Введение к работе
Актуальность исследования
Болезнь Паркинсона (БП) - одно из наиболее тяжелых и распространенных неиродегенеративных заболеваний человека, характеризующееся хроническим прогрессирующим течением, нарушением функции базальных ганглиев и тяжелой инвалидизациеи больных. Лечение больных БП до настоящего времени носит симптоматический характер и не влияет на текущий процесс неиродегенерации [Голубев и др., 1999; Koller, Tse, 2004; Jenner, 2008].
Существует несколько гипотез, касающихся причин гибели дофамин-продуцирующих нейронов при БП, в их числе: генетическая предрасположенность; окислительный стресс; митохондриальная дисфункция; действие экзогенных нейротоксинов [Иллариошкин, 2008]. По современным представлениям, в патогенезе неиродегенерации при БП могут участвовать все вышеуказанные механизмы, что дает возможность рассматривать БП как мультифакториальное страдание, которое проявляется в результате взаимодействия генетических и средовых факторов [Lee, Liu, 2008; Veidman et al., 1998].
Семейные формы БП составляют 5-10% всех случаев заболевания, остальные случаи являются спорадическими [Lee, Liu, 2008; Mizuno et al, 2008]. На молекулярном уровне моногенные формы БП представляют собой генетическую патологию ряда митохондриальных белков, компонентов убиквитин-протеасомного комплекса, либо белков, изменение конформации которых приводит к формированию в нейронах нерастворимых включений, что инициирует реакции окислительного стресса и апоптоза [Иллариошкин, 2003, 2008; Schiesling et al., 2008]. Роль генетики в этом процессе заключается либо в наследственных дефектах белкового гомеостаза, либо в формировании неблагоприятного метаболического фона, определяющего высокий риск неиродегенерации в определенных средовых условиях. Таким образом, мутационный анализ генов наследственных форм паркинсонизма, а также установление основных генов предрасположенности при спорадических формах заболевания представляют собой двуединую задачу, позволяющую оценить удельный вес геномных факторов в развитии БП [De Michele et al. 1995; Schiesling et al., 2008].
2 Из средовых факторов риска БП важнейшим является окислительный стресс с нарушением внутриклеточного баланса между образованием активных форм кислорода (АФК) и состоянием тканевой антиоксидантной защиты. Повышенный уровень АФК рассматривается в качестве универсального механизма развития многих нейродегенеративных заболеваний, а также процесса старения [Завалишин и др., 2001; Иллариошкин, 2003]. Существенным источником АФК в клетках является нарушение функций митохондрий [Halliwell, 1999; Gunnery et al., 1999]. Установлено, что в митохондриях нейронов черной субстанции, скелетных мышц и клеток крови больных БП наблюдается стойкий дефицит комплекса I дыхательной цепи [Swerdlow et al. 1998; Wooten et al. 1997]. Поэтому актуальной задачей является изучение роли окислительного стресса в механизмах повреждения митохондрий при БП. Особый интерес представляет анализ возможности обеспечения сохранности структуры и функции митохондрий с помощью природных и синтетических антиоксидантов.
Новые данные о патогенезе нейродегенерации могут быть получены при исследовании уникальной экспериментальной модели паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone). Эта модель отличается ускоренной динамикой развития возрастных изменений и четко выраженной симптоматикой в ответ на введение токсина МРТР (Ы-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина) [Болдырев и др., 2001, Stvolinsky et al., 2001]. Мыши SAMP представляют собой генетически устойчивую линию животных, ускоренное старение которых объясняется выраженным дисбалансом между образованием и нейтрализацией свободных радикалов и, как следствие - множественными окислительными повреждениями биологических макромолекул в их тканях. Можно предположить, что комбинация возрастных факторов и дефектов системы антиоксидантной защиты с нарушениями обмена веществ в мозге, вызываемыми МРТР, может привести к более выраженным нейродегенеративным изменениям, что позволит использовать эту модель для более тонкого исследования патогенетических механизмов паркинсонизма [Болдырев и др., 2001].
Таким образом, на сегодняшний день не вызывает сомнений существование ряда конститутивных генетических и биохимических факторов, определяющих предрасположенность к развитию БП. Однако вопросы соотношения этих
факторов, их популяционной специфичности, а также целенаправленной профилактики на основе нейропротекции разработаны в недостаточной степени.
Цель работы: клинико-экспериментальный анализ ряда молекулярно-генетических и биохимических факторов развития БП, а также разработка на этой основе новых подходов к терапии данного заболевания.
В соответствии с настоящей целью были поставлены следующие задачи:
1. Мутационный скрининг и изучение роли ряда основных генов,
связанных с развитием наследственно-семейных форм паркинсонизма, в
формировании генетической предрасположенности к спорадической БП:
ген PRKN (паркин), локус PARK2 на хромосоме 6q25.2-27;
ген LRRK2 (дардарин), локус PARK8 на хромосоме 12р11.2;
ген SNCA (а-синуклеин), локус PARK1 на хромосоме 4q21;
ген GBA (глюкоцереброзидаза) в локусе lq21.
Анализ клинико-генетических корреляций в случаях с идентифицированными мутациями в кандидатных генах паркинсонизма.
Изучение ассоциаций спорадической БП с полиморфными вариантами генов нейротрансмиттеров центральной нервной системы (ЦНС).
Моделирование паркинсонизма в эксперименте с помощью нейротоксина МРТР на линии быстро стареющих мышей SAMP, изучение у них вызванных биохимических нарушений, затрагивающих важнейшие ферментные системы митохондрий мозга.
Проведение сравнительного анализа параметров перекисного окисления липидов и антиоксидантних систем в клетках крови (моноаминооксидаза В, супероксиддисмута, карбонильные группы белков, окисленность липидного материала митохондриальных мембран) у больных БП в сопоставлении с аналогичными характеристиками у животных с экспериментальным паркинсонизмом - быстростареющих мышей линии SAMP.
Изучение роли окислительного стресса в механизмах повреждения митохондрий при паркинсонизме и обеспечение их сохранности с помощью природных (карнозин) и синтетических (мексидант) антиоксидантов на модели МРТР-индуцированного паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP, а также в сочетании с антипаркинсоническими препаратами у пациентов с БП.
Научная новизна. Впервые изучена роль генов наследственно-семейных форм первичного паркинсонизма (PRKN, LRRK2, SNCA, GBA) в развитии спорадической БП у российских больных - представителей преимущественно славянских этнических групп. Установлено, что наследуемые мутации в генах паркинсонизма выявляются более чем в 10% всех случаев спорадической БП, в том числе гетерозиготные экзонные перестройки гена PRKN - у 6,5% больных, а мажорные мутации в генах LRRK2 и GBA - суммарно у 5% больных. Показан более ранний возраст манифестации БП у носителей мутаций в гене PRKN, а также аддитивное действие комбинации различных мутаций в отношении тяжести заболевания. Впервые выявлена ассоциация спорадической БП с полиморфными аллелями генов рада нейротрансмиттерных систем ЦНС - HTR2A (серотониновый рецептор 2А), РОМС (проопиомеланокортин) и WFS1 (везикулярный пептид вольфрамин). В работе проведено комплексное клинико-биохимическое и экспериментальное исследование состояния окислительного статуса и антиоксидантной защиты при БП и МРТР-индуцированном паркинсонизме, показана однонаправленность основных патобиохимических звеньев нейродегенеративного процесса в клинике и эксперименте на модели быстростареющих мышей линии SAMP (угнетение активности СОД, повышение уровня липидных гидроперекисей, значительное снижение суммарной активности эндогенной антиоксидантной защиты).
Практическая значимость. Выявление с высокой частотой мутаций в генах PRKN, LRRK2 и GBA у пациентов со спорадической БП принципиально меняет подходы к медико-генетическому консультированию и оценке риска болезни у членов отягощенных семей. В работе предложены и апробированы на практике методы экономного мутационного скрининга генов паркинсонизма (АРЕХ-технология, анализ дозы гена методом ПЦР в реальном времени при гетерозиготных экзонных перестройках). По результатам проведенных исследований в клинике и эксперименте уточнены характеристики окислительного стресса при паркинсонизме и обоснована целесообразность применения ряда новых антиоксидантов в патогенетической терапии БП. Проведено сравнительное изучение эффективности антиоксидантной терапии карнозином при МРТР-индуцированном паркинсонизме, а также карнозином и мексидантом (в сочетании
с антипаркинсоническими препаратами) у больных БП.
Положения, выносимые на защиту:
Важным фактором развития спорадической БП являются наследуемые мутации в генах, связанных с менделирующими формами первичного паркинсонизма: в российской (преимущественно славянской) выборке пациентов со спорадической формой БП гетерозиготные мутации генов PRKN, LRRK2 и GBA выявляются более чем в 10% случаев болезни.
При анализе клинико-генетических корреляций установлено, что носительство мутаций в генах PRKN (паркин) и GBA (глюкоцереброзидаза) ассоциировано с более ранним дебютом клинической симптоматики, а сочетание мутаций (двойная гетерозиготность) в различных генах паркинсонизма характеризуется аддитивным эффектом в отношении тяжести течения заболевания. Мажорная мутация G2019S в гене LRRK2 обусловливает широкий полиморфизм возраста дебюта и фенотипических проявлений паркинсонизма. Высокая частота носительства данной мажорной мутации у пациентов с БП обусловлена как «эффектом основателя», так и повторными мутационными событиями de novo.
В исследованной популяции установлена ассоциация спорадической БП с полиморфизмами в генах HTR2A (серотониновый рецептор 2А), РОМС (проопиомеланокортин) и WFS1 (везикулярный пептид вольфрамин), что подтверждает патогенетическую взаимосвязь данного заболевания с активностью нейропептидной и серотонинергической трансмиттерных систем головного мозга.
С биохимической точки зрения БП (идиопатический паркинсонизм) и экспериментальный МРТР-индуцированный паркинсонизм у быстростареющих мышей линии SAMP1 характеризуются однонаправленными изменениями, свидетельствующими об истощении системы антиоксидантной защиты и усилении свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов. С учетом возникающих при этом у мышей линии SAMP1 двигательных и поведенческих нарушений можно заключить, что животные с генетически ускоренным старением мозга являются наиболее адекватной моделью для изучения механизмов нейродегенеративного повреждения вещества мозга в эксперименте.
Окислительный стресс и его патофизиологические проявления на уровне ткани мозга быстростареющих животных с экспериментальным
паркинсонизмом предотвращаются курсовым введением природного антиоксиданта карнозина (протекция в отношении угнетения двигательной активности и МРТР-индуцированной мышечной ригидности, предотвращение подавления активности МАО-В и активации СОД, защита белков от окислительной модификации). У больных БП назначение карнозина сопровождается существенным усилением позитивной динамики клинических симптомов (по сравнению с группой базисной терапии), уменьшением окислительного повреждения липопротеинов крови на фоне повышения уровня эндогенной антиоксидантной защиты и сохранения активности Cu/Zn-СОД.
6. Включение в терапевтическую схему у пациентов с БП синтетического антиоксиданта мексиданта способствует нейтрализации роста липидных гидроперекисей в липопротеинах крови и повышению уровня эндогенной антиоксидантной защиты; особенно отчетлив эффект мексиданта в отношении снижения частоты выявляемых побочных эффектов леводопа-терапии. Результаты проведенных исследований являются основанием для использования природных и синтетических антиоксидантов различных классов (карнозин, мексидант) в комплексном лечении паркинсонизма.
Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, II, III, V неврологических, нейрохирургического и научно-консультативного отделений, отделения реанимации и интенсивной терапии, отдела исследований мозга, научно-координационного отдела, отделения лучевой диагностики, лабораторий экспериментальной и клинической нейрохимии, кардионеврологии, ультразвуковой диагностики, эпидемиологии и профилактики заболеваний нервной системы, патологической анатомии с прозектурой, клинической нейрофизиологии НЦН РАМН 13 мая 2009 г.
Результаты работы доложены на: научной конференции НИИ неврологии РАМН (2006 г); Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (2004, 2005); II Украинском симпозиуме с международным участием «Экстрапирамидные болезни и возраст» (Киев, 2004); Научно-практической конференции неврологов Московской области (Ступино, 2005); V съезде Российского общества медицинских генетиков (Москва, 2005); IX Всероссийском
7 съезде неврологов (Ярославль, 2006); Международных конгрессах по болезни Паркинсона и нарушениям движений (Рим, 2004; Новый Орлеан, 2006; Киото, 2007), XVII Всемирном конгрессе по болезни Паркинсона (Амстердам, 2007); Конференции Европейской Федерации Неврологических Обществ (Брюссель, 2007); I Национальном конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 32 научных работы в отечественных и зарубежных изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, описания материалов и методов исследования, 3 глав с изложением полученных результатов, обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Диссертация изложена на 214 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 30 рисунков. Библиографический указатель включает 314 источников, в том числе 51 работу отечественных и 263 - зарубежных авторов.
Автор выражает искреннюю благодарность за помощь и поддержку при выполнении различных фрагментов диссертационного исследования:
коллективу сотрудников нейрогенетического отделения Научного центра неврологии РАМН (зав. - проф. И.А. Иванова-Смоленская), в особенности научным сотрудникам ДНК-лаборатории отделения -кандидатам мед. наук Н.И.Миклиной и Н.Ю. Абрамычевой;
сотрудникам лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии (зав. - проф. А.А. Болдырев) Научного центра неврологии РАМН;
сотрудникам лаборатории молекулярной генетики наследственных заболеваний (зав. - дДн, проф. П.А.Сломинский) Отдела молекулярных основ генетики человека (зав. - проф., лауреат Государственной премии РФ С.А.Лимборская) Института молекулярной генетики РАН;
сотрудникам Института молекулярной и клеточной биологии Тартуского университета (Эстония).
