Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 19
1.1 Классификация папилломавирусов человека, вопросы эпидемиологии и
особенности клинической картины 19
1.1.1. Особенности структурно-функциональной организации генома и
классификация папилломавирусов человека 19
1.1.2 Эпидемиология аногениталыюй папнлломавпрусной инфекции... 23
1.1.3. Особенности клинической картины у больных аногениталыюй
папнлломавпрусной инфекцией 26
1.2. Влияние папилломавирусов человека на развитие онкологических заболеваний у
человека 31
Эпидемиологические доказательства связи аногениталыюй папнлломавпрусной инфекции с раком шенкн матки 32
Факторы риска инфицирования ВПЧ и развития псоиластических процессов. 35
Молекулярные механизмы индукции рака шейки матки 37
1.3. Характеристика иммунного статуса больных папнлломавпрусной инфскцисй41
Естественный иммунитет. Прямой антивирусный и антинролпферативный эффект цнтокипов 44
Адаптивный клеточно-оносредованный иммунитет при ВПЧ - инфекции 48
1.4. Современные методы идентификации вируса папилломы человека 53
1.4.1.Современные технологии детекции ВПЧ 56
1.4.2. Сравнение современных методов детекции папилломавнруса человека.
71
1.5. Современные направления в терапии аногениталыюй папнлломавпрусной
инфекции 76
Методы лечения больных папнлломавпрусной инфекцией с использованием средств для наружного применения 77
Иммунотерапия папнлломавпрусной инфекции 80
Гснотсрапня панилломавирусиой инфекции 83
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
2. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
2.1. Клнннко-лабораторныс исследования 87
2.2. Молскулнрно-биологичсскнс н иммуногсіїетическис методы исследовании 89
2.2.1 Клеточные штаммы и плазмидные векторы 89
Синтез олигонуклеотндных праймеров 89
Выделение ДНК из клеток крови 89
Выделение ДНК из клинического материала цервикалыюго канала и уретры. 90
Выделение РНК нз клеток крови 90
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК 91
Выявление ДНК папнлломавирусов и возбудителей урогенптальных инфекции в клинических образцах 91
Конструирование плазмндных векторов, содержащих полноразмерную иуклеотидную последовательность генома ВПЧ 16 и ген Е6 92
Проведение трансформации Е. coll плазмидной ДНК 93
2.2.10. Препаративное выделение плазмидной ДНК 94
Гсиотипнрованнс ВПЧ 96
Прямая твердофазная гибридизация 97
Определение полиморфизма гена р53 98
Определение Th - цнтокииового статуса в клетках цервпкалыюго канала.... 99
Количественная оценка мРНК цнтокннов с помощью ПЦР в реальном режиме времени 101
Определение цнтокииового профиля в цервикалыюм секрете 102
2.3. Статистическая обработка данных 103
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 104
3.1. Результаты скрининговых исследований населения Москвы и Московской
области на частоту выявления ВПЧ. Разработка системы генотппированни ВПЧ.
Изучение частоты ассоциаций между ВПЧ и другими возбудителями инфекций
урогениталыюго тракта 104
Разработка системы выявления и тиннрования ВПЧ в урогеннталыюм тракте 104
Результаты скрининга населения г. Москвы и Московской области на распространенность ВПЧ и его асоциацпй с другими возбудителями инфекций урогениталыюго тракта 109
3.2. Клиническая характеристика больных аногеннталыюй ПВН 112
3.3. Результаты изучения экспрессии цитокинов: INF-y, И-4, TNF-a и 11-12 и
цитокипового профиля в цсрвикальиом секрете у пациенток с напилломавируспой
инфекцией 121
Результаты исследования экспрессии цитокинов и цитокипового профиля у пациенток с ПШІ методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени 122
Зависимость между экспрессией цитокинов и характером течения ПВП. 130
Показатели измерения цитокипового профиля методом ИФА 133
3.4. Изучение физического статуса ДНК вируса папилломы человека 135
Определение количественного соотношения интегрированной и эписомалыюн форм ДНК вируса папилломы человека 135
Определение физического статуса ДНК ВПЧ с использованием мультппраймерной ПЦР 138
3.4.4. Определение физического статуса ДНК ВПЧ с использованием ПЦР в режиме
реального времени 140
3.5. Результаты изучения изменчивости генома человека и вируса папилломы
человека у пациентов с ПВП, ассоциированной с ВПЧ 16 типа 145
Изучение полиморфизма гена р53 у пациенток с ПВП методом конформацпоиного анализа нуклеотидных последовательностей 145
Определение вариантов аллелей гена Е6 ВПЧ 16 типа и их корреляция с полиморфизмом кодоиа 72 гена р53 пациенток с ПВП 147
Вариации нуклеотнднои последовательности LCR, Е6 и Е7 ВПЧ 16 типа. 148
Результаты изучения нуклеотидных замен 350G/T гена Е6 ВПЧ 16 типа. 152
Результаты изучения полиморфизма 72 кодоиа гена р53 у пациентов с ВПЧ методом аллсльснсцифичсской ПЦР 153
3.5.6. Выявление корреляции между полиморфизмом 350G/T гена Е6 ВПЧ 16-го
тина и аллелмюй изменчивостью 72 кодоиа р53 у пациентов с ПВП.... 155
3.6. Лечение пациентов с папплломавпруснон инфекцией 158
ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 162
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 177
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Apr - аргинин
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
КОИ - клеточно-опосредованный иммунитет
МПЭ - многослойный плоский эпителий
ОТ-ПЦР - реакция обратной транскрипции полимеразная цепная реакция
ПВИ - папилломавирусная инфекция
ПВЧ - папилломавирус человека
п.о. - пар оснований
Про - пролин
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РШМ - рак шейки матки
ASCUS - atypical squamous cell undertermined significance (атипические клетки плоского
эпителия неопределенного значения)
CIN-cervical intraepithelial neoplasia (цервикальная интраэпителиальная неоплазия)
IL — интерлейкин
y-INF -гамма-интерферон
SIL- squamous intraepithelial lesions (плоскоклеточное интраэпителиальное поражение)
SSCP - конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов ДНК
TGF-P- трансформирующий фактор роста
TNF - фактор некроза опухолей
Введение к работе
Актуальность проблемы
Аногенитальные бородавки, или аногенитальная папилломавирусная инфекция (ПВИ) человека является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний, передаваемых половым путем. ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) определяется у клинически здоровых женщин в 3-10% случаев, у пациентов с остроконечными кондиломами - в 50-80%, при доброкачественных поражениях шейки матки - в 12-35%, дисплазиях шейки матки - в 19-90%, внутриэпителиальных карциномах - в 58-89%, причем на ранних стадиях дисплазии ПВЧ обнаруживается чаще, чем на поздних (Franco E.L. et al., 1999; Brown D.R. et al., Ferlay J., 2001; 2002; Sherman M.E., et al., 2003).
Вирус папилломы человека впервые был выделен в 1933 г. из биологического материала, полученного от кролика, и в последующем стал первой экспериментальной моделью вирусного канцерогенеза. Согласно данным Киселева Ф.Л.(2000); Аполихиной И.А.(2002); Хансона К.ГЦ2002), при раке шейки матки (РШМ) в опухолевом материале в 90-100% случаях обнаруживается ДНК вируса папилломы человека. Постоянное носительство ВПЧ приводит сначала к возникновению дисплазии шейки матки легкой, затем к умеренной, и, наконец, к тяжелой степени, которая заканчивается развитием инвазивного плоскоклеточного рака (Koutsky L.A, 1997).
Вывод об этиологической роли ВПЧ при раке шейки матки имеет не только важное теоретическое, но и непосредственное практическое значение.
Согласно данным ВОЗ, в настоящее время в мире ежегодно регистрируется до 500 000
новых случаев рака шейки матки, который занимает 7-е место среди всех
злокачественных опухолей и 3-е место среди всех раковых заболеваний у женщин после рака молочной железы и рака толстой кишки.
Высокая контагиозность вируса и половой путь передачи способствуют его широкому распространению среди различных групп населения, в особенности
7 сексуально активных лиц. С точки зрения эпидемиологии к факторам риска развития
РШМ и состояний, ему предшествующих, относятся: раннее начало половой жизни, высокая сексуальная активность, частая смена половых партнеров, несоблюдение половой гигиены, наличие сопутствующих ИППП, вирусных инфекций, а также иммунодефицит, курение, использование оральных контрацептивов. Широкое распространение вариантов такого поведения среди молодежи вызывает необходимость проведения скрининговых программ, направленных на активное выявление бессимптомных носителей вируса, своевременное обнаружение и лечение больных ПВИ. В российской научной медицинской литературе до настоящего времени отсутствуют систематические данные о частоте выявления ВПЧ разных типов у пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, обращающихся в специализированные лечебно-профилактические учреждения, а также о сочетании ВПЧ с другими инфекциями, передаваемыми половым путем. Вместе с тем получение таких сведений является совершенно необходимым для понимания эпидемиологии ПВИ и взаимоотношения ВПЧ с другими возбудителями ИППП именно в Российской популяции, переживающей последствия сексуальной революции и социальные потрясения (затяжные военные конфликты, терроризм, появление беженцев, лиц, без определённого места жительства, резкое «омоложение» ИППП).
В 1989 г. была предложена концепция «инициирующего фактора» (zur Hauzen, 1991), согласно которой ВПЧ сам по себе не вызывает злокачественной трансформации, однако способствует развитию предракового состояния. При этом чрезвычайно важным является генотип ВПЧ и возможность ко-инфицирования ВПЧ разных типов (Thomas К.К., 2000).
Онкогенный потенциал ВПЧ существенно варьирует; по способности инициировать диспластические изменения и рак ВПЧ условно разделены на группы «высокого», «среднего» и «низкого» онкогенного риска опухолевой трансформации инфицированного эпителия. Типы ВПЧ 6, 11, 42, 43, 44 классифицированы как типы низкого риска развития
8 РШМ, типы 16, 18, 48, 56 - высокого риска. При РШМ типы 16 и 18 превалируют над
другими типами вирусов. Наиболее часто встречающимся определен 16 тип вируса,
который выявляется в 50 - 70% случаев РШМ (Koutsky L., 1997; Zur Hausen Н. 1999, Xi
L.F. et al., 2002). В связи с вышеизложенным, в целях определения своевременного
прогноза и предупреждения развития РШМ вследствие перенесенной ПВИ представляется
актуальным своевременное и качественное определение генотипа вируса и разработка
методов генотипирования, позволяющих проводить большие скрининговые программы с
одновременным быстрым определением различных генотипов ВПЧ.
Как известно, определяющим фактором пути развития патологического
процесса при взаимодействии вируса папилломы человека и макроорганизма: прогресса,
персистенции или элиминации вируса из организма, - является иммунный ответ
организма человека на внедрение возбудителя. Для развития этих процессов важен
баланс между двумя эффекторными механизмами иммунитета - ТЫ (клеточно
опосредованным) и Th2 (гуморальным).
На сегодняшний день уже не вызывает сомнения, что риск заражения ВПЧ связан с нарушением клеточного иммунитета (Critchlow et al, 1992; 1998; Hillemans et al, 1996; Palefsky et al, 1990; 1997; 1998), определяемого, в частности, продукцией барьерными эпителиальными клетками (включая цервикальные кератиноциты) и Т-лимфоцитами различных видов цитокинов. Существует достаточное количество доказательств, указывающих на то, что цитокины, в особенности TGF-p, TNF, IL-2, IFNy, могут оказывать влияние на рост ВПЧ-инфицированных клеток, ингибируя экспрессию ВПЧ -генов, включая гены Е6 и Е7, обладающих высоким проонкогенным потенциалом. (Malejczyk et al, 1992, 1994; Woodworth et al, 1990).
Работы по изучению иммунорегуляции при ПВИ фокусируются в последние годы на функциональной дихотомии цитокинов, обусловленной секретирующими их Т-хелперами и подразделяемыми на Th 1 типа, стимулирующие клеточный иммунитет (секретируют
IFNy, TNF и IL-2) и Th 2 типа, стимулирующие гуморальный иммунитет (секретируют IL-4, 5, 10 и 13) (Picker et al, 1995; Mosmann et al, 1996; Prussin, 1997; Nakagawa et al, 2000).
Существуют данные, указывающие на наличие ассоциации между Th 1 - профилем
цитокинов и элиминацией ВПЧ и, напротив, данные о взаимосвязи между Th 2 —
профилем и предрасположенностью к трансформации пораженных ВПЧ тканей в РШМ
(Franco Е., et al., 1999). В свете изложенного, представляется необходимым проводить
изучение цитокинового профиля пациентов с ПВИ в целях выявления возможных
предиктивных факторов и групп риска для своевременного выявления
предрасположенности больных к развитию злокачественной трансформации тканей при ПВИ. В отечественной литературе ссылки на работы подобного плана отсутствуют.
Особую роль в развитии рака шейки матки играют генетические факторы, ответственные за наличие предрасположенности к заражению ВПЧ, а также дефекты генов, ответственные за повреждения ДНК и степень клеточной пролиферации.
Одним из основных механизмов неопластической трансформации клеток является повреждение генов, контролирующих апоптоз. Известно, что ген р53 кодирует ядерный белок, модулирующий экспрессию генов, отвечающих за репарацию ДНК, деление клеток и программируемую клеточную смерть. Аминокислота аргинин, входящая в состав белка р53, во многом определяет его проонкогенные свойства. Показано, что наличие у женщин гомозиготное по аргинину в составе белка (р53 Arg/Arg), характеризует их как относящихся к группе высокого риска развития рака шейки матки. В свою очередь, полиморфизм гена Е6 и других функционально активных областей генома ВПЧ может приводить к изменению их свойств с высокой степенью вероятности трансформации ДНК вируса в интегрированную форму с повреждением генома клетки человека и развитием РШМ. Связываясь с белком Е6 ПВЧ 16 типа, продукт гена р53 может оказывать значительное влияние на развитие ВПЧ-опосредованного рака шейки матки, приводя к запуску механизмов неконтролируемой пролиферации. Таким образом, чрезвычайно
важное значение в понимании механизмов развития неопластических процессов шейки матки, развивающихся вследствие перенесенной ПВИ или на ее фоне, имеет изучение полиморфизма генов возбудителя и человека, а также процессов, лежащих в основе взаимодействия между этими факторами.
В настоящее время установлено, что решающую роль в канцерогенезе при ПВИ
играют продукты генов Е6 и Е7 ВПЧ «высокого» онкогенного риска (16 и 18); в их
присутствии значительно возрастает вероятность прогрессии интраэпителиальной
неоплазии, нередко предшествующей РШМ. Однако, в некоторых случаях вирусный
геном в течение нескольких месяцев может быть спонтанно элиминирован из организма
(Но G. et al., 1998), что чаще всего ассоциируется с персистенцией вируса в
эписомальной форме. И, напротив, интеграция вирусной ДНК ВПЧ 16 типа индуцирует
нестабильность клеточного генома, нарушения в хромосомах и активирует механизм
прогрессии неоплазии от дисплазии тяжелой степени к раку. В связи с вышеуказанным,
чрезвычайно важным для понимания процессов злокачественной трансформации
инфицированных тканей является точное определение физического статуса ДНК ВПЧ 16
типа, что напрямую связано с изучением соотношений белков Е1, Е2, Е6 и Е7 ВПЧ
«высокого» онкогенного риска (16 и 18 типов), играющих определяющую роль в
канцерогенезе при ПВИ.
Таким образом, многие вопросы, касающиеся распространенности, факторов риска
заражения и патогенеза ПВИ в настоящее время являются в достаточной степени
изученными. Вместе с тем следует констатировать, что в клинической практике до
настоящего времени отсутствует четкий алгоритм обследования пациентов с
папилломавирусной инфекцией и оценки факторов риска злокачественной
транформации тканей, основанный на комплексной оценке различных факторов, в первую
очередь, молекулярных и иммуногенетических процессов, характеризующих
11 папилломавирусную инфекцию и касающихся как возбудителя, так и инфицированного
человека.
Существующие в настоящее время методы лечения больных ВПЧ-инфекцией не
достаточно эффективны вследствие проблемы частых рецидивов, возникающих не только
в связи с реинфицированием, но и с реактивацией процессов репликации вируса,
выщеплением его генома из хромосомы человека и переходом в активное состояние. Это
обстоятельство диктует необходимость поиска средств терапии, воздействующих как на
возбудителя, так и на макроорганизм.
В последнее время появилось много сообщений об успешном использовании для
лечения папилломавирусной инфекции иммуномодулирующих препаратов из группы
интерферонов, усиливающих цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и
стимулирующих их активность в отношении инфицированных клеток. Для лечения ПВИ
препараты интерферонов используют местно и для системного введения. (Манухин И.Б. и
др., 1998; Sherman М.Е. et al., 1998; Hengge U.R., 2001). Вместе с тем, лечение часто
назначается эмпирически, без учета индивидуальных особенностей больного.
Индивидуализация терапии является одним из требований современной клинической
медицины и преследует цель повысить эффективность назначенного лечения, свести к
минимуму риск побочных осложнений, уменьшить число рецидивов.
В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования является разработка
иммунологических и молекулярных методов диагностики папилломавирусной инфекции у
больных и определение формирования злокачественной трансформации эпителиальных
тканей.
Задачи исследования:
1. Изучить распространенность папилломавирусной инфекции путем скрининга
жителей г. Москвы и Московской области. Установить частоту регистрации
генотипов вируса папилломы человека различной степени онкогенного риска.
12 Выявить значимые ассоциации вируса папилломы человека с другими
возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.
Изучить экспрессию цитокинов гамма-интерферона, фактора некроза опухоли, интерлейкинов 4 и 12 и их профиль в секрете цервикального канала пациенток папилломавирусной инфекцией.
Разработать метод генотипирования вируса папилломы человека, основанный на твердофазной гибридизации продуктов амплификации с типоспецифическими олигонуклеотидами зондами.
Разработать методы оценки физического состояния вирусов папилломы человека и определить с их помощью количественные соотношения форм ДНК вирусного генома в инфицированных тканях пациенток папилломавирусной инфекцией.
Изучить полиморфизм основного смыслового участка - 72 кодона гена р53, ответственного за регуляцию нарушений в системе апоптоза у больных различными клиническими формами папилломавирусной инфекции, вызванной 16 типом вируса.
Исследовать изменчивость генома 16 типа вируса, выделенного от пациентов с различными клиническими формами инфекции, по вариациям нуклеотидных последовательностей функционально активных областей ДНК вируса - LCR, Е (гены Е6, Е7).
Разработать диагностические критерии риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией с учетом данных о физическом состояния вируса папилломы человека и изменчивости его генома, полиморфизма гена р53 и цитокинового статуса больных.
Положения, выносимые на защиту
Распространенность папилломавирусной инфекции среди населения Москвы и Московской области, обращавшегося в клинику для исключения инфекций, передаваемых половым путем в период с 1998 по 2003 гг. составляет 14%. В структуре генотипов преобладают типы вируса папилломы человека среднего (31, 33, 35, 52 - 38,6%) и высокого (16, 18 - 29,8%) онкогенного риска. Вирус папилломы человека часто сочетается с облигатными (C.trachomatis) и условнопатогенными (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis) возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.
Разработанный метод генотипирования вируса, использующий в своей основе гибридизационный подход с прямой регистрацией флуоресценции типоспецифического зонда, связанного с продуктом, отличается высокой специфичностью и чувствительностью по сравнению с методами, основанными на полимеразно цепной реакции с электрофоретической детекцией ампликонов и иммуноферментного анализа.
Экспрессия цитокинов: гамма-интерферона, фактора некроза опухоли, интерлейкинов 4 и 12 в секрете цервикального канала у женщин папилломавирусной инфекцией связана с ее клинико-морфологическими формами: цитокиновый профиль больных манифестными формами инфекции соответствует преобладанию клеточного (ТЫ) варианта иммунного ответа на инфекцию; с латентными формами преобладающий вариант цитокинового профиля не определяется. У больных папилломавирусной инфекцией цитологически определяемой интраэпителиальной неоплазией легкой степени преобладает гуморальный (Th2) вариант иммунного ответа, являющийся предиктивным фактором злокачественного перерождения тканей. Наличие цитокинов ТЫ профиля способствует спонтанной элиминации вируса. Присутствие цитокинов
14 Th2 профиля позволяет прогнозировать длительное рецидивирующее течение
инфекционного процесса с вероятным развитием злокачественной трансформации
тканей.
Метод определения физического состояния ДНК вируса папилломы человека на основе технологии ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией позволяет выявлять одновременное присутствие и количественное соотношение у пациенток с папилломавирусной инфекцией нескольких форм ДНК вируса высокого онкогенного риска: эписомальной, интегрированной и смешанной. У 14,3% пациенток (лица с интраэпителиальной неоплазией - CIN 1) определяется интегрированная, у 33,3% -смешанная и у 52,4% - эписомальная форма ДНК вируса.
Присутствие аллеля Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 обеспечивает повышенную восприимчивость макроорганизма к инфицированию вируса папилломы 16 типа. Женщины с гетерозиготной формой белка р53 в значительно меньшей степени подвержены инфицированию вирусом, чем женщины, гомозиготные по аргинину (38% против 50% по результатам метода конформационного полиморфизма и 17% против 83% по данным метода аллельспецифической ПЦР).
Высокая частота замен нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях функционально активных областей генома вируса папилломы человека 16 типа (LCR, Е6 и Е7) свидетельствует об изменениях их свойств, высокой степени вероятности трансформации ДНК вируса в интегрированную форму и зависит от формы заболевания. Наиболее частым вариантом являются замены Т на G в положении 350.
Определяющими критериями риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией являются: обнаружение вируса 16 типа; проонкогенный гуморальный (Тп2) профиль
15 цитокинов в цервикальном секрете; обнаружение интегрированной формы ДНК
вируса; гомозиготность белка р53 по аргинину больных; наличие нуклеотидных
замен в функционально активных областях (LCR, Еб, Е7) генома вируса
папилломы человека.
Научная новизна.
Для изучения физического статуса ДНК ВПЧ 16 типа разработан метод real-time ПЦР, основанный на оценке количественного соотношения интегрированной и эписомальной форм ДНК вируса. Предложенный метод позволяет определять статус ДНК ВПЧ 16 типа для эписомальной, интегрированной и смешанных форм.
Впервые проведено изучение ассоциативных связей между полиморфизмом гена р53 и генома ВПЧ у пациенток с ПВИ путем исследования смыслового участка гена р53 - 72 кодона, позволившее оценить предрасположенность женщин к инфицированию ВПЧ в зависимости от состояния аллельной изменчивости 72 кодона р53.
Впервые на основании анализа полиморфизма генов Е6 ВПЧ 16 типа и исследования его корреляции с полиморфизмом кодона 72 гена р53 изучен механизм запуска неконтролируемой пролиферации клеток и супрессии апоптоза у пациентов с ПВИ.
Впервые на основании изучения вариаций геномной ДНК (сравнение нуклеотидных последовательной 3' конца LCR, Е6 и Е7 открытых рамок считывания ДНК) исследована онкогенная роль ВПЧ 16 типа, позволившая оценивать вероятность перехода ДНК вируса в интегрированную форму.
На основании данных об экспрессии генов цитокинов у пациенток с ПВИ впервые сформулированы представления о соотношениях уровня цитокинов и их матричной РНК как о показателе функционального резерва организма обследуемых пациенток, впервые
16 охарактеризованы закономерности ТЫ и Тп2 цитокинового ответа больных с
различными клиническими формами ПВИ
Практическая значимость работы.
На основании проведенных исследований получены сведения об уровне распространенности инфицированности ВПЧ среди жителей Москвы и Московской области; определены высоко достоверные (Р <0,001) ассоциации между инфицированием ВПЧ и распространенными бактериальными возбудителями инфекций, передаваемых половым путем (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis), что может служить основанием для разработки профилактических мероприятий, направленных на предупреждение развития РШМ.
Впервые разработан и предложен для использования в практике метод типирования папилломавирусов человека, основанный на твердофазном флуоресцентно-гибридизационном анализе продуктов амплификации.
Впервые для нужд практического здравоохранения определены диагностические критерии риска развития злокачественной трансформации инфицированной ВПЧ ткани с учетом показателей цитокинового статуса, полиморфизма генома человека, а также физического статуса ДНК и полиморфизма генома ВПЧ 16 типа. Определение корреляции между уровнем цитокинов (1 и 2 типов) в цервикальном секрете и физическим статусом ВПЧ может оказаться перспективным для прогнозирования риска развития неопластических заболеваний шейки матки.
На основании изучения подходов к лечению и тактике ведения пациентов с ПВИ с учетом индивидуальных особенностей клинической картины заболевания и иммунно-генетической характеристики выработаны критерии для индивидуализации лечения. Разработан эффективный метод терапии больных с распространенными и
17 рецидивирующими формами ПВИ препаратами рекомбинантного интерферона (ИНТРОН
А).
Апробация материалов диссертации:
Основные положения диссертации обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы вирусных инфекций, передаваемых половым путем (папилломавирусы человека, вирусные гепатиты, герпесвирусные инфекции): эпидемиология, клинико-диагностические особенности, принципы ведения больных» (Москва, 2000); VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем и хронических дерматозов» (Екатеринбург, 2002); Всероссийском совещании «По совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (Москва, 2003); Первом Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Современные направления развития диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004); 8 ежегодной конференции Европейского филиала Всемирного союза против болезней передающихся половым путём (Греция, 2004); Всероссийской научно-практической конференции дерматовенерологов «Новые технологии в организации дерматовенерологической помощи населению Российской Федерации» (Москва, 2004); IX Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2005). Объём и структура работы:
Диссертационная работа состоит из: введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 208
18 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, имеет 23 таблицы.
Указатель литературы включает 26 отечественных и 273 иностранных источника.
