Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Клиническая характеристика болезни Паркинсона 13
1.2. Генетика болезни Паркинсона 17
1.3. Ювенильный паркинсонизм 25
1.4. Гены, ассоцированнные с риском развития болезни Паркинсона 30
1.4.1. Роль полиморфных аллелей дебризоквин-4-гидроксилазы в развитии БП 32
1.4.2. Роль гена параоксоназы в процессах детоксикации 35
1.4.3. Роль аполипопротеина Е в процессах нейродегенерации 38
1.5. Дофа-чувствительная дистония 40
Глава 2. Объем и методы исследования 45
2.1. Общая характеристика больных и обследованных семей 45
2.2. Характеристика молекулярно-генетических методов исследования .. 49
2.2.1. Анализ полиморфных локусов в «генах риска» 50
2.2.2. Анализ гена GCH-I 55
2.2.3. Анализ гена паркина 56
Глава 3. Результаты исследования 59
3.1. Анализ генетической предрасположенности к развитию болезни Паркинсона в сербской популяции 59
3.1.1. Анализ полиморфизма 2D6*4 в гене CYP2D6 62
3.1.2. Анализ полиморфизма L54M в гене PON1 66
3.1.3. Анализ полиморфных аллелей гена. ароЕ 71
3.1.4. Анализ полиморфизма S18YB гене UCH-L1 75
3.1.5. Анализ полиморфизма V380L в гене паркинг 79
3.1.6. Анализ комбинированных полиморфизмов в генах-кандидатах 82
3.2. Клинико-генетический анализ дофа-чувствительных
экстрапирамидных синдромов 85
3.2.1. Результаты исследования гена GCH-1 у больных с дофа-чувствительной дистонией 85
3.2.2. Мутационный скрининг гена паркина при ювенильном паркинсонизме 91
Глава 4. Обсуждение результатов 96
4.1. Генетическая предрасположенность к болезни Паркинсона 96
4.2. Наследственные дофа-чувствительные экстрапирамидные синдромы 105
ВЫВОДЫ 109
Библиографический указатель
- Клиническая характеристика болезни Паркинсона
- Общая характеристика больных и обследованных семей
- Анализ генетической предрасположенности к развитию болезни Паркинсона в сербской популяции
Введение к работе
Актуальность работы. Достижения молекулярной генетики последнего десятилетия привели к идентификации человеческого генома, а также выяснению роли нескольких тысяч генов в этиологии наследственных заболеваний человека. Это позволяет уже в настоящее время проводить молекулярную диагностику и специфическую профилактику многих моногенных заболеваний, а также определять генетические факторы риска развития наиболее распространенных мультифакториальных форм патологии [Горбунова В.Н., Баранов B.C., 1997; Киселев Л.Л., 2000; Evans G., 1998]. Появился принципиально новый раздел медицины - молекулярная медицина (а также ее подразделы - молекулярная неврология, молекулярная кардиология и т.д.); они основаны на точном знании молекулярной природы первичных генетических и белковых дефектов при изучаемых заболеваниях [Горбунова В.Н. и др., 2000; Beaudet А., 1999].
Прогресс в области изучения медицинской геномики в полной мере затронул и неврологию [Иванова-Смоленская И.А., 1996; Иллариошкин СИ. и др., 2002; Brice А., 1998; Pulst S., 2003]. Помимо внедрения в практику технологий ДНК-анализа генов наследственных болезней нервной системы, все шире исследуются молекулярно-биологические основы поддержания белкового гомеостаза в клетке с целью установления механизмов развития наиболее значимых нейродегенеративных заболеваний человека - болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, полиглутаминовых болезней и др. [Иллариошкин С.Н., 2003].
Болезнь Паркинсона (БП) представляет одно из наиболее распространенных возраст-зависимых нейродегенеративных заболеваний человека, в механизмах развития которой большое значение в последние годы придается генетическим
7 факторам. Непосредственно наследственные формы составляют, по данным разных авторов, около 5-10% всех случаев БП [WzolekZ. et al, 1995; Golbe L. et al, 1996], причем показана выраженная генетическая гетерогенность и наличие, как минимум, 8 различных генетических локусов аутосомно-доминантной БП - на хромосомах 4q, 2р, 4р, 12q, lp, 2q и 5q [Polimeropoulos М. et al, 1996; Gasser Т. et al, 1998; Farrer M. et al, 1999; Leroy E. et al, 1998; Funayama M. et al, 2002; Hicks A. etal, 2002; PankratzN. et al, 2003; Marx P. et al.,2003].
Этиология спорадических случаев БП рассматривается как результат взаимодействия эндогенных факторов (совокупности генов, определяющих «метаболический фон» конкретного индивида) и факторов окружающей среды [Иллариошкин С.Н., 2003; Spacey S., Wood N., 1999; Mouradian M., 2002]. Для оценки роли генетики в развитии подобных мультифакториальных заболеваний используется анализ ассоциаций болезни с аллельными вариантами генов, имеющих отношение к ключевым звеньям патогенеза болезни. Применительно к БП, были получены определенные ассоциации болезни с генами, продукты которых принимают участие в метаболизме экзогенных токсинов и ксенобиотиков, функционировании системы антиоксидантной защиты клетки, обмене и транспорте дофамина, окислительном фосфорилировании, процессах репарации нейронов [Иллариошкин С.Н. и др., 2002; Nussbaum R., Polymeropoulos М., 1997; Tan Е. et al, 2000; Mouradian M., 2002]. Результаты исследований генетической предрасположенности к развитию БП существенно варьируют в тех или иных странах и этнических группах, что доказывает популяционно-специфичный характер генетических ассоциаций и диктует необходимость сравнительно анализа получаемых данных в разных популяциях мира.
Особой формой первичного паркинсонизма, имеющей значительную генетическую компоненту, является ювенильный (юношеский) паркинсонизм. Это заболевание обычно наследуется по аутосомно-рецессивному типу и может быть связано с мутациями в 4 самостоятельных генетических локусах [Kitada Т. et al, 1998;Valente М. et al, 2001; Van Duijn M. et al, 2001; Hampshine J. et al, 2001], для трех из которых идентифицированы первичные белковые продукты - паркин (хромосома 6q25.2-27), PINK1 (хромосома 1р35-р36) и DJ-1 (хромосома 1р36). Мутации в гене паркина - убиквитин-лигазного фермента, играющего ключевую роль в протеасомной деградации клеточных белков - являются наиболее частой причиной ювенильного паркинсонизма [Загоровская Т.Б., 2002; Kitada Т. et al, 1998; Lucking С. et al, 2000; Maruyama M. et al, 2000]. Характерными фенотипическими особенностями паркинопатий являются раннее начало, сочетание паркинсоновского синдрома с дистонией, быстрое развитие леводопа-индуцированных дискинезий, дневные флюктуации симптомов, относительно благоприятное течение. Однако, в последние годы было показано, что иногда мутации в паркине могут приводить к клинической картине «классической» поздней БП, дофа-чувствительной дистонии, паркинсонизма с атаксией и др. [Иллариошкин С.Н. и др., 2002]. Таким образом, выяснение истинного фенотипического спектра паркинопатий и частоты мутаций в гене паркина у больных в различных популяциях являются весьма актуальными задачами современной клинической неврологии и нейрогенетики.
Еще одним наследственным дофа-чувствительным экстрапирамидным заболеванием является дофа-чувствительная дистония (ДЧД). Она наследуется по аутосомно-доминантному и (гораздо реже) по аутосомно-рецессивному типу,
9 клинически характеризуясь дистоний с повышением мышечного тонуса, формированием патологических поз, дневными флюктуациями симптомов и «драматическим эффектом» малых доз леводопы [Nygaard Т. et al, 1993; Маркова Е.Д., 1975; 2002]. Основной ген ДЧД локализован на хромосоме 14q и кодирует ключевой фермент метаболизма дофамина - ГТФ-циклогидролазу-1 (GCH-I) [Ichinose Н. et al, 1994]. Значительное фенотипическое сходство ДЧД и ювенильного паркинсонизма диктует необходимость разработки методов их четкой дифференцировки, в том числе и использованием молекулярно-генетических подходов - т.е. с помощью комбинированного мутационного скрининга генов паркина и GCH-I.
Следует отметить, что до настоящего времени в сербской популяции клинико-генетический анализ различных форм дофа-чувстительных экстрапирамидных синдромов не проводился.
Цель работы: клинико-генетический анализ болезни Паркинсона, ювенильного паркинсонизма и дофа-чувствительной дистоний в сербской популяции на основе исследования мутаций и полиморфизмов в соответствующих генах-кандидатах.
Исходя из поставленной в работе цели, были сформулированы следующие задачи исследования:
Анализ частот полиморфных аллелей генов цитохромоксидазы (CYP2D6), параоксоназы (PON1), аполипопротеина Е (ароЕ), убиквитин-карбокситарминалъной гидролазы (UCH-L1) и паркина у пациентов-сербов с БП и в соответствующем этническом контроле.
Сопоставление генетического статуса обследованных больных БП с
10 особенностями клинической картины заболевания, а также анализ роли исследованных генов в формировании предрасположенности к БП.
Мутационный скрининг генов паркина и GCH-I у больных с наследственными дофа-чувствительным экстрапирамидными синдромами (ювенильный паркинсонизм, дофа-чувствительная дистония) в сербской популяции.
Детальный анализ фенотипических проявлений ювенильного паркинсонизма и дофа-чувствительной дистонии в случаях, диагностически подтвержденных на молекулярном уровне.
Разработка принципов прямой ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования в сербских семьях, отягощенных ювенильным паркинсонизмом и дофа-чувствительной дистонией.
Научная новизна
Впервые в славянской популяции Сербии проведен анализ молекулярно-генетических факторов, определяющих развитие БП и фенотипически сходных дофа-чувствительных экстрапирамидных синдромов. Установлен вклад А и М-аллелей генов CYP2D6 и PON1 в формировании предрасположенности к БП, а также обосновано протективное значение носительства Y-аллеля гена UCH-L1. Установлено что гены ароЕ, CYP2D6 и PON1 обладают модулирующим эффектом в отношении возраста манифестации БП. Полученные данные позволяют выделить ранние случаи БП в особую форму первичного паркинсонизма, в развитии которой наиболее значима роль генетических факторов.
Впервые в сербской популяции при молекулярно-генетическом анализе дофа-чувствительной дистонии и ювенильного паркинсонизма идентифицированы мутациии в генах GCH-I и паркине, причём мутации 520G—>А и IVSl-85delA гена
GCH-I выявлены впервые в мире. Тем самим получено подтверждение, что аутосомно-доминантная дофа-чувствительная дистония и аутосомно-рецессивний ювенильный паркинсонизам являются широко распространенными заболеваниями встречающимися в различных популяциях мира, в том числе и в Сербии.
Практическая значимость. На основании анализа генетических ассоциаций рассчитаны конкретные величины риска БП у носителей «неблагоприятных» генотипов, а также показан аддитивный (суммирующий) эффект как «неблагоприятных», так и «благоприятных» аллелей в реализации генетического риска. Это позволяет сформировать среди обследованных лиц группы риска в отношении развития БП, которые должны становится объектом целенаправленных профилактических мероприятий. Получен первый опыт прямой ДНК-диагностики дофа-чувствительной дистонии и ювенильного паркинсонизма в семьях сербского этнического происхождения, а также первый опыт медико-генетического консультирования этих форм патологии на основе мутационного скрининга генов GCH-I и паркина.
Основные положения, выносимые на защиту:
Впервые в сербской популяции проведен комплексный клинико-генетический анализ БП и сходных дофа-чувствительных экстрапирамдных синдромов на основании исследования мутаций и полиморфизмов в генах CYP2D6,P0N1, UCH-L1, ароЕ, GCH-Іипаркше.
Генетические факторы играют важную роль в формировании предрасположенности к БП, а также оказывают влияние на особенности течения заболевания. Определенные аллели генов CYP2D6, PON1, UCH-L1 приводят к повышению или снижению риска развития БП по сравнению с
12 общей популяцией; помимо этого, носительство «неблагоприятных» аллелей генов CYP2D6, PON1, UCH-L1, ароЕ способствует более ранней манифестации заболевания.
Роль изученных генов предрасположенности наиболее значима в развитии ранней формы БП (т.е. в случае с возрастом манифестации симптомов до 45 лет).
В сербской популяции у больных с наследственными дофа чувствительными экстрапирамидными синдромами — дофа-чувствительной дистониой и ювенильным паркинсонизмом — впервые выявлены мутации (в т.ч. не описанные ранее в литературе) в генах GCH-I и паркинг. Получен первый опыт прямой ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования в отягощенных семьях на территории Сербии.
Автор выражает искреннюю благодарность руководителю
нейрогенетического отделения ГУ НИИ неврологии РАМН профессору И.А. Ивановой-Смоленской и ведущему научному сотруднику отделения Е.Д. Марковой за постоянную помощь и поддержку при планировании и выполнении исследования, научным сотрудникам отделения Т.Б.Загоровской и С.А.Клюшникову, а также ведущему науч. сотруднику отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН П.А.Сломинскому (руководитель отдела - Лауреат Государственной премии РФ, профессор С.А.Лим-борская) за помощь в выполнении молекулярно-генетической части работы. Автор признателен коллективу сотрудников IV отделения Неврологической клиники Клинического центра Сербии (КЦС) в Белграде (руководитель — профессор В.С.Костич) за помощь в выполнении клинической части исследования.
Клиническая характеристика болезни Паркинсона
Болезнь Паркинсона (БП) представляет собой второе по частоте (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративное заболевание человека, которое обычно начинается в позднем возрасте и встречается не менее чем у 2-4% всех лиц старше 65 лет в большинстве изученных популяций мира [De Rijk М. et al, 1995]. Заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение и клинически характеризуется классической тетрадой симптомов: тремором покоя, мышечной ригидностью, брадикинезией и постуральной неустойчивостью, а также рядом других клинических проявлений (вегетативные, когнитивные и эмоциональные нарушения). Первое клиническое описание болезни было сделано в 1817 году в монографии «An Essay on the Shaking Palsy» Джеймсом Паркинсоном, английским врачом, по имени которого заболевание позже получило своё название.
БП встречается повсеместно, и ее частота, по данным европейского исследования, среди лиц старше 65 лет составляет 1,6 на 100 человек. Распространенность БП оказывается возраст-зависимой, что показало так называемое Ротердамское исследование: в возрастной группе 55-64 лет частота БП составляла 0,3%, в группе 65-74 лет - 1%, в группе 65-74 лет - 3,1%, и в более пожилом возрасте (85-94 лет) она представлена с частотой 4,3% [De Rijk М. et al, 1995]. Также обнаружено, что БП чаще встречается у мужчин (соотношение полов 2) и у лиц, принадлежащих белой расе, а самая низкая частота отмечена у людей черной расы в Африке [Tanner С. et al,. 1996]. На распространенность БП географическая принадлежность не влияет [De RijkM. et al, 1997].
В целом на долю БП приходится около 75-80% всех случаев синдрома паркинсонизма, который в сочетании с другими синдромами может отмечаться и при ряде других заболеваний, что принято обозначать как «вторичный паркинсонизм» [Kostic V., 1998]. К вторичному паркинсонизму относят симптоматический паркинсонизм, который, как показано, вызван воздействием инфекционных, травматических и токсических средовых факторов или сосудистых заболеваний головного мозга, а также приёмом лекарственных препаратов. В клинической практике среди «паркинсонизм-плюс» синдромов наиболее часто встречаются: прогрессирующий надъядерный паралич, множественная системная атрофия и деменция с тельцами Леви, которая вызывает особый интерес в связи с достижениями нейроморфологии и молекулярной биологии. В ряду других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Вильсона-Коновалова, хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Галлервордена-Шпатца, спиноцеребеллярные дегенерации, нейроакантоцитоз и т.д., паркинсоноподобные синдромы встречаются в развёрнутой клинической картине болезни, и в этих случаях следует проводить дифференциальную диагностику с БП.
К первичному паркинсонизму относят БП и ювенильний (юношеский) паркинсонизм.
Клинический диагноз БП основывается на обнаружении хотя бы 2 из 4 симптомов из классической тетрады, или 2 из 3 главных двигательных симптомов заболевания: тремора покоя, мышечной ригидности и брадикинезии [Koller W. et al, 1997]. В качестве дополнительного критерия для диагноза БП Koller в 1992 году предложил включить положительный ответ на прием препарата леводопы (минимум 1000 мг в день в течение месяца) на протяжении одного года и больше. Поскольку, однако, положительный ответ на прием леводопы встречается и при ряде других нейродегенеративных заболеваний, в частности у 1/3 больных с мультисистемой атрофией в начале заболевания, то было предложено для исследования дофаминергического ответа использовать апоморфин - прямой агонист Д1 и Д2 рецепторов [Rajptun A. et al, 1990].
Гетерогенность клинических проявлений БП позволяет выделять подтипы этого заболевания на основании доминантных симптомов и знаков: дрожательный тип (гиперкинетический) и акинетико-ригидный (гипокинетический) тип БП. Существуют данные, что для гиперкинетической формы характерными являются медленное прогрессирование, и редкое развитие осложнений лечения, таких как галлюцинации и другие психозы, а также более редкое развитие деменции [Gerstenbrand F. et al, 1986]. Jankovic et al. предложили ввести новый подтип БП, в котором ведущим симптомом является постуральная неустойчивость и нарушение походки. Показано что характерным для этого типа являются: положительный невыраженный ответ на прием препарата леводопы, неблагоприятное течение заболевания и сокращение срока жизни [Rajptun A. et al, 1993]. Клинические исследования с использованием ПЭТ показали, что брадикинезия как клинический симптом БП лучше всего отражает степень выраженности дофаминергических нигростриарных нарушений [Vingerhoets F. et al, 1997].
Общая характеристика больных и обследованных семей
В наше исследование вошло 106 больных БП и 20 пациентов с наследственными дофа-чувствительным экстрапирамидным синдромами (ювенильный паркинсонизм, дофа-чувствительная дистония); все больные -этнические сербы. Контрольную группу составили 75 неврологически здоровых лиц сербского этнического происхождения. Распределение пациентов показано в таблице 4. Таблица 4. Распределение пациентов, вошедших в исследование.
Болезнь Паркинсона (n = 106) Дофа-чувствительные синдромы (n = 20) Спорадическая форма Семейная форма Ювенильный паркинсонизм ДЧД 96 10 15 5
Все больные БП проходили стационарное обследование и лечение в 4-м отделении Неврологической клиники Клинического центра Сербии (КЦС, Белград). Общая длительность наблюдения составила от 1 до 15 лет.
Критерием для постановки диагноза БП служило наличие хотя бы 2 из 3 главных двигательных симптомов заболевания (тремор покоя, мышечная ригидность и брадикинезия) в сочетании с положительным ответом на прием препаратов леводопы [Calne D. et al, 1992; Koler С et al, 1992]. Больным в условиях стационарного наблюдения, помимо детального неврологического осмотра и рутинных общеклинических тестов, был проведен по показаниям ряд современных лабораторных и инструментальных методов исследования с целью исключения ряда других нейродегенеративных состояний. Эти исследования включали: компьютерную и магнитно-резонансную томографию головного мозга, электромиографию и электронейромиографию, электроэнцефалографию, мультимодальные вызванные потенциалы, эхокардиографию, дуплекснное исследование экстракраниальных сосудов.
У всех больных тяжесть заболевания оценивалась количественно по стандартным шкалам UPDRS и Hoehn&Yarh, в том числе в динамике - через год с момента первого обследования. Повседневная двигательная активность пациентов расценивалась по модифицированной шкале Schwabe-England в фазе включения и выключения и выражалась в процентах. Также проводилось исследование интеллектуально-мнестических функций с помощью количественного теста MMSE, который у наших больных не опускался ниже критического уровня 24 балла.
В группу пациентов с БП вошли 65 мужчин и 41 женщина. Средний возраст наблюдаемых пациентов составлял 46,9±9,4 лет (от 30 до 70 лет). Длительность заболевания в среднем была 7,3±3,2 года (от 2 до 20 лет). Гипокинетическая форма заболевания наблюдалась у 39,6% пациентов (42 случая), 56,6% пациентов (60 случаев) имели гиперкинетически-ригидную форму, а дрожательная форма наблюдалась только у 3,8% пациентов (3 случая). Возрастной диапазон обследованных больных представлен на рисунке 4.
Анализ генетической предрасположенности к развитию болезни Паркинсона в сербской популяции
Среди лиц с БП наиболее изучено распространение двух мажорных мутантных аллелей гена CYP2D6 - 2D6 3 и 2D6 4. Armet al. впервые показали двукратное увеличение частоты 2Б6 4-аллеля среди лиц с БП (21,7% у больных с БП и 10,4%) в контрольной группе). Риск развития БП для носителей хотя бы одного аллеля 2D6 4 возрастал в 2,7 раз [Arm М. et al, 1992]. Эти результаты находили свое подтверждение в последующих исследованиях частоты двух мутантных аллелей - 2D6 3 и 2D6 4, когда риск развития заболевания для лиц с РМ-фенотипом увеличивается в 2,5 раза [Smith С. et al., 1993]. Подобные данные были получены и другими исследователями [Kurth М. et al., 1993; Lucotte G. et al., 1996; Agundez J. et al, 1995]. В Японии был описан новый полиморфный аллель гена CYP2D6 - замена Arg/Cys в положении 296 (6-й экзон). Данный полиморфный аллель был ассоциирован с БП с высокой степенью достоверности, и тем самым у носителей аллеля в гомозиготном состоянии риск развития БП был в 5,56 выше, чем у гетерозиготных носителей и у лиц, не имеющих данный аллель [Tsuneoka Y. etal, 1993].
Частота мутаций 2D6 3, по данным анализа 551 пациентов с БП, составляет 2,4%, а для контрольной группы, в которую вошло 1171 лиц, она составляла 1,66% [Joost О. et al, 1999]. Распространенность мутации 2D6 4 среди больных с БП составляла 20,25%, а в контрольной группе она была 19,51% [Joost О. et al, 1999]. Полученные данные позволили предположить, что дебризоквин-4-гидроксилаза защищает нейроны черной субстанции мозга человека от воздействия потенциальных нейротоксинов, что, несомненно, важно у лиц с РМ-фенотипом. Функциональное сходство дебризоквин-4-гидроксилазы и дофаминого транспортера позволяет предположить, что дебризоквин-4-гидроксилаза, возможно, взаимодействует с нейротрансмиттерами [Niznik Н. et al, 1990]. В настоящее время существуют и работы, в которых не подтверждена ассоциация мутантных аллелей гена CYP2D6 и БП [Sandy М. et al.,1996; Diederich N. et al, 1996; McCann S. et al.,1997].
