Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Поглощение и распределение тяжелых металлов в листьях гидрофитов 11
1.2. Токсичность тяжелых металлов и ответные реакции растений 15
1.3. Основные механизмы защиты растений от действия тяжелых металлов 21
Глава 2. Объекты и методы исследований 35
Глава 3. Результаты и обсуждение 41
3.1. Особенности ответных реакций погруженных и плавающих гидрофитов на действие Cu2+, Cd2+ и Ni+ 41
3.1.1. Накопление тяжелых металлов и изменение фотосинтетических параметров гидрофитов 41
3.1.2. Распределение металлов по клеточным фракциям гидрофитов и роль белков в детоксикации ионов 54
3.2. Действие возрастающих концентраций никеля наЕ. canadensis 69
3.2.1. Аккумуляция Ni и состояние фотосинтезирующей и дыхательной системы в листьях Е. canadensis 69
3.2.2. Влияние никеля на перекисное окисление липидов и антиоксидантные реакции в листьях Е. canadensis 72
3.2.3. Роль белков в адаптации Е. canadensis к повышенным концентрациям никеля 76
3.3. Развитие ответных реакций Е. canadensis при кратковременном воздействии высокими концентрациями Ni ,Zn и Си 85
3.3.1. Поглощение металлов во времени и их влияние на фотосинтетическую фуЕікцию в листьях Е. canadensis 85
3.3.2. Развитие перекисного окисления липидов и антиоксидантных реакций в листьях Е. canadensis в течение суточной адаптации KNi2+,Zn2+MCu2+ 89
3.3.3. Распределение Ni2+, Zn2+ и Cu2+в клеточных фракциях Е. canadensis и участие белков в детоксикации тяжелых металлов при кратковременной экспозиции 94
Заключение 100
Выводы 102
Библиографический список использованной литературы 104
Приложение 123
- Поглощение и распределение тяжелых металлов в листьях гидрофитов
- Основные механизмы защиты растений от действия тяжелых металлов
- Распределение металлов по клеточным фракциям гидрофитов и роль белков в детоксикации ионов
- Поглощение металлов во времени и их влияние на фотосинтетическую фуЕікцию в листьях Е. canadensis
Введение к работе
Постановка проблемы и се актуальность. Гидрофиты, группа вторичноводных цветковых растений, в зависимости от степени контакта с водой подразделяются на воздушно-водные (гелофиты), плавающие (плейстофиты) и погруженные (гидатофиты) [1,С4]. Водная среда по условиям обитания относительно постоянна. Однако в последние десятилетия ее стабильность нарушается антропогенными воздействиями, прежде всего, в виде различных поллютантов органического и неорганического происхождения. Среди них особое положение занимают ионы тяжелых металлов (ТМ). В небольших количествах они необходимы для нормальной жизнедеятельности высших водных растений. Такие металлы, как медь, цинк, никель, входят в состав многих ферментативных систем, обеспечивающих практически все основные функции организма [2,С.23-37;3;4]. В то же время избыток ТМ подавляет рост и влияет на жизнеспособность гидрофитов, нарушая физиолого-биохимические процессы в клетках [5-7].
Известно, что стрессовые условия вызывают образование повышенных количеств активных форм кислорода (АФК) и как следствие окислительное повреждение жизненно важных биополимеров и клеточных мембран [8,С110;9;10]. Развитие окислительного стресса при действии ТМ и основные механизмы защиты клеточного уровня изучены более детально у высших наземных растений [11,12]. Выявлены компоненты антиоксидантной системы, включающей каротиноиды, небелковые тиолы (глутатион), ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза и др.) [13], а также SH-обогащенные белки, которые устраняют не только избыток ТМ, но и токсичные радикалы [14-16].
В литературе имеются сведения, что некоторые виды гидрофитов проявляют повышенную устойчивость к загрязнению среды ТМ [17-19]. Однако реакции, обеспечивающие эту способность, до конца не выяснены.
Защитные механизмы водных растений почти не исследованы. Изучение особенностей адаптивных механизмов у гидрофитов, прошедших длительный эволюционный путь приспособления к водной среде, представляется актуальным и может быть полезным не только в теоретическом плане, но и для практического использования в мониторинге и фиторемедиации.
Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить накопление тяжелых металлов (Си , Cd , N1 , Zn ) в листьях высших водных растений, их токсическое действие на некоторые характеристики фотосинтезирующей системы и ответные про- и антиоксидантные реакции. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Выявить особенности ответных реакций (поглотительную способность; содержание пигментов, интенсивность потенциального фотосинтеза; роль белков и небелковых фракций в детоксикации металлов) погруженных и плавающих гидрофитов на действие разных концентраций Cu2+, Cd2+ и Ni +.
Изучить влияние нарастающих концентраций Ni на содержание пигментов, интенсивность фотосинтеза и дыхания, процессы перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в листьях Elodea canadensis Michx.
Определить роль белков в связывании Ni+ и выявить возможность образования дополнительных Ni -связывающих SH-белков и пептидов в листьях Е. canadensis.
Исследовать динамику накопления ТМ и развитие ответных реакций (содержание пигментов, интенсивность фотосинтеза, перекисное окисление липидов, активность ферментов-антиоксидантов, синтез SH-соединений) у Е. canadensis при кратковременном действии высоких концентраций Ni2+, Zn2+ и Cu2+.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование физиолого-биохимических процессов и основных механизмов защиты в клетках высших водных растений в ответ на токсическое действие Cu2+, Cd2+, Ni2+ и Zn2+. В сравнительном аспекте изучены аккумулятивная способность и реакция фотосинтезирующей системы погруженных и плавающих гидрофитов на действие опытных ионов. Впервые выявлено участие белковых и небелковых клеточных фракций в связывании ТМ у погруженных и плавающих гидрофитов. Показана роль растворимых и мембранно-связанных белков в детоксикации изученных металлов в зависимости от концентрации и времени воздействия. Получены приоритетные данные о синтезе в цитоплазме клеток Е. canadensis добавочных Ni -связывающих SH-белков (9.5, 10, 15 кД) в присутствии повышенных концентраций никеля. Впервые изучена динамика формирования антиоксидантных реакций в листьях элодеи в короткий интервал времени (0-24 часа) при действии высоких концентраций Ni2+, Zn + и Си2+ (от 1.5 до 3 мг/л).
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты диссертационной работы существенно расширяют представления о механизмах защиты от действия Си , Cd , Ni и Zn у высших водных растений. Изучение способности погруженных и плавающих гидрофитов накапливать отдельные элементы, а также выявление токсического действия ТМ и механизмов детоксикации представляют не только научный интерес, но и имеют большое практическое значение для решения задач мониторинга водных экосистем и фиторемедиации. Перспективным в теоретическом плане и для практического использования представляется изучение видоспецифичных ответных реакций водных растений на действие ТМ. Неоднозначность этих реакций свидетельствует о разнообразии путей адаптации гидрофитов к одним и тем же условиям. Данные диссертационной работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по физиологии, биохимии и экологии растений в ВУЗах на кафедрах соответствующего профиля.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на международных конференциях «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), «Биология внутренних вод: проблемы экологии и биоразнообразия» (Борок, 2002), «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005); всероссийских школах-конференциях по водным растениям «Гидроботаника 2000» (Борок, 2000) и «Гидроботаника 2005» (Борок, 2005); VI Всероссийском популяционном семинаре (Нижний Тагил, 2004); научных и научно-практических конференциях «Б. П. Колесников - выдающийся отечественный лесовед и эколог: к 90-летию со дня рождения» (Екатеринбург, 1999), «Экологические проблемы промышленных регионов» (Екатеринбург, 2003), «Экология промышленного региона и экологическое образование» (Нижний Тагил, 2004); VII и IX молодежных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2000; 2002), VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2000), конференциях молодых ученых «Биосфера и человечество» (Екатеринбург, 2000), «Проблемы глобальной и региональной экологии» (Екатеринбург, 2003), «Экологические механизмы динамики и устойчивости биоты» (Екатеринбург, 2004), «Экология в меняющемся мире» (Екатеринбург, 2006).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 статьи в центральных российских научных журналах.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 26 рисунков. Библиография представлена 182 работами, в числе которых 92 иностранных.
Благодарности: выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Г.Ф. Некрасовой за огромную помощь в работе, консультации и постоянную поддержку; сотрудникам и преподавателям кафедры физиологии и биохимии растений Уральского госуниверситета за помощь на разных этапах выполнения диссертации. Выражаю благодарность Э.Х. Ахуновой, сотруднику лаборатории популяционной экотоксикологии ИЭРиЖ УрО РАН, за помощь в определении содержания тяжелых металлов в растительных образцах методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Хочу выразить личную признательность профессору К. Стржалке, а также сотрудникам и преподавателям кафедры физиологии фотосинтеза Ягиеллонского Университета (г. Краков) за помощь в освоении новых современных методов исследования.
Поглощение и распределение тяжелых металлов в листьях гидрофитов
Тяжелые металлы относятся к числу наиболее опасных химических загрязняющих веществ. Избыточное поступление металлов в водные экосистемы в результате антропогенного прессинга часто приводит к необратимым изменениям и нарушениям жизненно важных функций у большинства организмов. Высшие водные растения являются неотъемлемыми компонентами многих гидрофитоценозов и играют существенную роль в очистке водоемов от поллютантов [20-24]. В связи с этим проблема адаптации гидрофитов к действию ТМ становится все более актуальной.
К ТМ условно относят химические элементы с атомной массой свыше 50, обладающие свойствами металлов и металлоидов [24,С.5;25]. По классификации Реймерса [26,С10], тяжелыми следует считать следующие металлы: РЬ, Си, Zn, Ni, Cd, Со, Sb, Sn, Bi, Hg. В ряде работ к ним добавляют Pt, Ag, W, Fe, Au, Mn [цит. no 26,C10]. He все ТМ представляют одинаковую опасность для гидрофитов. В литературе неоднократно приводились ряды металлов по степени их токсичности для растений [2,С.8-17;5;27,С.98-103]. Кабата-Пендиас и Пендиас [27,С99] пришли к выводу, что наиболее ядовитыми для высших растений являются Hg, Си, Ni, Pb, Со, Cd, Ag, Be и Sn. Токсичность ТМ, выявленная для гидробионтов, изменяется в ряду Hg Cu Ag Cd Pb Cr Zn Fe Ni Co Mn [цит. по 5]. Обнаружено, что степень токсичности элемента различна для каждого типа эксперимента, но хорошо коррелирует с электроотрицательностью двухвалентных ионов, произведением растворимости сульфидов, устойчивостью хелатов и биологической доступностью [2,С.8-17;25,С.8;27,С99]. Избыток ТМ в среде обитания, как правило, приводит к их повышенному накоплению растительными организмами, при этом величина и характер поглощения у разных видов растений имеет свою специфику. Виды, аккумулирующие элемент прямо пропорционально его содержанию в среде, называются «индикаторами»; растения, накапливающие элемент даже при низком его количестве, называются «аккумуляторами»; растения, которые не реагируют повышением содержания элемента в тканях даже при его избытке в среде, называются «исключителями» [25,С.32;28].
Литературные данные свидетельствуют о высокой аккумулятивной способности высших водных растений [29-33]. Анатомо-морфологическое строение особенно у гидатофитов - редукция покровных, механических тканей, проводящей системы растений; увеличение площади ассимилирующих органов за счет рассечения листьев на узкие нитевидные доли (роголистник, пузырчатка) или их уплощения (листья погруженных рдестов) увеличивают поверхность контакта с водной средой и, следовательно, обеспечивают большую возможность поглощения [1,С.8-18;34,С.89-102;35,С146].
Концентрация ТМ в тканях гидрофитов может в сотни (Fe), тысячи (Hg, Си, Cd, Ni) и даже сотни тысяч раз (Zn, Мп) превышать их содержание в воде [1,С.141;36-39]. Водные растения обладают неодинаковой способностью к аккумуляции ТМ, т.е. имеют разные КБН (коэффициенты биологического накопления). КБН - это отношение содержания металлов в тканях растений к их концентрации в окружающей среде. По этому показателю, показывающему способность накапливать ТМ в биомассе, осуществляют селекцию растений для фиторемедиации [40,С66].
Литературные данные о значениях КБН у гидрофитов в основном касаются природных местообитаний и весьма противоречивы [41-43;44,С196-204]. Вероятно, это связано с тем, что в естественных гидроценозах аккумуляция ТМ водными растениями зависит от многих факторов и в первую очередь определяется биологической доступностью металла [2,С.9-18;27,С99]. Согласно Кадукину и др. [42] коэффициенты накопления свободноплавающих растений имеют следующие значения: Мп - 9000, Fe - 1700, Zn - 1160, Си 13 414, Cr - 210 и создают нисходящий ряд: Mn Fe Zn Cu Cr. По данным Варенко и Чуйко [43], коэффициенты накопления Mn, Zn и Си у плейстофитов соответственно равны 7700, 25000 и 435, т.е. имеют тот же порядок, за исключением цинка.
По нашим данным, у ряда погруженных и плавающих гидрофитов, обитающих в водоемах Свердловской области, КБН в большинстве случаев составлял следующий ряд: Mn Zn Fe Cu Ni [41]. При этом КБН гидрофитов, собранных из условно чистых природных местообитаний, отличался в несколько раз или даже на порядок от коэффициентов накопления растений, обитающих в водоемах, подвергающихся значительному антропогенному загрязнению.
Модельные эксперименты, проведенные Микряковой [45,46] на роголистнике и ряске малой с использованием возрастающих концентраций Cu2+, Cd2+ u Pb2+, показали обратную зависимость между КБН и содержанием элементов в среде: с ростом концентрации количество извлеченного металла уменьшалось.
Обнаружено, что способность растений к аккумулированию металлов зависит от типа иона. Согласно Муру и Рамамурти [47,С110], КБН меди ниже аналогичных коэффициентов, известных для большинства других металлов, таких как ртуть, свинец, цинк и никель. Возрастая в зонах интенсивного загрязнения, они могут изменяться от 10" до 10 как у морских, так и у пресноводных растений, что во многом зависит от их видовой принадлежности. По данным Rice [цит. по 2,С27], способность водных растений к концентрации Zn + на несколько порядков выше, чем у наземных видов.
Более точную информацию об аккумулятивной способности гидрофитов могли бы дать модельные эксперименты, поскольку позволяют контролировать многие факторы среды. К сожалению, такие сведения очень немногочисленны и касаются лишь отдельных концентраций некоторых ионов. Это не дает возможности сравнить виды высших водных растений по накопительной способности в природных и модельных условиях обитания.
Многие исследования выявили четкую зависимость между накоплением металла в тканях гидрофита и его концентрацией в среде [6,45,46,48-50]. Показано, что в течение первых часов (в некоторых случаях первых суток) накопление ТМ происходит наиболее интенсивно, затем скорость поглощения ионов снижается. Время достижения насыщения находится в обратной, а уровень насыщения - в прямой зависимости от концентрации металла в среде [50]. Выявлено, что разные элементы при их одинаковой концентрации в среде могут поглощаться растениями с разной скоростью [цит. по 5].
Распределение поглощенных из среды тяжелых металлов в клеточных фракциях гидрофитов практически не изучено. Более подробная информация имеется по наземным растениям [51-55].
Основные механизмы защиты растений от действия тяжелых металлов
Образование АФК происходит во всех частях растительной клетки. Это связано как с неферментативными (например, окислительно-восстановительные реакции фенолов, хинонов, флавинов, автоокисление гем- и SH-содержащих соединений), так и с ферментативными процессами. Значительный вклад в образование АФК вносит также функционирование цепей переноса электронов в мембранных структурах клетки. В хлоропластах супероксидный радикал возникает в ФС I (при участии ферредоксина), так и в ФС II (в процессе фотоокисления воды), а также при функционировании РБФ-карбоксилазы как оксигеназы [8,С.103;9;62;83].
Большой вклад вносит дыхательная цепь митохондрий, особенно при низкой концентрации АДФ. Важна роль и системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматической сети, ядерной мембраны и других частей клетки. АФК часто возникают не только спонтанно, но и ферментативно (НАДФН-оксидаза дыхательного взрыва в плазмалемме и ксантиноксидаза в гиалоплазме) [10,62].
К АФК относится также синглетный кислород ( СЬ). Основной путь его образования обусловлен световыми реакциями, которые опосредованы пигментами-фотосенсибилизаторами (главным образом хлорофиллом). Поглощая квант света, этот пигмент переходит в синглетное ( П) или триплетное (П) возбужденное состояние. Молекулы пигмента в обоих возбужденных состояниях, сталкиваясь с молекулярным кислородом, передают на него свою энергию, в результате чего и образуется химически очень активный синглетный молекулярный кислород. Основное значение в его генерации имеют триплетные состояния пигментов, которые обладают значительно большим временем жизни. Кроме того, возможен и другой механизм фотодинамического действия - образование свободных радикалов при диссоциации комплекса триплетной молекулы пигмента, кислорода и субстрата [8,С.104;9;13;62;83]. Эффективным генератором синглетного кислорода является важнейший пигмент фотосинтеза - хлорофилл, и в клетках растений всегда имеется опасность того, что этот пигмент проявит свое повреждающее действие [цит. по 9].
Активные радикалы, главным образом НО , взаимодействуя с органическими веществами, образуют гидропероксиды ДНК, белков, липидов (ROOH). Гидропероксиды, также как и пероксиды, химически активны и в ходе метаболизма переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения. Образование ROOH называют перекисным окислением. В липидах (L) в основном в полиненасыщенных жирных кислотах АФК вызывают цепные реакции с накоплением липидных (L ), пероксильных (LOO ), алкоксильных (LO ) и других радикалов [8,С.104-105;10;13;62;83]. Участие ТМ с переменной валентностью приводит к разветвлению этой цепи. В результате ПОЛ образуются конечные метаболиты - малоновый диальдегид, этан, пентан и др. [8,С.105;10;62;85-87].
Окислительный стресс приводит к повреждению наиболее важных полимеров - нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. По мнению Чирковой [8,СЛ05] и Кулинского [10], АФК обладают большим мутагенным действием, чем другие классы мутагенов и их высокие концентрации могут ингибировать синтез ДНК, деление клеток и активировать апоптоз.
Имеются сведения, что некоторые АФК, в частности пероксид водорода и синглетный кислород, возникающие в ходе окислительного взрыва, являются сигнальными молекулами, вызывающими экспрессию генома, отвечающего за защитные механизмы в клетках растений [83-85;88,С.107-108].
Основные механизмы защиты растений от действия тяжелых металлов Высшие растения, благодаря различным морфологическим и физиологическим особенностям, могут приспосабливаться к неблагоприятным факторам. Способность гидрофитов к аккумуляции больших доз ТМ с образованием нетоксичных комплексов свидетельствует о наличии у них надежных механизмов защиты. Выживаемость растительных организмов с сохранением высокой продуктивности в экстремальных условиях существования зависит от устойчивости всех молекулярных и клеточных систем [цит. по 25,С7].
В литературе описаны различные механизмы защиты растений от вредного влияния избытка тяжелых металлов [8,С.185-188;25,СЛ 1-32;27,СЛ05-106;56;76;77;89-91]. В основном они касаются наземных видов. Однако можно предположить единство адаптивных реакций для всех высших растений.
Так, Кабата-Пендиас и Пендиас [27,СЛ05] выделяют несколько аспектов в механизмах защиты. Это внешние факторы: низкая растворимость и низкая подвижность катионов в окружающей среде, антагонистическое действие металлов; и внутренние факторы, основанные на комплексе механизмов защиты метаболического порядка: селективное поглощение ионов, пониженная проницаемость мембран или другие различия в их структуре и функциях; иммобилизация металлов в корнях, листьях, семенах, удаление ионов из метаболических процессов путем отложения (образования запасов) в фиксированных или нерастворимых формах в различных органах и органеллах; изменение характера метаболизма - усиление действия ферментативных систем, которые подвергаются ингибированию, возрастание содержания антагонистических метаболитов или восстановление метаболических цепей за счет пропуска ингибированной позиции;
удаление ТМ из растений при вымывании через листья, соковыделение, сбрасывание листьев и выделение через корни. Серегин и Иванов [77,92] выделяют шесть внутриклеточных систем защиты, направленных на поддержание гомеостаза:
Распределение металлов по клеточным фракциям гидрофитов и роль белков в детоксикации ионов
В зависимости от того, является ли синтез связывающих ТМ соединений индуцируемым, или они образуются в клетке конститутивно, можно говорить соответственно о специфичности и неспецифичности процесса детоксикации [цит. по 89]. Из всех механизмов защиты, направленных на поддержание гомеостаза в клетке, наиболее специфическим для действия ТМ является синтез металлсвязывающих соединений, обогащенных тиоловыми (-SH) группами - металлотионеинов и фитохелатинов [56,76,77,91-93]
Интенсивное изучение металлотионеинов (МТ) проводится с начала восьмидесятых годов. Было установлено, что они имеют низкую молекулярную массу (до 10 кД), высокое содержание цистеина (около 30%), сходные УФ-спектр и термоустойчивость [25,С.12;74]. МТ разделяют на три класса с учетом химической структуры молекул. Первый класс (МТ1) - металлсвязывающие белки позвоночных. В металлсвязывающем домене молекула МТ1 содержит 20 остатков цистеина, расположение которых очень постоянно для этого класса. Второй класс (МТ2) - полипептиды, сходные по строению с МТ1, но не имеющие столь консервативного положения остатков цистеина. Они распространены у беспозвоночных животных, высших растений, грибов, цианобактерий и некоторых других прокариот, морских водорослей и дрожжей. Особенностью металлотионеинов растений, относящихся ко второму классу, является наличие большого промежутка, длиной около 40 аминокислотных остатков, в том числе ароматических, разделяющего два металлсвязывающих домена. Длина такого промежутка у остальных МТ составляет менее 10 аминокислотных остатков и не содержит ароматических аминокислот [56,89-91]. Металлсвязывающие белки синтезируются в норме в незначительном количестве. Их содержание в клетке резко возрастает при действии металлов и снижается в случае уменьшения их концентрации в питательном субстрате. Повышенные концентрации ТМ в среде стимулируют не только синтез МТ, но и связывание этими белками большей части поступивших в клетку ионов металлов. С этой точки зрения можно говорить о специфичности механизма детоксикации ТМ металлотионеинами [цит. по 89]. В настоящее время выделено три типа МТ-подобных генов растений, продукты которых различаются по расположению остатков цистеина. Геном одного растения может содержать несколько таких генов, кодирующих разные белки [77]. Ионы ТМ стимулируют синтез МТ не в одинаковой мере. Такие элементы, как Са, Al, Na, Mg, не индуцируют образования металлотионеинов. Синтез МТ преимущественно индуцируют Cd, Zn, Си, Hg, Аи, Ag, Со, Ni, Pb [ЦИТ. ПО 89]. Большой интерес представляет группа металлотионеинов третьего класса - фитохелатинов (ФХ). ФХ - это простые у-глутамил пептиды, содержащие глутамат, цистеин, глицин [(у-Глу-Цис)п-Гли] в отношении 2:2:1 или 11:11:1, где п=2-11. Они связывают свободные металлы подобно МТ, благодаря высокому содержанию цистеина и его конфигурации. Пептиды синтезируются из восстановленного глутатиона в присутствии ТМ ферментом фитохелатинсинтазой (у-глутамил-цистеиндипептидил-транспептидазой) [92-94]. Этот фермент обязательно находится в клетках высших растений. Наличие у-Глу связи в этих пептидах свидетельствует о том, что они, в отличие от МТ первого и второго класса, не являются первичными генными продуктами, то есть не синтезируются через мРНК [92-94]. Известно пять семейств фитохелатинов, различающихся по аминокислотному остатку на С-конце полипептида. Некоторые из них, вероятно, свойственны отдельным семействам покрытосеменных растений. Так, например, гомофитохелатины (с С-терминальным аланином) обнаружены главным образом у бобовых [95,96], а оксиметилфитохелатины (с С-терминальным серином) - у злаков [96]. Кроме того, выделены безглициновые пептиды из культуры клеток высшего растения Rubia tinctorum. Присутствие безглициновых пептидов, по мнению Kubota и др. [97,98], представляет интерес для понимания путей синтеза фитохелатинов. Кпеег и Zenk [99] продемонстрировали участие ФХ в детоксикации ТМ. Доказательством послужил тот факт, что остановка синтеза фитохелатинов обработкой растений или культур клеток бутионинсульфоксимином, ингибитором ферментов биосинтеза глутатиона, увеличило их чувствительность к металлам. Широкий ряд металлов индуцирует продукцию фитохелатинов. Образование ФХ наблюдали в присутствии Zn , Pb (1 мМ); Cd , Ni , Sn , Se032", Bi3+ (100 MKM); Ag\ Cu2\ Au+ (50 мкМ); As043" (20мкМ); Sb3+, Te4+ (10 мкМ). Такие ионы, как Al3+, Ca2+, Co2+, Cr2+, Cs+, K+, Mg2+, Na+ и V2+ не вызывали синтез фитохелатинов [цит. по 92]. Наибольшим сродством ФХ обладают к кадмию, что определяет их важную роль в его детоксикации [92,93].
Литературные данные о способностях высших водных растений синтезировать металлотионеины и фитохелатины очень немногочисленны. В основном информация связана с высшими наземными растениями и водорослями [15,16,100-102]. Так, например, в растениях перца (Capsicum аппиит) под действием повышенных концентраций кадмия происходит синтез двух низкомолекулярных пептидов (10 кД), отличающихся по аминокислотному составу и отсутствующих в контроле [100]. Из клеток цианобактерий, инкубированных с высокими концентрациями ванадия, Саваниной и др. [101] выделен ванадий-тионеин, белок с молекулярной массой около 10 кД, связывающий 80% поглощенного металла. Kaplan и др. [102] на хлорелле обнаружено, что ионы Cd2+ вызывают синтез низкомолекулярных пептидов, идентифицированных как фитохелатины.
Поглощение металлов во времени и их влияние на фотосинтетическую фуЕікцию в листьях Е. canadensis
При концентрации 0.25 мг/л доля металлов в белках в ряде случаев была меньше, чем при 0.025 мг/л (рис.9а,б,в). Вероятно, это объясняется тем, что количество поглощенного металла преобладало над содержанием доступных участков связывания в белках (-SH, -СООН, -NH2 и т.д.). В такой ситуации сохранялось значение небелковой растворимой фракции как временного депо ионов ТМ, в детоксикации которых могли участвовать низкомолекулярные небелковые тиолы. Возможно также, что поглощение металлов опережало их связывание в белках.
Во всех опытных вариантах доля металлов в растворимых белках у большинства гидрофитов была в несколько раз выше, чем в мембранно-связанных (рис.8,9).
Известно, что ТМ в микроколичествах могут эффективно задерживаться клеточной стенкой или реактивными центрами апопласта. Эти же механизмы предотвращают поступление избыточных количеств элементов в клетки и ограничивают передвижение ионов металлов по тканям растений [156]. В случае повышенных концентраций ТМ в среде указанные механизмы не могут полностью исключить поступление ионов через плазматическую мембрану в цитозоль. Наиболее эффективным механизмом детоксикации большинства ТМ является связывание их тиолами и органическими кислотами в цитоплазме с последующим выводом образовавшихся комплексов в вакуоль [56].
Сравнивая распределение металлов по клеточным фракциям, можно говорить о различиях в механизмах детоксикации. Имеются сведения, что медь обладает меньшей подвижностью в растениях по сравнению с другими элементами и большое количество Си + связывается с клеточными стенками [27,СЛ29]. Наши исследования показали, что в контрольных растениях доля меди в небелковой полимерной фракции была действительно высока и достигала у плейстофитов 41% (рис.7а), однако в вариантах с Си2+, ее доля сильно уменьшалась, при этом возрастала роль белков и небелковой растворимой фракции (рис.8а,9а). Связывание Ni2+ происходило преимущественно белками, особенно растворимыми (рис.8в,9в). Известно, что никель отличается подвижностью в растениях, при этом он способен формировать прочные комплексы с белками и органическими кислотами [27,С368]. Данные литературы о распределении Ni в тканевых и клеточных структурах гидрофитов нам неизвестны, но на проростках кукурузы Серегиным и др. [59] показано, что содержание никеля в протопласте клеток было выше, чем в клеточных оболочках.
В детоксикации Cd2f растворимые и мембранно-связанные белки не играли столь важной роли при выбранных нами концентрациях, как в случае с Си2+ и Ni2+, тогда как участие небелковых фракций в связывании кадмия было значительным и суммарно достигало 60% при низкой (0.025 мг/л) концентрации иона (рис.8б) и 70% - при высокой (0.25 мг/л) (рис.9б). Сходные результаты были получены Золотухиной и Гавриленко [60] на морских водорослях и пресноводном мхе, у которых кадмий при концентрации в среде близкой к выбранной нами (0.3 мг/л) в основном аккумулировался в полисахаридах и цитоплазматической фракции. Результаты, полученные на наземных растениях, подтверждают роль небелковых полимерных соединений в нейтрализации поллютанта. Так, Шевяковой и др. [157] на хрустальной травке было показано, что детоксикация кадмия достигалась локализацией в клеточных стенках и других компартментах апопласта за счет связывания с полисахаридами пектиновой природы. У проростков кукурузы Cd главным образом находился в апопласте ризодермы и коры корня [158].
Отмечены различия среди погруженных и плавающих гидрофитов по распределению ТМ в небелковых фракциях. Независимо от концентрации ионов в среде доля в полимерной фракции, в основном представленной полисахаридами, у плейстофитов была значительно выше, чем у гидатофитов (рис.7,8,9). Вероятно, особенности аЕіатомического строения листьев плавающих растений, имеющих больше механических тканей и целлюлозных элементов, чем погруженные, позволяют эффективнее связывать тяжелые металлы на поверхности клеточных стенок и мембран [1,С.10-16;34,С89-102;35,С.146].
Содержание Cu2+, Cd2+ и Ni2+ в растворимых и мембранно-связанных белках («удельная емкость» белков, выраженная в мкг металла на 1 мг белка) отличалось от процентного соотношения в 1 г сухого веса и интенсивно возрастало с увеличением концентрации ионов (рис. 10,11). За время эксперимента погруженные гидрофиты накапливали в белках в 2-6 раз больше ТМ по сравнению с плавающими. Наиболее активно растворимые и мембранные белки связывали ионы меди (рис.10а,11а), при этом у гидатофитов количество металла преобладало в растворимых белках, за исключением рдеста блестящего, у плейстофитов - в мембранно-связанных. Аккумуляция кадмия в основном происходила в растворимых белках (рис. 106,116).
В акцептировании никеля растворимыми и мембранно-связанными белками проявились наибольшие межвидовые различия, независимо от групповой принадлежности. Так у ряски трехраздельной, рдеста блестящего, водокраса и рдеста плавающего отмечено значительное накопление никеля в мембранно-связанных белках (рис.10в,11в).
Кроме того, обнаружены различия среди группы гидатофитов по участию отдельных типов белка в связывании ТМ (рис. 10,11). Так, наибольшей способностью накапливать металлы в растворимых белках обладала элодея канадская и роголистник (до 0.94 мкг/мг белка), в мембранно-связанных -рдест блестящий (до 0.73 мкг/мг белка).
Как известно, SH-содержащие соединения не только эффективно связывают ионы ТМ, но и участвуют в антиоксидантных процессах [14,15,90-92]. При проникновении металлов в растение возможно индуцирование синтеза SH-белков и низкомолекулярных небелковых соединений, таких как глутатион [56,90-92,111,155].
Похожие диссертации на Физиологические аспекты токсического действия Cu2+, Cd2+, Ni2+, Zn2+ на листья высших водных растений
