Введение к работе
Актуальность темы. Открытие программируемой гибели клеток (ПГК) многоклеточных организмов явилось мощным стимулом в развитии биологии. Познания особенностей программируемой гибели клеток растений позволят управлять процессами их роста, развития и старения, понять многие физиологические и патологические процессы, происходящие в клетке.
Апоптоз играет важную роль в реализации программы развития в онтогенезе и поддержании тканевого гомеостаза организма. Являясь важной составляющей иммунитета, апоптоз вовлечен в защитные реакции животных и растений на инфекционные возбудители. Реализация программируемой гибели клеток при различных патологических состояниях происходит путем удаления клеток, тем самым способствуя сохранению нормального функционирования биологической системы.
Современные представления об апоптозе основываются на результатах электронно-микроскопических и биохимических исследований и как особый вариант клеточной смерти были открыты Kerr J.F., et al. (1972).
Несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор не исследованы многие механизмы и пути регуляции апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме.
Ряд компонентов клеток растений способен активировать программируемую гибель клеток и у растений и у животных, в том числе опухолевых (Fingrut О., Flescher Е., 2002).Сравнительный анализ показывает, что некоторые факторы, участвующие в реализации программируемой гибели клеток, универсальны для всех эукариот, однако растения могут использовать и уникальные пути (Lam Е., et al., 2001).
В отличие от некроза, программируемая гибель клеток генетически обусловлена, что доказано на животных организмах. На растениях этот вопрос изучается Lain S.(CIIIA), Pavid L. (Великобритания), Arpagaus. S, Broendle R. (Бернский университет, Швейцария), Khurshed I. (университет Кашмир, Индия) и др. В России единственной пока школой, занимающейся проблемой апоптоза, является МГУ им. М.В. Ломоносова (Ванюшин и др., 1987-2009; Скулачев,1999-2009, Самуилов,2009).
Вместе с тем, не ясным остается вопрос, какой или какие факторы клеток приводят к ее гибели по апоптозному типу, являются ли они общими для однодольных и двудольных растений, какую роль играет в этом процессе антиоксидантная система и теломераза.
Цель и задачи исследований. В связи с этим целью работы является сравнительное исследование проявления апоптоза у различных растительных культур и изучение влияния апоптозных компонентов на начальные стадии развития однодольных и двудольных растений.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Выделение предполагаемых индукторов апоптоза из молодого листа монстеры, колеоптилей пшеницы и ячменя;
Изучение изменения в структуре ДНК в полученных проростках гороха, пшеницы и ячменя на вторые - десятые сутки эксперимента;
Выявление активности теломеразы методом TRAP-анализа на проростках гороха, пшеницы и ячменя в динамике;
4. Изучение активности ферментов антиоксидантной системы:
супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы, аскорбатпероксидазы,
содержание малонового диальдегида, каротиноидов, витаминов С, Е в
проростках гороха, пшеницы и ячменя в процессе развития;
5. Разработка модели апоптоза у растений.
Научная новизна работы. Впервые проведены сравнительные исследования проявления естественного апоптоза в колеоптилях пшеницы, ячменя и при формировании листа монстеры. Изучено индуцирование апоптоза на основе фрагментации ДНК, активности ферментов антиоксидантной системы и динамики накопления низкомолекулярных антиоксидантов на начальных стадиях развития растений. Впервые изучена активность теломеразы в норме и при ало птозе. Разработана биохимическая модель апоптоза растительных клеток, заключающаяся в регистрации изменения активности антиоксидантов, нарушении проницаемости мембран, фрагментации ДНК по типу «лесенки» и активности теломеразы.
Практическая и теоретическая значимость работы. Полученные результаты исследований форм гибели клеток у растений расширяют представление о роли биоэнергетических систем клетки и активных форм кислорода в программируемой гибели клеток. Программируемая гибель клеток играет важную роль в иммунитете растений, что может дать ключ к созданию новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам. Контроль над некрозом и апоптозом растений позволит создавать средства, регулирующие продолжительность жизни, синхронность созревания урожая. На основании полученных данных можно прогнозировать довизуальные симптомы генетических нарушений, происходящих в живых объектах под влиянием экстремальных факторов, осуществлять мониторинг окружающей среды. Отдельные положения работы могут быть использованы в преподавании практического курса по физиологии и биохимии растений.
Положения выносимые на защиту.
- Выделены компоненты индукции апоптоза из вытяжек колеоптилей
ячменя, пшеницы и молодого листа монстеры.
Апоптоз у растений выявляется с помощью ДНК- «лесенки», активности антиоксидантной системы и активности теломеразы.
Проявление апоптоза у однодольных и двудольных растений идентично.
- Модель физиолого-биохимической трансформации метаболизма растительных клеток при их апоптозе заключается в изменении активности антиоксидантов, нарушении проницаемости мембран, фрагментации ДНК по типу «лесенки» и снижении активности теломеразы.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены: на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009), региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Роль молодых ученых и специалистов в повышении эффективности растениеводства» (Орел, 2009), «Теоретические основы применения биотехнологии, генетики и физиологии растений в современной селекции растений и растениеводстве» (Брянск, 2009), Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), , конкурсе молодых ученых на лучшую научно - исследовательскую работу в рамках Московского международного конгресса « Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 15-17 марта 2010), на II, III этапе Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов, молодых ученых высших учебных заведений Минсельхоза России в номинации « Сельскохозяйственные науки» (Курск, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т.ч. З в журналах рецензируемых ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 231 источников, из них 170 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 62 рисунками.
