издавна для окрашивания пищевых продуктов применяли натуральные растительные пигменты. С течением времени бурное развитие органической химии обусловило широкую возможность синтеза искусственных красящих веществ, применение которых выгодно в силу высокой красящей способности и сравнительно низкой стоимости. Таким образом, индустриализация пищевого производства способствовала замене натуральных растительных красителей синтетическими. К сожалению, в синтетических красителях обнаруживается ряд свойств, губительно влияющих на человеческий организм (Болотов, 1999). Поэтому в настоящее время актуальны исследования по разработке методов получения и применения натуральных красителей.
Сырьем для получения натуральных красителей чаще всего служат различные окрашенные части растений, содержащие пигменты (антоцианы, каротиноиды, хлорофиллы и т. п.). Источником антоциановых красителей, используемых в работе, являются ягоды смородины черной. Для выделения этих красящих пигментов использован метод экстракции антоцианов из плодов черной смородины 5% водным раствором лимонной кислоты. Выбор экстрагента обусловлен частым использованием лимонной кислоты в качестве стабилизатора кислотности при производстве прохладительных напитков, а также высоким уровнем извлечения антоцианов. Экстракт, полученный из плодов черной смородины, оценивался на пригодность использования его для окраски популярных белгородских минеральных вод («Майская хрустальная» и «Крещенский родник») с целью замены синтетических красителей.
В бутылки с минеральной водой «Майская хрустальная» (0,5 л) и «Крещенский родник» добавляли 20 мл полученных экстрактов. При этом наблюдалось полное растворение красителя в воде. Образовавшиеся растворы прозрачны, и без осадка, что положительно характеризует красители. Через некоторое время осадок появился, но раствор остался прозрачным. Полученные растворы проанализированы на содержание в них антоцианов и оставлены на хранение. Количественное содержание пигментов определяли спектрофотометрическим методом.
Через определенные промежутки времени в полученных образцах определяли содержание антоцианов. Спектрофотометрические исследования выполняли как для реальных растворов минеральной воды подкрашенной экстрактами (рН = 3), так и для аликвотных порций этих растворов, подкисленных до рН = 1 для полного перевода антоцианов во флавилиевую форму (т.е для количественного определения содержания антоцианов). Во втором случае к аликвотной части раствора (10 мл) добавляли 10 мл 0,1н. раствора соляной кислоты. В качестве раствора сравнения использовали спирт.
При этом получены хорошие результаты: несмотря на то, что антоцианы обладают особой устойчивостью в сильнокислых средах (при рН 1) и не столь стабильны при средних рН (4 - 8), стабильность окраски вод оказалась достаточно высокой. При хранении в негерметичных условиях, при комнатной температуре, включая доступ прямого солнечного света, окраска сохраняется на уровне 60-75% от первоначальной интенсивности. Это важно, поскольку токсичность природных антоцианов не обнаружена ни в одном из проведенных экспериментов.
