Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Липоксигеназное окисление жирных кислот 12
1.1.1 Липоксигеназы 13
1.1.2 Структурные особенности липоксигеназ 13
1.1 .3 Основные свойства липоксигеназ 14
1.1.3.1 Региоспецифичность 14
1.1.3.2 Оптическая и геометрическая специфичность 16
1.1.4 Механизм липоксигеназного окисления жирных кислот 16
1.1.5 Двойное диоксигенирование 17
1.1.6 Функциональное значение продуктов липоксигеназного окисления жирных кислот 19
1.2 Алленоксидсинтаза 21
1.2.1 Механизмы образования кетолов 22
1.2.2 Механизмы биосинтеза циклопентенонов 24
1.2.3 Вторичные превращения кетолов и циклопентенонов 27
1.2.4 Физиологическое значение продуктов алленоксидсинтазного пути28
1.3 Гидропероксидлиаза 32
1.3.1 Клонирование фермента и субстратная специфичность 32
1.3.2 Механизм действия ГПЛ 33
1.3.3 Распространенность и субклеточная локализация 36
1.3.4 Продукты ГПЛ и их физиологическая важность 36
1.4 Дивинилэфирсинтаза 39
1.4.1 Распространенность дивиниловых эфиров 39
1.4.2 Биосинтез дивиниловых эфиров 41
1.4.3 Механизм действия ДЭС 43
1.4.4 Биогенетическое происхождение ДЭС 46
1.4.5 Геометрическая изомерия дивиниловых эфиров 46
1.4.6 Физиологическая важность дивиниловых эфиров 47
1.5 Пероксигеназа 50
1.6 Оксилипинсодержащие сложные липиды 53
1.6.1 Эстолиды и тривернолины 53
1.6.2 Арабидопсиды 56
1.6.3 Фосфолипиды, содержащие дивиниловые эфиры 60
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
2.1 Материалы 61
2.2 Инкубация бесклеточного препарата листьев и корней льна с линолевой кислотой, 13 -ГПО Д исЗ-окса-13 -ГПОТ 61
2.3 Экстракция, предварительная очистка и дериватизация продуктов инкубации 62
2.4 Анализ и разделение продуктов 62
2.5 Получение липидного экстракта 62
2.6 Фракционирование липидного экстракта методом колоночной хроматографии 63
2.7 Тонкослойная хроматография 63
2.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография 63
2.9 Определение положения заместителей в глицериновом остатке молекул линолипинов 64
2.10 Возрастная зависимость содержания линолипинов в листьях льна 65
2.11 Инфицирование растений льна фитопатогенной бактерией Pectobacterium atrosepticum 65
2.12 Влияние метилового эфира (со52)-этероленовой кислоты и (2Е)-гексеналя на прорастание семян льна 65
2.13 Выделение гексеналя листьями льна 66
2.14 Спектральные исследования 66
Глава 3. Результаты и их обсуждение 68
3.1 Биосинтез оксилипинов in vitro в гомогенате листьев льна 68
3.1.1 Изучение направленности метаболизма линолевой кислоты в листьях льна 68
3.1.2 Идентификация соединения 1 68
3.1.3 Идентификация соединения 2 69
3.1.4 Идентификация соединения 3 74
3.2 Биосинтез оксилпинов in vitro в гомогенате корней льна 76
3.3 Обнаружение линолипинов 76
3.3.1 Изучение состава липидного экстракта листьев льна 76
3.3.2 Идентификация соединения 10, линолипина А 79
3.3.3 Идентификация соединения 12, линолипина В 90
3.3.4 Идентификация соединения 11, линолипина С 92
3.3.5 Идентификация содинения 13, линолипина D 94
3.4. Влияние однократного цикла замораживания - оттаивания на галактолипидный профиль листьев льна 96
3.5 Возрастная зависимость содержания линолипинов в листьях льна 98
3.6 Влияние метилового эфира (со52)-этероленовой кислоты и (2Е)-гексеналя на прорастание семян льна 99
3.7 Влияние инфицирования на содержание линолипинов 100
3.8 Деградация (co5Z)-этероленовой кислоты и линолипинов 100
Заключение 108
Выводы 110
Список литературы 112
- Функциональное значение продуктов липоксигеназного окисления жирных кислот
- Арабидопсиды
- Идентификация соединения 2
- Идентификация соединения 10, линолипина А
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. Оксилипины - оксигенированные производные непредельных жирных кислот - играют важную роль в клеточной сигнализации, а также механизмах защиты растений. Исследование этих процессов имеет существенное теоретическое и практическое значение. Липоксигеназный каскад, источник оксилипинов, контролируется липоксигеназами и ферментами метаболизма гидроперекисей жирных кислот. Ключевыми ферментами липоксигеназного пути являются липоксигеназы (ЛОГ), включая 13(5)-липоксигеназу (ЕС 1.13.11.12) и 9(5)-липоксигеназу (ЕС 1.13.11.58). Липоксигеназы животных, водорослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстрата Сго-жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений катализируют превращение Сі8-жирньіх кислот (линолевой и а-линоленовой кислоты). Продукты первичного действия липоксигеназы - гидроперекиси жирных кислот - являются предшественниками таких важных биорегуляторов, как жасмоновая кислота в растениях [Blee, 2002] и лейкотриены у млекопитающих [Samuelsson,1997].
К ферментам липоксигеназного пути, утилизирующим гидроперекиси жирных кислот, относятся гидропероксидлиаза (ГПЛ), алленоксидсинтаза (АОС) и дивинилэфирсинтаза (ДЭС). Многие продукты действия этих ферментов являются значимыми биорегуляторами. В частности, достаточно хорошо изучена 12-оксо-ФДК -предшественник 7-изожасмоновой кислоты, а также собственно 7-изо-жасмоновая кислота и родственные соединения, «жасмонаты». Эта группа физиологически активных веществ составляет новый класс фитогормонов и играет важную роль в сигнализации, регуляции экспрессии генов и в синтезе «жасмонат-индуцируемых белков» (в том числе ингибиторов протеиназ), регуляции роста и старения [Mathew et al., 1977; Hamberg, Gardner, 1992].
Значение дивиниловых эфиров в эндогенной регуляции у растений не так хорошо
изучено, как роль жасмонатов. Впервые дивиниловые эфиры (8ДГДЗ'2)-9-(Г,3'-
нонадиенилокси)-8-ноненовая (колнелевая) и (8ДГДЗ'Д6'2)-9-(Г,3',6'-
нонатриенилокси)-8-ноненовая (колнеленовая) кислоты были открыты Галлиардом с коллегами при экспериментах in vitro с клубнями картофеля [Galliard, Phillips, 1972; Galliard, Mathew, 1975]. Известно, что колнелевая и этеролевая кислоты ингибируют 9- и 13-липоксигеназы, соответственно [Corey et al., 1987; Weber et al., 1999]. Вебер с соавт. наблюдали специфическую экспрессию гена ДЭС и накопление колнелевой и колнеленовой кислот в листьях картофеля, зараженных патогеном Phytophthora infestans, и в листьях табака, зараженных вирусом табачной мозаики. Данные об ингибировании роста P. infestans колнелевой и колнеленовой кислотами позволили Веберу с соавт. предположить фунгицидную и протекторную роль дивиниловых эфиров и ДЭС [Weber et al, 1999].
До сих пор остается открытым вопрос о биологической роли оксилипинсодержащих сложных липидов. Наиболее изученными представителями этой
группы соединений являются арабидопсиды. Они представляют собой моно- или дигалактозилдиацилглицерины, содержащие остатки (152)-12-оксо-10,15-фитодиеновой кислоты (12-оксо-ФДК) или динор-12-оксо-ФДК. Обнаружено участие арабидопсидов в механизмах защиты растений от патогенов. Таким образом, сведения о липоксигеназном каскаде в целом и его метаболитах в частности остаются весьма отрывочными. Это касается в первую очередь оксилипинсодержащих сложных липидов, в состав которых входят дивиниловые эфиры.
Цель и задачи исследования. Цель данного исследования: изучить липоксигеназный путь в растениях льна.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Выделить и идентифицировать основные метаболиты а-линоленовой кислоты в растениях льна.
Исследовать содержание этерифицированных оксилипинов в липидном составе листьев льна.
3. Изучить состав липидов, образующихся в листьях льна в ответ на дейтсвие
экстремальных факторов.
Научная новизна работы. Полученные результаты расширяют представления о таком малоизученном классе соединений, как сложные оксилипины. Впервые показана активность дивинилэфирсинтазы в листьях льна, выделены и охарактеризованы метаболиты дивинилэфирсинтазного пути - (а)52)-этеролевая и (а)52)-этероленовая кислоты.
Впервые обаружена новая группа галактолипидов, содержащих этерифицированные остатки (а)52)-этероленовой кислоты. Для этой группы соединений предложено тривиальное название линолипины. Были выделены, очищены и охарактеризованы четыре представителя этого семейства - 1-0-а-линоленоил-2-0-((о52)-этероленоил-3-0-Р-Б-галактопиранозил-5/?-глицерин (линолипин А), 1,2-ди-0-((о52)-этероленоил-З-О-Р-Б-галактопиранозил-sn-глицерин (линолипин В), 1-0-этероленоил-2-0-((о52)-а-линоленоил-3-0-Р-В-дигалактопиранозил-5/?-глицерин (линолипин С) и 1,2-ди-0-(о)52)-этероленоил-3-0-Р-В-дигалактопиранозил-5/?-глицерин (линолипин D).
Показано, что содержание линолипинов зависит от возраста растений. Кроме того, состав и содержание линолипинов претерпевает значительные изменения при инфицировании растений фитопатогенной бактерией Pectobacterium atrosepticum и замораживании-оттаивании.
Научно-практическая значимость работы. Изучение роли окислительного метаболизма Cig-полиеновых кислот в жизнедеятельности растений имеет большое значение для понимания фундаментальных основ функционирования живых систем, а также для решения многих прикладных вопросов, связанных с использованием физиологически активных метаболитов как ростовых веществ, фунгицидов и др.
Полученные данные вносят вклад в понимание механизмов функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям.
Разработан комплекс подходов для выделения и очистки оксилипинсодержащих сложных липидов - потенциальных физиологически-активных веществ. Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся современными проблемами липидологии, изучением защитных и сигнальных систем растений, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2007 по 2010 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов - эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер 01200901959). Исследования автора, как исполнителя данной тематики, поддержаны грантами РФФИ, программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и ВНШ академика А.Н.Гречкина. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); на Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на III Азиатском симпозиуме по растительным липидам (Япония, Иокогама, 2009); на 13-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пушино, 2009); на Четвертом съезде ВМСО с международным участием (Москва, 2009); на Третьем Европейском симпозиуме по липидным медиаторам (Париж, 2010); на Третьем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в зарубежных рецензируемых изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 219 источников, из них 211 зарубежных. В работе представлено 4 таблицы и 42 рисунка.
Функциональное значение продуктов липоксигеназного окисления жирных кислот
Различные экстремальные факторы окружающей среды, в том числе поранение, механическая обработка, водный дефицит, инфекция, термальные повреждения, озонирование, ультрафиолетовое излучение, приводят к активации липоксигеназ и индукции экспрессии липоксигеназных генов [Bell, Mullet, 1991; Conconi et al, 1996; Maccarrone et al., 1992; Maccarrone et al., 1995; Mauch et al., 1997; Veronesi et al., 1996].
Это связано с тем, что липоксигеназное окисление является одним из первых звеньев целой цепи последовательно развивающихся защитных реакций, получивших название липоксигеназной сигнальной системы. Образующиеся в инфицированных растениях гидроперокси- и гидроксипроизводные линолевой и линоленовой кислот обладают мощной противомикробной активностью и являются самыми сильными фунгитоксичными метаболитами по сравнению с другими протестированными оксилипинами [Kato et al., 1992; Kato et al., 1993; Namai et al., 1993]. Кроме того, в ответ на поранение растительных тканей 13(5)-ГПОТ вместе с жасмоновой кислотой инициирует синтез ингибиторов протеиназ [Farmer, Ryan, 1992].
Защитными свойствами обладают и диоксигенированные жирные кислоты. В частности, было показано, что 9,16-диГПОД и родственные продукты выступают в качестве трансмембранных переносчиков ионов Са2+ и вызывают замедление дыхания в пораненных корнях пшеницы [Grechkin, 1998]. Учитывая структурное сходство с такими мощными биорегуляторами, как лейкотриены, можно предположить, что фитотриены и оксотриены являются сигнальными соединениями в растительных тканях, обладающих 9-липоксигеназной активностью.
Функциональное значение продуктов липоксигеназного катализа не ограничивается вышеприведенными примерами, поскольку оно заключается не только в непосредственном осуществлении и регуляции защитных реакций, но и в превращении гидроперекисей жирных кислот в разнообразные по своему химическому строению оксилипины, осуществляющие более тонкую и в ряде случаев более эффективную регуляцию различных биохимических процессов.
Арабидопсиды
Наиболее изучены липиды, содержащие метаболиты алленоксидсинтазного пути - арабидопсиды (Рис.16). Они представляют собой моно- и дигактозилдиацилглицерины, содержащие этерифицированные остатки 12-оксо-ФДК и динор-12-оксо-ФДК. Впервые, Стелмах с соавторами [Stelmach et al, 2001] обнаружили в арабидопсисе {Arabidopsis thaliana) моногалактозилдиацилглицерин, содержащий (7Z,10Z,13Z)-reKcaneKaTpHeHOByK кислоту и циклическое производное 13(S)-гидроперекиси а-линолевой кислоты - 12-оксо-ФДК. Определив структуру этого галактолипида - sn-1-0-(95", 135-12-оксо-фитодиенил)-«-2-0-(7Z,10Z,13Z-гeкcaдeкaтpиeнoил)-и-3-O-(P-D-гaлaктoпиpaнoзил)-глицepин -они назвали его MGDG-0 (Рис.16, соединение а). Авторы предполагают, что MGDG-0 может выступать мессенджером липолитической активности фитопатогенных грибов. Локально высвобожденная 12-оксо-ФДК может быть сигналом растению (напрямую или посредством превращения в жасмоновую кислоту) о фунгицидной атаке и, возможно, помогает локально активировать немедленную реакцию защиты.
Позднее, изучая биологически активные соединения из Arabidopsis thaliana, Хисаматсу с соавторами выделили два новых оксилипина, получивших название арабидопсиды А и В (Рис. 16) [Hisamatsu et al, 2003].
Эти сложные оксилипины представляют собой моногалактозилдиацилглицерины, содержащие остатки 12-оксо-ФДК и/или динор-оксо-ФДК. Авторы предполагают, что эти арабидопсиды могут участвовать в сигналинге при поранении, и также вызывать старение листьев овса [Hisamatsu et al., 2006].
Позднее этот же коллектив выделил еще два представителя этой группы галактолипидов: арабидопсиды С и D [Hisamatsu et al., 2005]. Используя методы ЯМР и масс-спектрометрии, а также ряд химических методов, они установили структуру этих соединений (Рис.16). Изучая изменения оксилипинового профиля растений арабидопсиса во время реакции сверхчувствительности, Андерссон с коллегами выделили и идентифицировали арабидопсид Е [Andersson et al., 2006]. В том же году был открыт еще один представитель этой группы оксилипинсодержащих липидов - арабидопсид F [Nakajyo et al., 2006]. Позднее Курченко с коллегами показали, что распознавание белков авирулетности растениями арабидопсиса приводило к увеличению уровня содержания галактолипида, содержащего 2 этерифицированных остатка 12-оксо-ФДК и один остаток динор-12-оксо-ФДК. Для этого сединения было предложено название арабидопсид G [Kourtchenko et al., 2007].
Хорошо известна физиологическая роль 12-оксо-ФДК и дальнейшего продукта ее превращения - жасмоновой кислоты. Однако, роль арабидопсидов до сих пор точно не установлена. Было показано, что уровень содержания арабидопсидов значительно возрастает при поранении или заражении [Andersson et al., 2006; Buseman et al., 2006]. Накопление метаболитов в результате распознавания бактериальных Avr-белков можно интерпретировать различными способами [Kourtchenko et al., 2007]. Во-первых, метаболит может выступать медиатором защитного сигнала in planta; во-вторых, метаболит может напрямую или косвенно принимать участие в реакции сверхчувствительности; в-третьих, метаболит может иметь антипатогенные свойства; в-четвертых, метаболит может выступать прекурсором более эффективного соединения и, наконец, метаболит может оказаться побочным продуктом реакции растения.
Бузман с коллегами считают, что поскольку молекулярные виды МГДГ и ДГДГ, содержащие две цепочки ОФДК или динор-ОФДК, являются основными продуктами, образующимися в ответ на поранение, можно предположить, что липоксигеназа охотнее действует на локализованные в пластидах липиды, чем на свободные жирные кислоты [Buseman et al., 2006]. Несмотря на то, что наиболее распространенная в пластидах липоксигеназа -липоксигеназа 2 - необходима для синтеза жасмоновой кислоты [Bell et ah, 1995] и взаимодействует со свободными жирными кислотами, особенно с 18:3 [Bachmann et ah, 2002], было показано, что соевая липоксигеназа может взаимодействовать непосредственно с исходными фосфолипидами [Brash et ah, 1987; Tokumura et al., 2000]. В листьях арабидопсиса дикого типа наиболее распространены такие молекулярные виды полярных сложных липидов, как 18:3-16:3 МГДГ, 18:3-18:3 МГДГ и 18:3-18:3 ДГДГ. Таким образом, высокий уровень образования ОФДК-днОФДК МГДГ, ОФДК-ОФДК МГДГ и ОФДК-ОФДК ДГДГ согласуется с гипотезой прямого превращения этерифицированных 18:3 и 16:3 в ОФДК и днОФДК, соответственно. По всей вероятности липоксигеназа может взаимодействовать с двумя ацильными цепочками одного липида, нежели с двумя ацильными цепочками разных молекул, благодаря близости второго ацильного субстрата в исходном сложном липиде. Если молекулярные виды диоксилипинов образованы интактными пластидными сложными липидами, то в то же время уменьшение количества диоксилипиновых видов и сопутствующее увеличение количества видов с одинарной оксилипиновой цепочкой может происходить через деацилирование диоксилипиновых видов, за которым следует переацилирование нормальноцепочечной жирной кислотой. Очень быстрое и значительное увеличение уровня содержания ОФДК-динор-ОФДК и ОФДК-ОФДК видов позволяет логично предположить, что эти молекулярные виды скорее образуются из интактных галактолипидов, нежели из свободных жирных кислот. В первые 15 минут после поранения уровень содержания ОФДК-динор-ОФДК и ОФДК-ОФДК галактолипидов увеличивался от 200 до 1000 раз, в то время как для свободной ОФДК показано 3-5 кратное увеличение в первые несколько часов после поранения [Weber et al., 1997; Stelmach et al., 2001; Stintzi et al., 2001]. Уровень содержания других свободных жирных кислот, таких как 18:3, также увеличивался после поранения, хотя и на небольшую величину, примерно в два раза [Zien et al., 2001].
Кроме того, было показано, что в случае поранения увеличивается общее содержание арабидопсидов, в то время как в реакции сверхчувствительности уровень арабидопсидов А и В уменьшается, а арабидопсидов Е и G, напротив, увеличивается. Тем самым, предполагается, что в случае реакции сверхчувствительности, более эффективным будет образование триацилированных галактолипидов.
Также следует отметить, что арабидопсиды ингибируют прорастание корней кресс-салата (Рис.17) [Hisamatsu et al., 2004].
Идентификация соединения 2
Соединение 2 имело максимум поглощения в УФ-спектре при 267 нм. Масс-спектр электронного удара метилового эфира продукта 2 имел молекулярный ион с m/z 306, а картина фрагментации, была идентична фрагментации метиловых эфиров этероленовой [Grechkin et aL, 1995, 1997] (со52)-этероленовой кислот [Hamberg, 1998]. Каталитическое восстановление соединения 2а привело к образованию уже описанной выше 13-окса-нонадекановой кислоты. Таким образом, исходя из разницы масс молекулярных ионов соединений 4 и 2а, можно сделать вывод, что последнее имело 4 двойные связи. Их положение и геометрия были установлены при помощи данных спектров !Н ЯМР и 2D-COSY. На основании полученных данных нами был сделан вывод, что соединение 2 является (9Z,\\E,VZ,VZ)-12-(Г,3 -гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой, иначе говоря (co5Z)-этероленовой кислотой.
Для дальнейшего подтверждения in vitro активности ДЭС и биосинтеза (со52Г)-этероленовой кислоты в листьях льна мы провели инкубацию гомогената листьев льна с 13-гидроперекисью 3-окса-а-линоленовой кислоты. 3-окса-а-линоленовая кислота - это недавно синтезированный и охарактеризованный аналог а-линоленовой кислоты, используемый в качестве метки для изучения биосинтеза оксилипинов.
Супернатант был проинкубирован с З-окса-13-ГПОТ. ГХМС анализ метиловых эфиров продутов инкубации позволил нам обнаружить (наряду с эндогенным метиловым эфиром (со52)-этероленовой кислоты) присутствие новых продуктов 5 и 6 в виде их метиловых эфиров 5а и 6а. По данным масс-спектра электронного удара соединения 5а мы предположили схему фрагментации, изображенную на рис.216.
Каталитическое восстановление соединения 5а привело к образованию продукта 7, по масс-спектрометрической фрагментации которого мы установили, что это 3,13-диокса-нонадекановая кислота. Полученные результаты подтверждают идентификацию соединения 5 как 3-окса-(со52)-этероленовую кислоту. Эксперимент с З-окса-13-ГПОТ подтверждает in vitro присутствие активности ДЭС и эндогенной (со52Г)-этероленовой кислоты в гомогенате листьев льна. Сравнение хроматограмм по полному ионному току показало, что содержание эндогенной (со5.2Г)-этероленовой кислоты в гомогенате листьев достигает 10% от общего количества выделенных свободных жирных кислот.
Идентификация соединения 10, линолипина А
УФ-спектр очищенного соединения 10 показал поглощение с максимумом при 267 нм и был идентичен вышеописанному дивиниловому эфиру (со52Г)-этероленовой кислоты [Hamberg, 1998]. В результате ГМХС анализа метиловых эфиров жирных кислот - полученных трансэтерификацией соединения 10 - были выявлены метиловые эфиры а-линоленовой и (со52)-этероленовой кислот. Чтобы доказать структуру (a 5Z)-этероленовой кислоты, мы изучили ее масс-спектр. По данным масс-спектрометрии электронного удара, спектр метилового эфира продукта трансэтерификации соединения 10 был идентичен спектру ранее описанного метилового эфира (со52)-этероленовой кислоты. Кроме того, по данным ГХМС анализа, каталитически восстановленные метиловые эфиры жирных кислот после трансэтерификации представляли собой метилстеарат и метиловый эфир 13-окса-нонадекановой кислоты. Образование последнего соединения однозначно указывает на присутствие (со52)-этероленовой кислоты среди продуктов трансэтерификации.
Масс-спектр соединения 10 при ионизации в электроспрее в режиме отрицательных ионов дал квазимолекулярный ион [М-Н]" с m/z 787,4909 (С45Н71О1О и аддукт [М+СНзСОО]" с m/z 847,5229 (С47Н75О13). MS/MS спектр от иона с m/z 787,4909 показал ионы с m/z 291,1954 (С18Н27О3, анион (co5Z)-этероленовой кислоты) и с m/z 277,2120 (С18Н29О2, анион а-линоленовой кислоты). В результате съемки в режиме положительных ионов был обнаружен ион [M+NH4]+ с m/z 806,5418 (C45H76O11N). MS/MS от иона с m/z 806,5418 привел к образованию характеристического фрагмента с m/z 529,3287 (C27H47O9N, потеря остатка а-линоленовой кислоты). По результатам полученных данных масс-спектрометрии высокого разрешения, а также данных MS/MS, было установлено, что соединение 10 представляет собой моногалактозилдиацилглицерин с брутто-формулой С45Н72О11, в структуре которого содержится один остаток а-линоленовой кислоты и один (co5Z)-этepoлeнoвoй.
Данные ЯМР подтверждают идентификацию соединения 10 как МГДГ (Рис.25а). Химический сдвиг (4,18 м.д.) и константа взаимодействия (7,4 Гц) аномерного протона НГ доказывает (3-связь. Другие константы взаимодействия протонов галактозы {J2\y = 9,7 Гц; JT,y = 3,3 Гц) и химические сдвиги показывают присутствие одной P-D-галактопиранозильной части в структуре соединения 10, что полностью согласуется с литературными данными [Hisamatsu et ah, 2003; Hisamatsy et ah, 2005; Andersson et al., 2006; Kourtchenko et ah, 2007]. Сигналы протонов глицерина Hla,b (4,32 и 4,18 м.д.) и Н2 (5,19 м.д.) сдвинуты по отношению к сигналам НЗа,Ь (3,89 и 3,68 м.д.). Это говорит о присутствии эфирной связи в sn-\ и sn-2 положении и P-D-галактопиранозильного остатка в sn-3 положении. Олефиновая часть спектра показывает присутствие одного остатка а-линоленовой кислоты (сигналы шести протонов двойный связей Н9"", НЮ"", Н12"", Н13"", Н15"" и Н16"" с химический сдвигом 5,27-5,45 м.д.; триплет двух интеролефиновых метиленов НИ"" и Н14"", химический сдвиг 2,81 м.д., четыре протона). Остаток второй жирной кислоты дает сигналы восьми олефиновых протонов: Н9" (5,31 м.д., m), НЮ" (8,7 м.д., dd), НИ" (6,07 м.д., ddd), Н12" (6,72 м.д., d), HI" (6,32 м.д., d), Н2" (5,53 м.д., ddt), НЗ" (6,26 м.д., dddt) и Н4" (5,42 м.д., т). Эти сигналы, их мультиплетность, константы взаимодействия, а также расположение спин-спиновых взаимодействий (оцененные при помощи данных 2D-COSY) позволили нам идентифицировать остаток этой жирной кислоты как (9Z,11,Г2,3 2)-12-(Г,3 -гексадиенил-окси)-9,11-додекадиеновую кислоту. Спектральные данные полностью соответствуют литературным данным для (со52Г)-этероленовой кислоты. В результате обработки данных МС и ЯМР было установлено, что соединение 10 представляет собой МГДГ, содержащий один остаток а-линоленовой кислоты и один - (co5Z)-этероленовой. Однако, ни данные МС, ни ЯМР не позволяют установить точное положение остатков а-линоленовой и (а 52)-этероленовой кислот в молекуле глицерина.
Для того чтобы уточнить их расположение мы провели региоспецифичный гидролиз, используя sn-\-специфичную липазу Rhizopus arrhizus. По данным ГХМС анализа, в результате действия липазы отщеплялась только а-линоленовая кислота. В то же время, при обработке соединения 10 неспецифичной липазой Mucor javanicus высвобождались обе жирные кислоты, и а-линоленовая, и (со52Г)-этероленовая. Полученные данные демонстрируют, что остатки а-линоленовой и (ю52)-этероленовой кислот этерифицированы в положениях sn-\ и sn-2, соотвественно. Принимая во внимание все полученные для этого соединения результаты, установлено, что соединение 10 представляет собой 1- 9-а-линоленоил-2-0-(со52) этероленоил-З-О-Р-Б-галактопиранозил-яя-глицерин. Это первый представитель нового семейства сложных оксилипинов - галактолипидов, содержащих этерифицированные дивиниловые эфиры. Нами было предложено тривиальное название линолипин А для соединения 10 и общее название линолипины для этого нового семейства сложных оксилипинов.
