Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления о механизмах взаимодействия патогенов и растений (обзор литературы) 16
1.1. Природа устойчивости растений к фитопатогенам 16
1.2. Активные формы кислорода и их функции при патогенезе 22
1.3. Защитная роль лигнина при инфицировании патогенными микроорганизмами 30
1.4. Синтез PR-белков - универсальная защитная реакция растений 37
1.5. Индуцирование естественных механизмов устойчивости растений .42
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 47
2.1. Объекты исследований 47
2.1.1. Инфицирование растений пшеницы грибными патогенами с различным типом питания 48
2.1.2. Препараты, используемые для обработки растений 49
2.1.3. Фиксация растительного материала 50
2.2. Методы исследований 50
2.2.1. Выделение оксалатоксидазы различной локализации в клетке и определение ее активности 50
2.2.2. Получение экстрактов свободной и связанной с клеточными стенками пероксидазы 51
2.2.3. Определение активности пероксидазы 51
2.2.4. Электрофоретическое разделение белков 52
2.2.5. Оценка активности фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) и тирозинаммиак-лиазы (ТАЛ) 53
2.2.6. Определение содержания белка 53
2.2.7. Хемилюминесцентное определение содержания перекиси водорода (Н2О2) в среде инкубации проростков пшеницы 54
2.2.8. Использование 3,3-диаминабензидина для выявления генерации Н202 в растительных тканях 54
2.2.9. Определение активности окисления фенольных соединений проростками пшеницы 55
2.2.10. Определение содержания лигнина в растительных гканях 56
2.2.11. Экстракция фитогормонов и количесвенный анализ ИУК, АБК и цитокининов в растительном материале 56
2.2.12. Определение активности протеиназ и их белковых ингибиторов58
2.2.12.1. Определение активности протеиназ, расщепляющих субстрат Ы-а-бензоил-ОЬ-аргинин-4-нитроанилид(БАПНА) 59
2.2.12.2. Определение активности ингибиторов протеиназ 59
2.2.13. Выделение ДНК из растений 60
2.2.14. Получение очищенной РНК из растительного материала 61
2.2.15. Подготовка праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) 62
2.2.16. Полимеразная цепная реакция 62
2.2.17. Реакция обратной транскрипции РНК 63
2.2.18. Электрофорез продуктов амплификации ДНК и РНК в агарозных и полиакриламидных гелях 63
2.2.19. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 64
2.2.20. Статистическая обработка результатов 64
Глава III. Результаты исследований и их обсуждение...65
3.1. Генерация сигнальных молекул - начальный этап формирования защитного ответа растений при грибной инфекции 65
3.1.1. Участие внеклеточных окислительных ферментов в генерации сигнальных молекул 66
3.1.2. Регуляция процессов образования перекиси водорода (Н2О2) на ранних стадиях патогенеза 71
3.1.3. Усиление окисления фенолов - неспецифическая реакция растений на стресс 79
3.1.4. Оксалатоксидаза - один из ключевых ферментов в формировании защитных реакций растений к грибным патогенам 89
3.1.5. Регуляции защитного ответа растений элиситорами 106
3.2. Процессы лигнификации в тканях растений при инфицировании пшеницы грибными патогенами 116
3.2.1. Активность ферментов фенольного обмена, накопление лигнина в растениях пшеницы при патогенезе 116
3.2.2. Интенсификация процессов синтеза лигнина в растениях 128
3.3. Роль гормонов в становлении взаимоотношений растение - патоген 133
3.3.1. Гормональный статус растений пшеницы различной устойчивости при заражении грибными патогенами 136
3.3.1.1. Корневая гниль {Bipolaris sorokiniana) 136
3.3.1.2. Твердая головня (Tilletia caries) 142
3.3.1.3. Септориоз {Septoria nodorum) 144
3.3.2. Влияние росторегулирующих препаратов на содержание гормонов в растения пшеницы при инфицировании 152
3.4. Протеолитических ферментов как компоненты защитной системы растений 155
3.4.1. Протеолитические ферменты патогенных грибов и их роль при патогенезе 155
3.4.2. Активность протеиназ и их ингибиторов в тканях устойчивых и восприимчивых сортов пшеницы при грибном патогенезе 159
3.4.3. Влияние индукторов устойчивости на активность ингибиторов протеиназ в растениях пшеницы 177
3.5. Изучение механизмов защитного действия индукторов устойчивости в культуре in vitro 180
3.5.1. Индукция защитного ответа в клетках пшеницы под воздействием хитоолигосахаридов 181
3.5.2. Индукция защитных реакций в каллусах пшеницы под воздействием салициловой кислоты 185
3.5.3. Влияние фунгицидов и иммуностимуляторов на формирование защитного ответа каллусов пшеницы к Т. caries 189
3.5.4. Изменение устойчивости каллусов пшеницы к Т. caries при ингибировании активности оксалатоксидазы 195
3.5.5. Влияние экзогенной перекиси водорода на защитные реакции куллусов пшеницы 200
Заключение 205
Выводы 209
Список литературы 211
- Защитная роль лигнина при инфицировании патогенными микроорганизмами
- Выделение оксалатоксидазы различной локализации в клетке и определение ее активности
- Участие внеклеточных окислительных ферментов в генерации сигнальных молекул
- Активность протеиназ и их ингибиторов в тканях устойчивых и восприимчивых сортов пшеницы при грибном патогенезе
Введение к работе
Инфекционные болезни растений наносят значительный ущерб урожайности сельскохозяйственных культур. Потери урожая зерновых и зернобобовых культур от грибных болезней могут доходить до 30% [Тютерев, 2002]. Как известно, для защиты растений от болезней широко используются химические средства, подавляющие рост и развитие патогенных микроорганизмов. Однако интенсивное применение пестицидов биоцидной природы приводит, с одной стороны, к химическому загрязнению экосистем, и с другой - к появлению высокорезистентных к пестицидам форм патогенов. Одним из широко применяемых методов защиты растений от патогенов является создание и использование устойчивых к болезням сортов и линий сельскохозяйственных культур. Однако на практике оказывается, что гены устойчивости довольно быстро преодолеваются патогенами.
Наиболее перспективным и экологически безопасным способом защиты растений является использование препаратов, стимулирующих защитные механизмы растительного организма. В связи с этим, познание природы и механизмов формирования защитных реакций растений является актуальной задачей.
Устойчивость растений к различным инфекциям определяется комплексом физиолого-биохимических реакций, каждая из которых способствует защите от патогена [Метлицкий, 1976; Токин, 1980; Метлицкий и др., 1984; Метлицкий, Озерецковская, 1985; Курсанова, 1988; Ильинская и др., 1991; Озерецковская и др., 1993; Кораблева, Платонова, 1995; Тютерев, 2002; Тарчевский, 2002]. Одним из приоритетных направлений современной биологии является расшифровка сигналинга защитных реакций в растениях при инфицировании патогенами. В растительных тканях выявлен целый ряд сигнальных молекул, запускающих каскад ответных биохимических реакций в организме растений при контакте с патогеном. Такую роль могут выполнять фитогормоны, олигосахариды, жасмонат, салицилат, окись азота и некоторые другие соединения [Ильинская и др., 1991; Озерецковская и др., 1993; Кораблева, Платонова, 1995; Тютерев, 2002; Тарчевский, 2002]. Предполагается, что сигнальные молекулы не только участвуют в формировании первичных ответных реакций, но и определяют характер последующих биохимических и физиологических процессов, обуславливающих степень адаптации и устойчивости растений к действию патогенов [Дмитриев, 2003].
Одной из наиболее ранних ответных реакций растительного организма на внедрение патогена является локальная генерация активных форм кислорода (АФК) - окислиіельньїй взрыв, запускающий цепь последующих защитных реакций [Hippeli et al., 1999; Droge, 2002]. Так, в тканях растений при патогенезе резко повышается концентрация свободных радикалов (супероксидного 02 , гидроксильного ОН") и перекиси водорода (Н2О2). Несмотря на наличие многочисленных экспериментальных данных об участии АФК в индукции защитного ответа в растениях, источники и способы генерации этих соединений при патогенезе остаются малоизученными. Имеются сведения о том, что образование АФК в ходе окислительного взрыва катализируется оксислительно-восстановительными ферментами, локализованными на поверхности клеток [Bestwick. et al., 1997; Kawano, 2002; Blochina et al., 2003; Минибаева, 2005]. В частности, продукция Н202 в растительных тканях может активироваться ферментом оксалатоксидазой, способной окислять оксалаты с образованием Н2О2 [Dumas et al., 1995]. Изучение роли этой оксидазы при патогенезе представляется очень важным, так как щавелевая кислота является одним из факторов патогенности грибов [Berna, Bernier, 1999] и от возможности его утилизации растением во многом зависит исход противоборства хозяина и паразита. Известно, что перекись водорода участвует в запуске СВЧ-реакции, процессов лигнификации, а также может проявлять прямую антимикробную активность [Bolwell et al., 2002].
Аппарат воздействия на растение у фитопатогенов включает, по крайней мере, две группы разных веществ - токсины (гормоны) и гидролитические ферменты. Способность патогенных грибов секретировать в окружающую среду соединения, обладающие фитогормональной активностью [Angra et al, 1990; Кобыльский, 1990; Волынец и др., 1993], может приводить к нарушению гормонального статуса растительного организма и снижению эффективности протекания защитных реакций. Выявление характера и степени нарушения состояния гормональной системы инфицированного растения в зависимости от типа возбудителя болезни, несомненно, будет способствовать раскрытию разнообразия механизмов защиты.
К числу важнейших защитных биохимических процессов, проявляющихся как при механическом повреждении растительных тканей, так и в ходе развития ответных реакций на внедрение патогенов относится лигнификация [Stafford, 1988; Ильинская и др., 1991; Anterola, Lewis, 2002; Amthor, 2003]. Несмотря на многочисленные сведения о накоплении лигнина в растительных тканях при патогенезе, механизмы регуляции этого процесса пока не ясны. Можно полагать, что важную роль в регуляции этих процессов выполняют фитогормоны. Способность патогена к внедрению и развитию в растительном организме в значительной мере зависит также от активности внеклеточных гидролаз, в частности, протеолитических ферментов [Ибрагимов и др., 1995; Сапунова и др., 1997; Ryan, 2000; Валуева, Мосолов, 2004; Дунаевский и др., 2005.]. Предполагается, что взаимодействие протеолитических ферментов и ингибиторов в значительной мере определяет исход противоборства хозяина и патогена.
Таким образом, молекулярные механизмы развития устойчивости растений к грибным патогенам еще далеки от окончательной разгадки.
Деіальное изучение состояния гормональной системы, активности ферментов, участвующих в регуляции уровня продукции перекиси водорода, процессов лигнификации, образования защитных соединений в растениях при инфицировании грибными патогенами с различным типом питания, позволит, в конечном итоге, подойти к решению проблемы управления фитоиммунитетом.
Цель работы
Выявить механизмы, обеспечивающие формирование устойчивости растений пшеницы к возбудителям грибных болезней с различным типом питания.
Задачи исследований
1. Проанализировать характер изменения активности оксалатоксидазы в растениях пшеницы различной устойчивости при заражении грибными патогенами и сопоставить с уровнем продукции перекиси водорода.
2. Оценить значение гормональной системы в регуляции защитного ответа растений пшеницы при заражении возбудителями грибных болезней с различным типом питания.
3. Провести сравнительный анализ экспрессии гена анионной пероксидазы, активности фенилаланинаммиак-лиазы, тирозинаммиак-лиазы, и интенсивности накопления лигнина в различных по устойчивости сортах пшеницы при инфицировании грибными патогенами и обработке индукторами болезнеустойчивости.
4. Проанализировать характер изменения активности ингибиторов протеиназ в различающихся по устойчивости растениях пшеницы при инфицировании патогенными грибами.
5. Исследовать пути регуляции защитных реакций растений пшеницы индукторами устойчивости различной природы.
Положения, выносимые на защиту
В основе эффективного развития защитного ответа растений пшеницы на инфицирование грибными патогенами лежит перестройка в гормональной системе, связанная с повышением содержания цитокининов на фоне относительно стабильного баланса ИУК и АБК.
Генерация перекиси водорода, сопряженная с активацией оксалатоксидазы, является начальным этапом формирования защитного ответа растений пшеницы на инфицирование грибными патогенами. Определяющее значение в развитии защитных реакций выполняет связанная с клеточной стенкой форма фермента. Активность оксалатоксидазы находится под контролем гормональной системы растения, а также может регулироваться хитоолигосахаридами, салициловой кислотой и химическими индукторами устойчивости с рострегулирующими свойствами.
Признаком устойчивых форм пшеницы является высокий постинфекционный уровень накопления лигнина, обусловленный ранней и значительной активацией ферментов фенилаланинаммиак-лиазы и тирозинаммиак-лиазы, а также усилением экспрессии гена анионной пероксидазы и повышением ее активности.
Важный вклад в реализацию устойчивости пшеницы вносят белки-ингибиторы, подавляющие индуцируемую патогенами активность протеолитических ферментов. В тканях устойчивых форм пшеницы подавление активности ферментов протекает более эффективно за счет высокого содержания в растениях свободных ингибиторов.
Научная новизна
Выявлена интегральная роль цитокининов в формировании защитного отвеїа растений пшеницы к грибным патогенам с различным типом питания (некротрофы, биотрофы, гемибиотрофы).
Обнаружено, что значительный вклад в продукцию перекиси водорода в растительных тканях при инфицировании грибными патогенами вносит оксалаюксидаза, связанная с клеточной стенкой.
Впервые показано, что защитный механизм химических и природных индукторов устойчивости растений связан с их участием в генерации перекиси водорода на ранних этапах патогенеза. Выявлены пути регуляции защитного ответа растений хитоолигосахаридами и салициловой кислотой, которые, наряду с активацией оксалатоксидазы, индуцируют экспрессию гена анионной пероксидазы, что приводит к усилению синтеза лигнина в непосредственной близости от инфекционных структур патогена.
Получены данные о способности химических индукторов устойчивости усиливать активность свободных белковых ингибиторов в тканях вегетирующих растений пшеницы и таким образом повышать ее устойчивость к инфицированию грибными патогенами.
Выявлена защитная функция окисления фенолов растениями пшеницы с участием оксалатоксидазы и пероксидазы при инфицировании грибными патогенами с различным типом питания. Одним из механизмов подавления защитного ответа растений при грибном патогенезе является ингибирование активности пероксидазы в данной реакции под воздействием ИУК.
Практическая значимость работы
Разработан метод выявления внеклеточной генерации перекиси водорода с участием оксалатоксидазы, при котором активность окисления фенольного субстрата ортофенилендиамина может быть использована для оценки степени устойчивости растений пшеницы к грибным патогенам.
Обобщенные экспериментальные данные могут быть использованы для решения исследовательских задач фундаментального и прикладного характера, в том числе, направленных на повышение устойчивости растений пшеницы к широкому кругу фитопатогенных грибов и создание экологически безопасных иммуностимуляторов нового поколения.
Выявленная способность различных соединений стимулировать образование перекиси водорода в культуре in vitro может быть использована для быстрого и эффективного скрининга новых средств защиты растений.
Апробация работы
Основные результаты работы докладывались на Всероссийских съездах общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993; Москва, 1999; Пенза, 2003), общества биохимиков (Москва, 1997, 2004; С.-Петербург, 2002), общества генетиков и селекционеров (Москва, 1994, 2004; С.-Петербург, 2000), по защите и иммунитету растений (С.-Петербург -Пушкин, 1995, 2002, 2005), конференциях «Физиолого-биохимические основы иммунитета растений к грибным болезням» (Уфа, 1988), «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1993, 1999, 2001), «Иммуноанализ регуляторов роста» (Уфа, 1992, 2000), «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 1998, 2000), «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на международных конгрессах и симпозиумах FESSP (Varna, 1998; Budapesht, 2000; Krit, 2002; Krakow, 2004), «Молекулярная и клеточная биология на рубеже веков» (Алматы, 1999), «Микология и криптогамная ботаника в России» (С.-Петербург, 2000), «Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье» (Алушта, 1998), «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Москва, 2001; С.-Петербург, 2003; Казань, 2006), «Plant Growth Substances» (Brno, 2001), «Геном растений» (Одесса, 2003), «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 1999, 2003; Москва, 2005), «Molecular Plant - Microbe Interactions» (С.-Петербург, 2003), «Регуляция роста и продуктивности растений» (Минск, 2005), «Signaling systems of Plant cell» (Москва, 2001; Казань, 2006), «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2006).
Связь с планами НИР
Работа выполнялась в соответствии с планами НИР Института биохимии и генетики УНЦ РАН по темам «Устойчивость пшеницы к ірибньїм заболеваниям и пути ее повышения» (№ гос. регистрации 01.92.018387), «Молекулярные механизмы развития ранних защитных реакций растительных клегок при повреждении фитопатогенными грибами» (№ гос. регистрации 01.99.008298), «Эндогенная регуляция сигнальных молекул при грибных инфекциях растений» (№ гос. регистрации 01.2002.05309).
Конкурсная поддержка работы
Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 01-04-48495) «Хитин-специфичные пероксидазы как регуляторы интенсивности элиситорных сигналов при грибном патогенезе» и (№ 05-04-48310) «Сигнальная регуляция устойчивости пшеницы к стрессовым факторам различной природы».
Публикации
Основные результаты исследований отражены в 53 научных публикациях, в том числе 26 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов докторских диссертаций, 2 статьи в зарубежной печати.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка используемой литературы (637 работ, в том числе 404 на иностранных языках). Диссертация изложена на 277 стр., содержит 42 таблицы и 45 рисунков.
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.
Защитная роль лигнина при инфицировании патогенными микроорганизмами
В растительных тканях оксалатоксидаза (КФ 1.2.3.4) катализирует окисление оксалатов с образованием С02 и Н202 [Thompson et al., 1995]. Фермент относится к металлопротеинам (Mn ) [Коуата, 1988]; в растениях находится в свободной, связанной с мембранами и клеточными стенками формах [Berna, Bernier, 1997; Zhou et al., 1998; Goyal et al., 1999; Vuletich, Sukalovich, 2000; Ramputh et al., 2002].
Наиболее высокая активность оксалатоксидазы наблюдается в проростках, по мере роста и развития растений активность фермента значительно снижается [Davoine et al., 2001]. Оксалатоксидаза и сопряженное с ее активацией образование Н202 играют важную роль в модификации клеточной стенки при прорастании семян [Lane et al., 1993]. Поэтому этот фермент причисляют к группе germin-белков [Lane et al., 1993; Dumas et al., 1995].
Щавелевая кислота является фактором патогенности ряда грибов [Berna, Bernier, 1999; Dunwell et al., 2000]. Оксалатоксидаза не только участвует в генерации сигнальных молекул, но и непосредственно утилизирует щавелевую кислоту. От способности растения нейтрализовать этот фактор патогенности зависит устойчивость растительных тканей к патогену [Davoine et al., 2001], поскольку хелатирование щавелевой кислотой ионов кальция приводит к нарушению функционирования сигнальных систем [Godoy et al., 1990]. При инокуляции возбудителем мучнистой росы, оксалатоксидаза выполняет ключевую роль в генерации перекиси водорода, что обеспечивает эффективное развитие СВЧ-реакции растений ячменя с вертикальной устойчивостью [Zhou et al., 2000].
Повышенный уровень перекиси водорода в растительных клетках возможен также и за счет торможения процессов ее утилизации. Основными ферментами, участвующими в утилизации Н202, являются каталаза и пероксидаза [Чиркова, 2002]. Поэтому ингибирование активности этих ферментов, например, салициловой кислотой (СК) способствует повышению концентрации Н202 в тканях [Durner, Klessing, 1997; Kawano et al., 1998; Ganesan, Thomas, 2001]. Ряд авторов предполагает, что подобный механизм также может иметь место в развитии системной приобретенной устойчивости (СПУ) [Chen et al., 1993; Dong, 1995; Conrath et al., 1995; Kawano et al., 2003].
Пероксидазы в живых организмах защищают клетки от разрушительного действия перекиси водорода, являясь эффективными антиоксидантами [Olmos et al., 1997; Von Tiedeman, 1997; Саприн, Калинина, 1999]. Однако они могут проявлять и оксидазную активность [Лебедева, Угарова, 1997; Mitra et al, 2000; Рогожин, 2004]. Высокая супероксидсинтазная активность характерна для пероксидаз, локализованных в клеточной стенке и способных легко от нее отрываться [Martinez, et al., 2000; Минибаева, Гордон, 2003; Ranieri et al., 2003].
СК способствовует генерации АФК за счет усиления секреции этих форм пероксидазы в апопласт [Martinez, et al., 2000; Минибаева, Гордон, 2003; Ranieri et al., 2003]. СК может регулировать уровень АФК в клетке за счет модулирующего действия на активность пероксидаз, перераспределения свободных и связанных форм фермента [Durner, Klessig, 1994; Guan, Scandalios, 1995; Шакирова, 2001; Сахабутдинова и др., 2004].
Длительное сохранение высоких концентраций молекул АФК в тканях может приводить к деструкции растительных клеток [Тарчевский, 2000; Зенков и др., 2001]. Снижение содержания перекиси водорода в клетке происходит за счет активации аншоксидантных ферментов, снижения активности НАДФН-оксидаз, разрушения перекиси водорода каталазой [Willekens et al., 1997], потреблении Н2О2 в аскорбат-пероксидазной реакции аскорбат-глутатионового цикла [Blokhina et al., 2003; Медведев 2004]. Часть ЬЬСЬ мигрирует через плазмалемму и используется в пероксидазных реакциях с образованием лигнина. Как видно, совокупность про- и антиоксидантных ферментов растений представляет сложную полиферментную систему, ответственную за уровень АФК вне- и внутри клетки, от функционирования которой зависит успешное развитие защитных реакций при патогенезе.
В настоящее время установлена регуляторная роль низкомолекулярных соединений (салицилаты, жасмонаты, этилен и перекись водорода) в индукции генов, ответственных за формирование защитных реакций в растительном организме [Тарчевский, 2002; Тютерев, 2002; Шакирова, Сахабутдинова, 2003]. Важную роль в процессе индукции играют ЛФК. При контакте патогена с растительнми клетками образуются АФК, способствующие трансдукции элиситорного сигнала [Лапикова и др., 2000; Mittler, 2002; Blokhina et al., 2003]. В нескольких лабораториях получены трансгенные растения с генами, ответственными за развитие СВЧ-реакций, соответственно, обладающие устойчивостью к широкому спектру патогенов [Бурьянов, 1999; Rizhsky, Mittler, 2001; Pappinen et al., 2002].
Накопление и отложение лигнина рассматривается как один из важных способов модификации клеточных стенок растений при взаимодействии их с патогенными микроорганизмами [Vance et al., 1980; Stafford, 1988; Ильинская и др., 1991; Метлицкий и др., 1995; Phillips, 1992; Hiraga et al., 2001; Blokhina et al., 2003]. Большинство патогенных микроорганизмов не способно расщеплять лигнинсодержащие структуры растительных клеток. Поэтому лигнифицированные оболочки клеток служат эффективным барьером на пути распространения инфекции. Показано, что при заражении устойчивых растений лигнин откладывается в тех местах клеточных стенок, в которых он ранее оісуїсівовал. Лигнифицированные клетки образуют вокруг внедряющегося микроорганизма своеобразный физический и химический барьер, который препятствует его продвижению и развитию, а также ограничивает диффузию, выделяемых им токсинов [Vance et al., 1980; Barber, Ride, 1982; Pearse, Ride, 1982; Lesney, 1989].
Нужно отметить, что в организме растений лигнины, кроме участия в защитных реакциях, выполняют и другие функции. В частности, лигнин придает жесткость клеточным стенкам, и действует как межклеточное связующее вещество, придавая растительным тканям устойчивость к ударам, сжатию, изгибам. Содержание лигнина снижает проницаемость клеточных стенок в проводящих тканях и тем самым играет важную роль в процессах транспорта воды, питательных веществ и продуктов метаболизма. Хорошо известна роль лигнина в лимитировании роста клеток за счет образования ковалентных связей с полисахаридами и белками в составе клеточных стенок [Marigo, Boudet, 1980]. Предполагается также, что лигнификация в растительных клетках служит эффективным способом нейтрализации токсичных для организма промежуточных продуктов метаболизма фенольной природы [Маргна, 1986].
Выделение оксалатоксидазы различной локализации в клетке и определение ее активности
Хитин - нерастворимый в воде линейный полимер, состоящий из а-1,4-связанных 2-ацетамидо-2-деокси-0-глюкопиранозильных остатков [Muzzarelli, 1977]. Хитозан - дезацетилированная производная молекулы хитина. Хитин и его производные входят в состав клеток и неклеточного вещества многих организмов. Особенно большим содержанием хитина характеризуются членистоногие, у которых он составляет основную часть экзоскелета. Хитин также присутствует у некоторых представителей зеленых и бурых водорослей [Тгасеу, 1955]. Практически все грибы содержат хитин [Феофилова, 1983; Peberdy, 1989; Ни, Rijkenberg, 1998; Guedarri et al., 2002]. Считается, что в растительных тканях этот полимер отсутствует [Hirano et al., 1989; Peberdy, 1989], однако, гистохимическими методами было показано присутствие молекул Ы-ацетил-О-глюкозамина (GlcNAc) в составе вторичной стенки растительной клетки (арабингалактон) [Benhamou, Asselin, 1989; Wojtaszek, Bolwell, 1995].
Препараты хитина и низкомолекулярного хитозана подавляют рост грибов в культуре in vitro [Hadwiger, Beckman, 1980; Hirano, Nagao, 1989; Тютерев, 2002; Pieta et al., 2003]. Элиситорные свойства хитина проявляются в усилении синтеза фитоалексинов [Hadwiger, Beckman, 1980; Yamada et al., 1993; Переход и др., 1997; Muranaka et al., 1998; Shibuya, Minami, 2001; Cho et al., 2004], в повышении активности хитиназы [Roby, et al., 1987; Hirano, Yamamoto, 1990; Inui et al., 1997], Р-глюканазы [Chang et al., 1992; Kaku et al., 1998], ФАЛ [Inui et al., 1997; Vander et al., 1998], ингибиторов протеиназ [Doares et al., 1995; Walker-Simmons, Ryan, 1984; Мосолов и др., 2001], пероксидазы [Vander et al., 1998].
В сельскохозяйственной практике хитозан используется для повышения урожайности культурных растений, за счет повышения их устойчивости к болезням [Hirano et al., 1989; Hirano, Yamamoto, 1990; Петрухина и др., 1994; Тютерев, 1999, 2002]. Предполагается, что обработка растений хитозаном приводит к активации генома [Hadwider, Losckie, 1981; Hadwider, Adams, 1978; Hadwider, Beckman, 1980; Евдокимов, 2002]. С использованием ДНК-чипов у Arabidopsis thaliana выявлено до 60 генов, реагирующих на добавление хитина [Ramonell et al., 2002; Zhang, et al., 2002]. Среди них быстрой (10-30 мин) и высокой экспрессией характеризовались гены, ответственные за синтез регуляторных белков, участвующих в транскрипции и передаче информации [Ramonell et al., 2002; Zhang, et al., 2002].
Некоторые производные хитина и хитозана, в частности, водорастворимые низкомолекулярные фрагменты полимерных цепей - ХОС, обладают рострегулирующей активностью [Hirano, Yamamoto, 1990; Петрухина и др., 1994; Тютерев, 2002]. Вполне вероятно, что ХОС изменяют юрмональный баланс растения [Хайруллин и др., 2000]. Под влиянием низкомолекулярных производных хитина происходит усиление ризогенеза у черенков сливы [Кашин и др., 2001].
В растительных тканях ХОС могут образовываться в результате гидролиза растительными хитиназами полимеров клеточных стенок грибов в ходе патогенеза [Озерецковская, Васюкова, 2002]. Появление ХОС в клетке, в свою очередь, вызывает дальнейшее увеличение активности функционирующих хитиназ, а также появление новых, не синтезирующихся ранее, изокомпонентов этих ферментов [Inui at al., 1991]. Кроме активации хитиназ с последующим накоплением лигнина в тканях, молекулы ХОС, вызывают активацию и других защитных белков [Inui et al., 1991; Yamada et al., 1993; Walker-Simmons, Ryan, 1984; Тарчевский, 2002]. Было установлено на растениях арабидопсиса, что действие ХОС повышает экспрессию генов, кодирующих PR-белки, с одновременной репрессией ауксин-индуцируемых промоторных участков ДНК [Ramonell et al., 2002]. Как элиситоры защитных реакций растений, ХОС участвуют в продукции АФК, в том числе перекиси водорода [Kawano, 2002]. Предполагается, что образующаяся Н202 запускает защитные реакции еще до контакта элиситора с рецептором (Лапикова и др., 2000). Кроме того, под влиянием ХОС повышается интенсивность процессов перекисного окисления липидов [Geiger et al., 1997], связанное с индукцией генерации Н202 [Felix et al., 1993; Mathieu et al., 1996]. Вовлечение ХОС в регуляцию уровня Н202 в растительных клетках может происходить и за счет повышения концентрации салициловой кислоты [Sathiyambama et al., 1998].
Важное значение в специфичности проявления биологической активности производных хитина имеет степень ацетилирования и степень полимеризации биополимера [Lyon et al., 1995]. Ацетилированные ХОС индуцируют защитные реакции в клетках пшеницы и риса [Kaku et al., 1998; Vander et al., 1998; Tsukada et al., 2002], и практически не влияют на клетки двудольных растений [Barber, Ride 1988; Conrath et al., 1989; Yamada et al 1993; Kawano et al., 2000; Ben-Shalom et al., 2003].
У патогенов обнаружены ферменты, изменяющие степень ацетилирования ХОС [Deising, Siegrist, 1995; Tsigos, et al., 2000]. Ha каллусных и суспензионных культурах фасоли продемонстрировано, что активация и изменение количества изоферментов хитиназы находится в строгой зависимости от степени ацетилирования и полимеризации ХОС [Koga et al., 1992; Horoshi et al., 1996].
Обработка растений хитином и хитозаном, а также ХОС с различной степенью полимеризации и ацетилирования индуцирует ответ, связанный с активацией ферментов фенольного обмена, в частности, ФАЛ и пероксидазы [Lyon et al., 1995; Kauss, Jeblik, 1996]. Необходимо отметить участие ХОС в кальциевой сигнальной системе [Felix et al., 1993; Leung, Giraudat, 1998; Reynolds, 2000]. Патогены и хитиновые элиситоры приводят к активному выделению Cat2 из клеточных стенок растений [Young, Kauss, 1983; Saito et al., 2000; Klusener et al., 2002], что индуцирует синтез кальций связывающих белков [Takezava et al., 2000]. Са влияет на активность 1-3-(3-глюкансинтазы, принимающей участие в синтезе каллозы в местах проникновения патогена [Kauss et al., 1989; Skalamera, Heath, 1996; Tokuyasu, et al., 1999]. Индуцируемый элиситорами, в том числе и ХОС, выход Са 2 можно подавить его хелаторами, а также ингибиторами кальциевых каналов [Kauss, 1985; Bindschedler et al., 2001]. Таким образом, ХОС могут влиять на активность генома растения через изменение концентрации Са+2 в клетках [Leung, Giraudat, 1998; Reynolds, 2000].
Участие внеклеточных окислительных ферментов в генерации сигнальных молекул
Одним из приоритетных направлений современной биологии является расшифровка путей включения защитных реакций в растениях при инфицировании патогенами. Познание природы и механизмов формирования защитных реакций позволит использовать различные молекулы для управления устойчивостью растений.
Исследования последних лет показали, что наиболее ранней ответной реакций растительного организма на внедрение патогена является локальная генерация активных форм кислорода (АФК) - окислительный взрыв, запускающий каскад последующих защитных реакций [Аверьянов, 1991; Sharma et al., 1998; Mizuno et al., 1998; Ramputh et al., 2002]. При этом в растительных тканях повышается концентрация свободных радикалов (супероксидного Ог , гидроксильного ОН ) и перекиси водорода (Н2О2). Известно, что перекись водорода участвует в запуске СВЧ-реакции, процессов лигнификации, может также проявлять прямую антимикробную активность [Bolwell et al., 2002]. В отличие от свободных радикалов, перекись водорода является относительно стабильной молекулой и способна транспортироваться по растению.
Несмотря на наличие многочисленных экспериментальных данных об участии АФК в формировании защитных реакций растений, источники и способы генерации этих соединений при патогенезе остаются малоизученными. Одним из подходов к раскрытию механизмов развития защитного ответа растений на инфицирование фитопатогенами является идентефикация источников Н202, выяснение путей и способов регуляции активности ферментов, участвующих в ее образовании и утилизации.
По современным представлениям, устойчивость растений к различным инфекциям определяется комплексом физиолого-биохимических реакций, каждая из которых способствует защите от патогена. В растительных тканях выявлен целый ряд сигнальных соединений (элиситоров), запускающих цикл ответных биохимических реакций в организме растений при контакте его с патогеном. Такую роль, наряду с перекисью водорода, могут выполнять фитогормоны, олигосахариды, жасмонат, салицилат и некоторые другие молекулы. Предполагается, что сигнальные молекулы не только запускают первичные ответные реакции, но и определяют характер последующих биохимических и физиологических процессов, обуславливающих степень адаптации и устойчивости растений к действию патогенов.
Одним из альтернативных путей образования перекиси водорода в растениях является окисление щавелевой кислоты растительным ферментом оксалатоксидазой [Dumas et al., 1995; Азаришвили и др., 1996; Frahry et al., 1998; Mizuno et al., 1998; Zhou et al., 2000]. Изучение роли оксалатоксидазы при патогенезе представляется очень важным, так как щавелевая кислота является одним из факторов патогенности грибов [Berna, Bernier, 1999]. Однако существующие методы позволяют выявить локализацию и провести качественную реакцию ферментативной активности в фиксированных тканях. Нами был разработан количественный метод хемилюминесцентного определения активности оксалатоксидазы по продукции перекиси водорода и по окислению ортофенилендиамина. Оба эти метода позволяют определять активность внеклеточных форм фермента, выделяемого нативными растениями.
У злаков оксалатоксидаза локализуется на поверхности корней [Dumas et al., 1995], и добавление в среду инкубации проростков щавелевой кислоты должно приводить к образованию перекиси водорода:
Перекись водорода, в свою очередь, с помощью внеклеточной формы пероксидазы может включаться в окисление фенольных соединений с образованием детектируемого хроморфорного продукта [Минибаева, 2005].
Перед опытами у проростков осторожно удаляли эндосперм, промывали корни в дистиллированной воде, переносили по 10 штук в чашки Петри с 10мл раствора 0,0ЇМ КС1 и выдерживали не менее 4 ч для снятия раневого стресса. Затем среду отсасывали пипеткой и добавляли свежую, коюрая содержала 0,05% ОФД в 0,0ЇМ КС1. Реакцию инициировали добавлением 1мл раствора 0,025М щавелевой кислоты. Среду инкубации проростков постоянно перемешивали осторожными круговыми движениями и с 2-минутным интервалом отбирали по 0,2 мл раствора в лунки плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, содержащие 0,05 мл раствора 4N H2SO4. Активность окисления фенолов (ОФД) выражали в условных единицах оптической плотности (А492) на 1 г сырой массы корня.
Результаты наших исследований показали, что введение в среду инкубации 4-cyi очных проростков пшеницы щавелевой кислоты и водорастворимого фенольного субстрата ортофенилендиамина (ОФД) приводит через 1-2 мин к желто-оранжевому окрашиванию среды. С течением времени окрашивалась и поверхность корней. Предложенный метод позволил количественно оценить активность фермента по интенсивности окраски через определенный промежуток времени (табл. 3.1.1). Специфичность реакции подтверждалась тем, что в присутствии янтарной или аспарагиновой кислот окраска не развивалась.
Как известно, по мере роста корня происходит лигнификация клеточных стенок в тканях эпидермиса, приводящая к снижению проницаемости для различных веществ [Родченко и др., 1988]. С другой стороны, активность оксалатоксидазы и пероксидазы в онтогенезе растений может меняться [Андреева, 1988; Dumas et al., 1995]. В связи с этим мы оценивали активность окисления ОФД корнями проростков пшеницы различного возраста. Как видно на рис. 3.1.1, наиболее интенсивно окисление ОФД осуществлялось корнями молодых, 2-суточных проростков.
Активность протеиназ и их ингибиторов в тканях устойчивых и восприимчивых сортов пшеницы при грибном патогенезе
Учитывая тот факт, что производные хитина обладают рострегулирующей активностью [Hirano et al, 1990; Тютерев, 2002], существует вероятность вовлечения препарата ХОС в регуляцию защитного ответа растений при патогенезе путем коррекции баланса фитогормонов. Оказалось, что предобработка ХОС семян восприимчивых растений приводит к повышению уровня цитокининов как в здоровых растениях, так и при инфицировании В. sorokiniana (рис. 3.1.25). Повышение концентрации цитокининов в каллусах пшеницы при внесении хитоолигосахаридов в концентрации 1 мг/л в среду культивирования наблюдали и ранее [Хайруллин, 2001]. Показано, что ХОС и ауксины являются антагонистами в регуляции метаболизма растений [Ramonel et al, 2002]. Вероятно, это обусловлено их способностью индуцировать экспрессию генов защитного ответа, в том числе анионных пероксидаз, в отличие от ауксинов подавляющих защитные реакции растений [Tanaka et al, 2003].
Совокупность полученных нами данных позволяет предположить возможные пути регуляции хитоолигосахаридами защитных реакций в растениях пшеницы при грибном патогенезе. Один из них связан с возможносіью ХОС коррекіироваїь баланс фигоюрмонов, не допуская снижения уровня цитокининов, провоцируемого В. sorokiniana. С другой стороны, ХОС индуцируют активность оксалатоксидазы и синтез анионных изоформ пероксидазы. В устойчивых растениях сорта Заря высокий уровень цитокининов в растительных тканях обеспечивает запуск стандартных путей формирования защитного ответа, включая экспрессию защитных генов, и конститутивный синтез участвующей в лигнинификации анионной изопероксидазы. Предобработка ХОС восприимчивых растений пшеницы, оказывая стабилизирующее действие на баланс ИУК/АБК в условиях заражения, повышает в тканях содержание цитокининов и индуцирует экспрессию гена анионной пероксидазы, что в последствии предопределяет их устойчивость к воздействию возбудителя корневых гнилей В. sorokiniana.
Участие лигнина в защитных реакциях растений при инфицировании патогенными микроорганизмами и механическом повреждении привлекает пристальное внимание исследователей [Yamomoto, 1990; Nicholson, Hammerschmidt, 1992; Phillips, 1992; Дьяков, 1994; Метлицкий и др., 1995; Полякова и др., 1995; Verma, Hong, 2001; Hawkins, Boudet, 2003]. Лигнификация растительных тканей создает не только механический барьер, препятствующий распространению патогена, но и защищает растительные ткани от действия его гидролитических ферментов и токсинов [Ride, 1980; Walton, 1996]. Лигниновый барьер препятствует также транспорту питательных веществ к инфекционным структурам [Vance et al., 1980; Barber, Ride, 1982; Leshey, 1989; Tenhaken et al., 1995]. Несмотря на то, что в литературе имеется много фактического материала об участии лигнина в защитных реакциях растений, механизмы его накопления при патогенезе остаются пока неясными.
Как известно, сгратегия защитного ответа растительного организма во многом определяется типом пищевой специализации грибов [Морозов, 1992; 1999]. Длительный процесс коэволюции растений и микроорганизмов привел к появлению различных форм паразитизма патогенов: от эволюционно раннего, факультативного паразитизма (некротрофность) до высокоспециализированного - облигатного (биотрофность). В связи с этим, весьма важным представляется исследование процессов постинфекционного накопления лигнина при заражении грибными патогенами, различающимися типом взаимодействия с растением-хозяином.
Биотрофный тип паразитизма. При взаимодействии растений и биотрофных микроорганизмов, гибель инфицированного организма происходит медленно и патоген успевает сформировать свои репродуктивные структуры. Нередко, на ранних этапах патогенеза имеет место гормональная стимуляция метаболизма растения-хозяина для более полного жизнеобеспечения патогенного микроорганизма [Андреев и др., 1989]. Многие авторы указывают на значительные изменения в балансе фитогормонов в растительных тканях при заражении их биотрофными паразитами [Johnston, ТгІопе, 1974; Умнов и др., 1984; Trione, Sayavedra-Soto, 1988; Андреев, Плотникова, 1989; Музыкантов и др., 1991; Талиева, Филимонова, 1991; Андреев, Талиева, 1995; Максимов и др., 2004].
Твердая головня пшеницы относится к типичным биотрофам и является одним из наиболее вредоносных заболеваний зерновых культур. В научной литературе накоплен значительный фактический материал по этиологии, распространенности, вредоносности этого патогена [Каратыгин, 1981; Исаев, 1988;. Parbery, 1996]. Однако физиолого-биохимические закономерности заражения и инфекционного процесса остаются пока малоизученными. В основе этих закономерностей лежат сложившиеся в процессе эволюции взаимодействия возбудителя болезни и растения -хозяина [Раулех, 1991; Музыкантов и др., 1991]. Конечный исход такого взаимодействия зависит от агрессивных свойств патогена и защитных свойств растительного организма.
Возбудитель твердой головни Tillecia caries Tul. проникает в проросток через колеоптиле побега [Трунов, 1962]. Как известно, устойчивость растений к инфекционным заболеваниям обеспечивается комплексом механических и биохимических барьеров, препятствующих проникновению и дальнейшему развитию инфекции [Ильинская и др., 1991; Urano et al., 2000]. Наши исследования показывают, что при заражении растений пшеницы возбудителем твердой головни, значительная роль принадлежит процессам лигрификации и накопления лигнина в растительных тканях. Как видно, в зараженных проростках восприимчивого сорта содержание лигнина не повышается и определяется на уровне контроля. Тогда как в проростках устойчивой пшеницы в ответ на инфицирование происходит интенсификация лигнинобразовательных процессов (табл. 3.2.1).
Так, в 7-ми суточных проростках Т. timopheevii содержание лигнина повышается в 1,5 раза по сравнению с незараженными растениями. При этом высокий постинфекционный уровень накопления лигнина в растениях устойчивого вида обусловлен активацией ферментативных систем, как ФАЛ, так и ТАЛ. Как уже отмечалось, повышение активностей этих ферментов обычно коррелирует с быстрой и эффективной лигнификацией [Felton et al., 1999].
