Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Фоторецепторные системы растений 10
1.1.1. Структура и свойства фитохрома 11
1.1.2. Механизм передачи фитохромного сигнала 14
1.1.3. Реализация фитохромного сигнала в клетке 17
1.1.4. Влияние света на темновое дыхание . 20
1.1.4.1. Влияние света на активность цикла трикарбоновых кислот 23
1.2. Общая характеристика сукцинатдегидрогеназной системы 25
1.2.1. Метаболические пути, в которых участвует 25
сукцинатдегидрогеназа
1.2.2. Структура белковой молекулы сукцинатдегидрогеназы 28
1.2.3. Генетическая детерминация сукцинатдегидрогеназы 37
1.3. Молекулярные аспекты регуляции сукцинатдегидрогеназы 39
1.3.1. Регуляция работы фермента интермедиатами клетки 40
1.3.2. Регуляция сукцинатдегидрогеназны светом . 42
1.3.3. Регуляция сукцинатдегидрогеназы на генетическом уровне 45
Глава 2. Экспериментальная часть 48
2.1 Цели и задачи 48
2.2 Объекты исследования 49
2.2.1 Объекты исследования 49
2.2.2 Постановка эксперимента по созданию светового режима 49
2.2.3 Определение активности фермента 51
2.2.5 Схема очистки сукцинатдегидрогеназы из зеленых листьев кукурузы
2.2.6 Электрофоретическое исследование очищенного препарата фермента
2.2.7 Экстракция суммарной РНК из листьев растений 54
2.2.8 Проведение обратной транскрипции 55
2.2.9 Подбор специфических праймеров 55
2.2.10 Проведение полимеразной цепной реакции 55
2.2.11 Секвенирование ПЦР-продукта 56
2.2.12 Проведение Нозерн дот-гибридизации 56
2.2.13 Проведение ПЦР в реальном времени 57
2.2.14 Статистическая обработка данных 57
2.3 Результаты и их обсуждение 58
2.3.1 Действие гетерогенного света на активность 59
сукцинатдегидрогеназы
2.3.1.1 Влияние гетерогенного света на активность 59
сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы
2.3.1.2 Изменение активности сукцинатдегидрогеназы листьев кукурузы при смене светового режима 59
2.3.1.3 Активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы, экспонируемой в условиях «темнота-свет» 62
2.3.1.4 Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы при деэтиоляции растений 64
2.3.2. Очистка и физико-химические свойства СДГ 66
2.3.2.1 Влияние белого света на активность изолированного препарата фермента сукцинатдегидрогеназы 69
2.3.2.2 Очистка фермента из листьев кукурузы 69
2.3.2.3 Действие гетерогенного света на изолированную молекулу сукцинатдегидрогеназы 69
2.3.2.4 Влияние АТФ на активность изолированной 72
су кци натдеги дро геназы
2.3.2.5 Действие АДФ на активность сукцинатдегидрогеназы 73
2.3.2.6 Влияние различных солей на активность сукцинатдегидрогеназы
2.3.2.7 Влияние хлорида калия на 'активность сукцинатдегидрогеназы
2.3.3 Роль фитохромной системы в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы в растениях в условиях различного светового режима
2.3.3.1 Влияние КС и ДКС на активность сукцинатдегидрогеназы
в листьях кукурузы
2.3.3.2 Влияние КС и ДКС на функционирование сукцинатдегидрогеназнои системы в листьях арабидопсиса дикого типа
2.3.3.3 Влияние КС и ДКС на сукцинатдегидрогеназу в листьях арабидопсиса, мутантного по гену фитохрома А
2.3.3.4 Влияние КС и ДКС на сукцинатдегидрогеназу листьев арабидопсиса мутантный по гену фитохрома В
2.3.4 Механизм регуляции активности сукцинатдегидрогеназы фитохромной системой 96
2.3.4.1 Идентификация гена, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы
2.3.4.2. Секвенирование продукта, полученного методом пцр с ген-специфицескими праймерами 101
2.3.4.3 Механизм регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы 103
2.3.4.3.1 Изменение количества мрнк гена sdhl-2 при разных 103 световых режимах
2.3.4.3.,2 Изменение экспрессии сукцинатдегидрогеназы в 106 листьях арабидопсиса при разных световых режимах
2.3.4.3.3 Уровень экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях 112 кукурузы в разных условия освещения
Заключение 118
Выводы 122
Литература
- Механизм передачи фитохромного сигнала
- Регуляция работы фермента интермедиатами клетки
- Экстракция суммарной РНК из листьев растений
- Влияние белого света на активность изолированного препарата фермента сукцинатдегидрогеназы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из наиболее интересных проблем современной физиологии растений является взаимодействие процессов дыхания и фотосинтеза. Цикл Кребса играет центральную роль в жизнедеятельности растений, обеспечивая темновое дыхание, а также многие анаплеротические реакций [46, 15].
Одной из ключевых реакций цикла, сопряженной с запасанием энергии, является реакция окисления сукцината до фумарата, катализируемая сукцинатдегидрогеназой (СДГ, КФ 1.3.99.1), единственным ферментом цикла трикарбоновых кислот, встроенным во внутреннюю мембрану митохондрий. В процессе протекания данной реакции образуется ФАДНг, который может использоваться как источник энергии для различных процессов. СДГ -компонент не только цикла Кребса, но и ЭТЦ митохондрий, поэтому его регуляция связана с функционированием сразу двух ключевых процессов.
Изучение роли отдельных метаболитов клетки в регуляции энергетических процессов клетки, в том числе и дыхания, в большинстве своем, направлена на выяснение способов влияния различных интермедиатов (АТФ, различных ионов, оргкислот и др.) на работу целостной митохондриальной системы, а не отдельных ее ферментативных компонентов [35, 109, 120]. Кроме того, недостаточно много данных о прямом воздействии света различной интенсивности и спектрального состава на ферментативные системы, содержащие хромофорные группировки, такие как ФАД и ФМН [44]. Такие исследования позволяют оценить механизм прямого и опосредованного влияния на работу фермента.
Обзор литературы показал противоречивость данных по влиянию света на дыхание и ЦТК при изучении ферментативных систем, однако сам факт регуляции их светом уже никем не оспаривается [30, 27]. Данные о влиянии света на дыхательный метаболизм весьма многочисленны, однако работ,
посвященных выяснению механизмов действия света на активность дыхательных ферментов практически нет.
Одним из возможных опосредованных механизмов, с помощью которого может осуществляться регуляция этих процессов, может быть участие фитохромной системы. Ранее было установлено, что фитохромная система участвует в регуляции активности некоторых ферментов дыхания растений [94]. Свое воздействие фитохромая система может оказывать либо самостоятельно влияя на функционирование ферментов, либо проявлять свое действие через различные вторичные мессенжеры, такие как ионы Са +, G-белки, цАМФ [5, 51]. Эффект фитохрома может проявляться в изменении состояния клеточных мембран, в том числе и митохондриальной, или воздействием на генетический аппарат клетки посредством различных сигнальных систем, регулируя интенсивность экспрессии гейов [34,95,157]. Не до конца изученным остается вопрос о механизме переключения метаболизма растительной клетки при изменении светового режима. Исследование отдельных ферментативных структур и способов их регуляции необходимо для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение механизмов световой регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние гетерогенного и красного и дальнего красного света на активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы.
Определить роль различных форм фитохрома в регуляции СДГ-активности, изучив действие КС и ДКС на мутантные растения А. thaliana.
Получить гомогенный препарат СДГ из зеленых листьев кукурузы и определить степень воздействия на него гетерогенного света.
Исследовать действие различных концентраций АТФ и АДФ на активность перпарата сукцинатдегидргеназы.
Разработать специфические праймеры для субъединицы А СДГ кукурузы и идентифицировать ее ген в зеленых листьях кукурузы.
Методом Нозерн дот-гибридизации определить уровень мРНК гена СДГ в листьях арабидопсиса при изменении светового режима.
Провести количественный анализ уровня экспрессии гена sdhl-2 арабидопсиса и sdha кукурузы в условиях разного светового режима методом ПЦР в реальном времени.
Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о способах переключения энергетического метаболизма растительной клеткой при изменении светового режима.
Изучен механизм световой регуляции СДГ активной формой фитохрома А и установлено, что его действие проявляется в регуляции экспрессии гена, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы. Фотоактивный фитохром блокирует транскрипцию гена sdhl-2 в листьях арабидопсиса и sdha в листьях кукурузы, что приводит к уменьшению количества их мРНК в клетке, что четко коррелирует с угнетением активности фермента в листьях растений под действием красного света.
Получение гомогенного препарата СДГ позволило установить, что его активность сильно зависит от энергетического состояния клетки и концентрации АТФ и АДФ. Показано, что повышение количества АТФ в среде приводит к ингибированию СДГ. Кроме того, выявлена активирующая роль ионов СГ на скорость работы фермента. Установлено, что световая регуляция СДГ опосредованна через фитохромную систему. Исследования мутантных форм A. thaliana позволили установить, что в качестве регулятора
функционального состояния фермента выступает фитохром А, активная форма которого ингибирует активность СДГ.
Работа расширяет и углубляет знания о механизмах регуляции СДГ в листьях растений в условиях изменения светового режима. Установленное участие фитохромной системы, в частности фитохрома А, в регуляции СДГ является одним из механизмов координирующих взаимосвязь фотосинтеза и дыхания растений. Полученные данные по экспрессии генов sdhl-2 арабидопсиса и sdha кукурузы указывают на функциональные изменения в работе генетического аппарата клетки в течение суток в' зависимости от источника энергии.
Практическая значимость. Знание механизмов взаимодействия энергетического и конструктивного метаболизма клетки открывает возможности регулирования их соотношения, что способствует повышению продуктивности и урожайности растений.
Гомогенные препараты СДГ могут быть использованы для регенерации ФАД или ФАДН при исследовании других ферментных систем, в аналитических измерениях сукцината в биологических образцах, в иммуноферментном анализе многих антигенов в качестве фермента-маркера митохондрий, в пищевой промышленности для исследования качества продуктов.
Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к пониманию функционирования растительного организма как целостной системы. Полученные данные по экспрессии СДГ при изменении светового режима создают условия для решения проблем, связанных с повышением продуктивности и урожайности, а также устойчивости растений к неблагоприятным факторам.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических
кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 7-ой, 9-ой и 10-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пушино, 2003, 2005, 2006), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), Научно-практической конференции «Регуляция продуктивного процесса сельскохозяйственных растений» (Орел, 2006), Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006), ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2005,2006).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 17 публикациях - 10 статьях и 7 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (169 источников). Иллюстрационный материал включает 28 рисунков и 6 таблиц.
Механизм передачи фитохромного сигнала
Как стало известно в последнее время, различные реакции растений на свет проявляются через разные фитохромы [133].
Фитохром А. Фитохром А (ФитА) участвует в регулировании многих аспектов деэтиоляции проростков, включая ингибирование удлинения гипокотиля, увеличение семядолей, изменении экспрессии генов и синтезе антоцианов, и т.д. [52, 133]. Эти ответы отсутствовали в проростках с отсутствием ФитА. Также фитохром А является важным для восприятия растением длины дня [121]. Фитохром В. Фитохром В [ФитВ], как полагают, является главным фитохромом, ответственным за реакцию растений на затенение [147]. Полог, образуемый листвой других растений, не только снижает интенсивность света, но и приводит к изменению его спектрального состава. Листья растений благодаря спектральным свойствам хлорофилла в большей мере абсорбируют красные лучи, и в результате свет, достигающий растений под пологом листвы, характеризуется соотношением красный/дальний красный свет, сдвинутым в сторону дальнего красного света. Таким образом, возникает эффект, противоположный деэтиоляции: вытягивание стебля, уменьшение площади листа, усиление апикального роста и раннее зацветание [145].
Фитохромы С, D и Е. В результате исследования фитохромных мутантов стало ясно, что ФитО и ФитЕ также участвуют в реакциях растения на затенение, например удлинение черешка и ускорение зацветания, ФитЕ регулирует удлинение междоузлий [61]. Фитохром Е также играет роль в запуске прорастания семян [123]. Исследования показали, что ФитС может играть роль в регулировании увеличения площади листа, и в восприятии длины дня [129].
Каждый фитохром, как предполагается, имеет различную физиологическую роль, дефицитные формы растений по различным типам фитохромов, позволяют определить роль каждого их рецепторов в регуляции определенных процессов и структур клетки [100, 166]. Некоторые ответы были связаны с определенными фитохромами, хотя, тем не менее, кажется, существует наложение между функциями отдельных фитохромов в пределах растения [122].
Большинство исследователей предлагает, что фитохромы действуют через регулирование уровня работы гена. Показана зависимость экспрессии некоторых генов, в значительной степени тех, которые кодируют ферменты и другие компоненты фотосинтетических процессов, регуляция которых осуществляется посредством фитохрома [156, 82]. С другой стороны, некоторые фитохром-зависимые ответы объясняются быстрыми изменения в меж - или внутриклеточном ионном балансе [142]. Некоторые ответы при росте также происходят весьма быстро, в пределах минуты [146, 117], кроме того, вся цепь трансдукции сигнала, при регулировании экспрессии генов ядерного генома также происходит достаточно быстро. Эти явления подразумевают цитоплазматический механизм, в котором фоторецептор, путем быстрых изменений концентрации ионов, непрерывно контролирует гомеостаз клетки. Каждый фитохром может иметь, по крайней мере, два независимых механизма воздействия: один, выражается в изменении экспрессии отдельных генов и другого, происходящего значительно быстрее и обратимо - это контроль клеточного ионного баланса.
Механизм действия фитохрома состоит из двух процессов на уровне молекулы фоторецептора: восприятие светового сигнала и его трансдукции в биохимический сигнал. Таким образом, фитохром проявляет двойные молекулярные функции: сенсорная функция, ответственная за восприятие светового сигнала, и регулирующая функция, в которой воспринятая информация передается по путям трансдукции сигнала [153]. Относительно первого механизма, регулирование фитохромом экспрессии гена, существуют два механизма. Первый заключается в том, что фитохромы рассматриваются как киназы, которые действуют на множественные субстраты, регулируя, таким образом, экспрессию различных генов. Другой -фитохромы имеют один или более специфических партнеров, которые направляют сигнал, селективно контролируя экспрессию генов.
Согласно представлениям Э.У. Сазерленда передача любого сигнала в клетках животных, как правило, включает следующую цепь событий, в результате которых происходит передача сигнала через различные промежуточные соединения к месту восприятия сигнала, которым может быль либо белковая молекула, либо генетический материал клетки:
В качестве лигандов могут выступать гормоны, простагландины и другие биологически активные вещества, а также свет. Каждый из гормонов активирует несколько типов рецепторов. Возбуждение гормоном хотя бы одного из них обычно связано с поступлением Са снаружи в цитоплазму или выходу его из внутриклеточного депо. Дальнейшую передачу сигнала с рецептора осуществляют G-белки или тирозиновые киназы, причем последние сами служат рецепторами факторов роста. Общим свойством этих киназ является их способность к димеризации и аутофосфорилированию. Известен также случай, когда рецепторами являются ионные каналы. Это никотиновые холинорецепторы, представляющие собой Na7Ca2f-каналы. Рецепторами стероидных гормонов служат белки, способные непосредственно переносить их в ядро. Активность семейства рецепторных Ser/Thr-киназ, сопряженных с G-белками, регулируются Са -кальмодулином (КМ). Са -КМ связывается также непосредственно с гетеротримерными G-белками - с их Р-субъединицей [1].
Есть данные о том, что в функционирование фитохрома также вовлечены вторичные посредники - Ca2f, цАМФ и цГМФ, однако, какова роль и место каждого из них в передаче светового сигнала, пока неясно [5].
Регуляция работы фермента интермедиатами клетки
Сукцинатдегидрогеназа занимает уникальное положение в системе метаболических процессов протекающих в клетке. Функционируя в цикле трикарбоновых кислот, СДГ катализирует реакцию окисления сукцината. Этот цикл обеспечивает клетку не только субстратами для энергетического метаболизма, такими как НАДН и ФАДН2 которые далее используются в ЭТЦ митохондрий, но может служить поставщиком интермедиатов для конструктивного метаболизма.
Кроме того, СДГ на начальных этапах онтогенеза, при прорастании семян, принимает участие в утилизации сукцината образующегося в результате работы глюконеогенетических процессов. При этом фермент также участвует в поставке субстратов для биосинтетических процессов.
Являясь компонентом электронтранспортной цепи митохондрий, СДГ принимает участие в образовании энергии в процессе «темнового дыхания». Митохондрия поставляет АТФ для нужд клетки в отсутствии фотосинтеза. На свету же эту роль берет на себя фотосинтетическая электронтранспортная цепь.
Все выше сказанное свидетельствует о важности этого фермента в метаболизме клетки растений. Для того чтобы растительная клетка нормально функционировала, ей необходимо четко регулировать все эти процессы. Поскольку связующим звеном выступает СДГ, контроль может осуществляться на этом уровне. Для того чтобы понять, как осуществляется контроль за переключением клетки с одного метаболического пути на другой, очень важно знать механизмы регуляции СДГ. Знание этих механизмов позволит понять возможные способы, которыми клетка регулирует свой гомеостаз.
Сукцинатдегидрогеназа, являясь мощным, тонко моделируемым многими факторами ферментом, занимает ключевое положение в регуляции дыхания митохондрий и играет важную роль в обеспечении взаимодействия клеточных органелл.
Для сукцинатдегидрогеназы выявлено множество модулирующих активность веществ. Активирующими агентами считаются изоцитрат, (3-оксимасляная кислота, а-глицерофосфат, ионы К\ Caz\ S04 , Вг\ СГ. Ингибиторами СДГ являются ЩУК, оксалаты, 2-оксокетоглутарат, дикарбоновые кислоты, пирофосфаты, хиноны, бикарбонат-ионы [19]. Степень активации анионами растворимой СДГ, выделенной из сердца быка, уменьшается в ряду СГ, S042\ Br", СН3СОО . Сходное активирование наблюдается в митохондриях растений [14, 88]. Изменение состояния мембран также может регулировать активность мембраносвязанных ферментов, в том числе и сукцинатдегидрогеназу [161].
При изучении митохондрий печени и почек крысы было обнаружено, "7 ft что СДГ весьма чувствительна к физиологическим уровням (10 -10 М) экстрамитохондриалыюго кальция. Активация ионами Са2+ этого внутримембранного фермента требовала присутствия небольших концентраций АТФ (меньше, чем 0,5 мМ). Предполагают, что кальций оказывал свое влияние путем взаимодействия с "Са2+-связывающими центрами низкого сродства" внутренней мембраны [33].
Оксалоацетат в живых организмах может защищать митохондрии от слишком высокой активности. СДГ существует в виде двух стабильных форм: неактивной - стабилизированной в комплексе с оксалоацетатом и активной, связанной лигандами. Оксалоацетат ковалетно связывается с активным центром фермента, вследствие чего тормозится образование субстрат-ферментного комплекса. Обнаружено, что без прединкубации наблюдается конкурентный тип ингибирования, а после инкубации с активирующими лигандами - смешанный [21].
Малонат является конкурентным ингибитором СДГ. Сродство малоната к активному центру слабо зависит от редокс-состояния фермента. Объяснить этот факт можно, рассматривая малонат в качестве аналога переходного состояния, возникающего в ходе превращения сукцинат-фумарата в активном центре [24]. Использование модели показывает, что расстояние между карбоксильными группами малоната близко к таковому для сукцината в цис- конформации.
Однако изучение активности СДГ, выделенной из животных тканей (печени, почек, сердца крысы), показало, что инкубация с бикарбонатом (20 мМ) в течение 7 минут при 37С приводит к активации фермента в 10 раз.
Монокарбоновые кислоты конкурентно угнетают активность СДГ из животных тканей, связываясь с двумя различными участками в молекуле фермента. Муравьиная кислота имеет К, = 125,0 мМ, глиоксиловая кислота 21 мМ, гликолевая кислота 120 мМ. Уксусная и пропионовая кислоты не оказывают влияния на активность СДГ [16].
В митохондриях животных АТФ, а не АДФ акивирует СДГ, причем действие АТФ наблюдается только на интактных митохондриях. У растений Brassica deracea и Phasedus aureus АТФ и АДФ активируют фермент СДГ в интактных митохондриях и в субмитохондриальных частицах [114]. В состоянии 4 (отсутствие АДФ) сукцинат играет значительную роль как субстрат, осуществляющий восстановление убихинона.
Экстракция суммарной РНК из листьев растений
Очистку фермента осуществляли в несколько стадий при температуре 0-4С. Стадия 1. Гомогенизация. Навеску растительного материала (5г) гомогенизировали в соотношении 1: 5 со средой выделения следующего состава: 50 мМ Трис-HCl буфер, (рН 7.5), содержащий 1 мМ ЭДТА, 10 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 0,4 М сахарозы.
Стадия 2. Полученный гомогенат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали в течение 5 мин. при 3000g. Надосадочную жидкость центрифугировали в течение 15 мин. при 12000g. Осадок, содержащий в основном митохондрии и микротельца ресуспендировали в 1мл среды, содержащей ЮмМ фосфатный буфер (рН 7,8), 0,01% тритон Х-100, 20мМ сукцинат натрия.
Стадия 3. Фракционирование сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25. К супернатанту добавляли кристаллический сульфат аммония до 20% насыщения. Центрифугировали 20 мин. при 15000g. Супернатант вновь фракционировали до 60% насыщения сульфатом аммония и вновь центрифугировали 20 мин. npHl5000g. Осадок ресуспендировали в 1-2 мл среды, содержащей ЮмМ фосфатный буфер (рН 7,8), 0,01% тритон Х-100, 20 мМ сукцинат натрия [16].
Полученный ферментативный препарат наносили на колонку заполненную сефадексом G-25 для освобождения от низкомолекулярных примесей. Элюцию осуществляли 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 20 мМ сукцинат натрия, со скоростью 15-20мл в час.
Стадия 4. Ионобменная хроматография. Фермент наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенную ЗОмМ фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим ЗО мМ КС1. При нанесении препарата на колонку фермент связывался с носителем. Поскольку фермент заряжен отрицательно, а колонка положительно, между ними возникает электростатическое взаимодействие. Чем сильнее заряжен белок, тем сильнее его взаимодействие с сорбентом. Разделение белков происходит путем десорбции их с носителя раствором, ионной силы которого достаточно для разрыва электростатических связей фермента и сорбента. Фермент десорбировали с колонки градиентом концентрации КС1 в среде элюирования. Наиболее оптимальным для десорбции фермента был линейный градиент концентрации КС1 от 0,03 до 0,2 М, среда десорбирования представляла собой 20 мМ фосфатный буфер (рН 6,2), содержащий 20 мМ сукцината. Активность фермента обнаруживалась под действием ионной силы раствора, содержащего 0,075 М КС1 в среде элюирования, достаточной для отрыва сукцинатдегидрогеназы от ДЭАЭ-целлюлозы.
Неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле проводили по Davis [59]. Разделяющий гель содержал Трис-HCI, рН 8,3, ТЕМЕД, акриламидную смесь (30% АСА / 0,8% МВА), персульфат аммония. Концентрирующий гель содержал Трис-HCI рН 6,7, ТЕМЕД, акриламидную смесь (10%) АСА / 2,5% МВА). Концентрация концентрирующего геля составляла 4%, а разделяющего - 8%.
Идентификацию белка проводили нитратом серебра по следующей методике: 1. Фиксация. Гель помещали в раствор, содержащий 50 % ацетона, 1,5 % ТХУ, 0,2 % формальдегид. Отмывали водой 5-Ю мин. 2. Гель помещали в 50 % ацетон на 5-Ю мин. После этого отмывали водой несколько раз. 3. После этого пластику геля инкубировали в 0,02 % растворе тиосульфата натрия 1 мин., после чего отмывали водой в течение 5 мин. 4. На следующей стадии гель помещали на 8 мин. в раствор, содержащий 0,2 % нитрата серебра и 0,1 % формальдегида. После, отмывали водой 3-5 раз по 2 мин. 5. Проявление геля проводили в растворе, содержащем 0,7 % бикарбоната натрия, 0,01 % формальдегида. Окраску геля осуществляли до появления полос, после чего помещали его в 7 % уксусную кислоту.
Электродный буфер представлял собой смесь 0,5 М Трис-глицинового буфера рН 8,3. Напряжение электрического тока подбиралась из расчета 5 мА на 1 слот.
Суммарную РНК выделяли из 0.2 г зеленых листьев арабидопсиса и кукурузы с помощью гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода [80] с использованием хлорида лития в качестве осаждающего агента. Качество выделенной РНК определяли электрофоретически в 1,0% (w/v) агарозный гель, приготовленный на основе 40 мМ Трис-ацетатного буфера, рН 8,2 с 50 мМ ЭДТА. Электрофорез проводили на приборе фирмы Хеликон в буфере того же состава при напряжении 60 В в течение 50 мин. Окрашивание гелей производили раствором 0,1% бромистого этидия [54].
Концентрацию измеряли на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО", Россия). Обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы M-MulV ("Fermentas", Литва) согласно с использованием олиго-dT праймера. Для синтеза кДНК использовали 3 мкг суммарной РНК. Полученную кДНК растворяли в 10 мМ Трис-НС1-буфере, рН 8.0, содержавшем 0.1 мМ ЭДТА, и использовали для анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и в ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).
Влияние белого света на активность изолированного препарата фермента сукцинатдегидрогеназы
Одним из опосредованных механизмов световой регуляции активности фермента может быть участие специальных рецепторных систем растительной клетки, таких как фитохромы и криптохромы. Известным фактом является участие фитохромной системы в регуляции активности различных ферментов. Установлено, что свое действие фитохром может оказывать через непосредственное взаимодействие с молекулой фермента, либо путем изменения структуры мембраны, для мембранных белков, либс через изменение работы генетического аппарата клети. Фитохром способен или сам проникать через ядерную оболочку, или изменять состояние хроматина посредством различных интермедиатов [94].
Для изучения возможного участия фитохромной системы в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях был проведен сравнительный анализ влияния низкоэнергетического красного и дальнего красного света, специфично рецептируемых фитохромами, на активность СДГ в зеленых растениях кукурузы.
На рисунке 15 изображена выявленная зависимость активности СДГ от действия света разной длинной волны на листья кукурузы. Показано, что под влиянием красного света (660 нм) происходило снижение активности фермента в 5,6 раз относительно контрольного уровня (24 часа в темноте). Воздействие на растения дальнего красного света имело реципрокный красному свету эффект на работу фермента. При облучении дальним красным светом активность СДГ не изменилась относительно контрольного уровня и соответствовала 0,07 Е/мг белка. Последовательное действие на растения красного и дальнего красного света вызывало аналогичный эффект с дальним красным светом, т.е. ферментативная активность сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях кукурузы не изменялась.
Поскольку при действии дальнего красного света и последовательном действии красного и дальнего красного света не происходило торможения активности сукцинатдегидрогеназы можно утверждать, что дальний красный свет является антагонистом красного света, так как снимает его действие.
Полученные данные о влиянии низкоэнергетического красного и дальнего красного света на активность сукцинатдегидрогеназы, свидетельствуют об участии фитохромной системы в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы. Экспозиция растений в красном свете вызывает конформационные перестройки в структуре фитохрома, переводя его из неактивной формы в активную [145, 1, 37], которая оказывает действие на функционирование СДГ.
При последовательном облучении растений низкоэнергетическим красным и дальним красным светом не происходило ингибирования ферментативной активности. Можно предпопложить, что фитохромы после облучения дальним красным светом находятся в неактивной форме и не способны активировать сигнальные каскады [139], т.е. происходит блокирование сигнала от активной формы фитохромов. Активная форма фитохрома, по-видимому, воздействует на генетический аппарат клетки и блокирует экспрессию генов, кодирующих сукцинатдегидрогеназу. ОД і
Темнота - растения, выдержанные в темноте; КС - растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; ДКС - растения, освещенные светом с длиной волны 730 нм; КС+ДКС - растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 нм и 730 нм.
Принципиально важным является исследование механизмов регуляции активности СДГ при изменении светового режима с участием фитохромной системы. Поскольку фитохромная система представлена фитохромами разных типов, принципиально важным является изучение вклада каждого из фитохромов в регуляцию активности сукцинатдегидрогеназы. Для решения этой задачи использовали в качестве объектов исследования генмодифицированные организмы, в генетическом аппарате которых отсутствует ген, кодирующий один из фитохромов. Мутантные растения позволяют выявить вклад каждого отдельного вида фитохромой системы в процесс регуляции метаболизма клетки.
Для изучения возможного участия отдельных видов фитохромной системы в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях был проведен сравнительный анализ влияния низкоэнергетического красного и дальнего красного света, специфично рецептируемых фитохромами, на активность СДГ в зеленых растениях A. thaliana трех мутантных линий.
На рисунке 16 изображена зависимость активности СДГ от действия света разной длинны волны на растения A. thaliana дикого типа. Показано, что под влиянием красного света (660нм) происходило снижение активности фермента в 6 раз относительно контрольного уровня (24 часа в темноте) с 0,024 Е/мг белка до 0,004 Е/мг белка. Действие дальнего красного света (730нм) вызвало противоположный эффект в функционировании фермента. Активность СДГ оставалась на уровне контроля и составляла 0,022 Е/мг белка. Последовательное действие красного и дальнего красного света было сходно по своему проявлению с действием дальнего красного света.
Похожие диссертации на Световая регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений
