Введение к работе
Актуальность теш. 3 настоящее вромя все большее признание полу^вт"і!доя"р<згу7Лііпи"иста"боЛ;пт"пуїс:> "об>з--зования динамических мультиерм<знтних авсе.^бдой-сг.^оггир,-їов, составляющих надмолекулярный уровень оргая?загда? ферментов (Фридрих, 1986; Кургане?, 1236; I98S; ГШ;Кзп-рвльянц, I9U8; Каган, I3S9; Карасе в, Стефанов, IS9I; Наградою, Цурокоц, 1991; Ермаков, 1903). В связи с этал основной тенденцией развития соврет-хниол экзамолегдо яглл-втея переход от исследования изолированных формантов к изучении их надмолекулярной срт,^гс",5 z сгсссбзіі функционирования в состава клеток.
Рибулозобисфосфаткарбоксилаза-оксагеназа (КЗ 4.І.І. 39) - ключевой фермэпт восстановительного пентоэофосфат-ного цикла автотрофной ассимиляции углокиелсты, отг.рнтого Кальвином о сотрудниками в начале 50-х годов нынеанэго столетия. Роль карбоксилазной функция фермента в биосфере исключительно, иоскольку она является основним источником органического вещества на Зсьпэ з согрей? "і-tv !-:-o.ior;::;rj кую эпоху. Поэтому РШКО с момента оїкриг:л и -- ^-r-.z-r-.
qoro времени остается наиболее ?ли"П!сл?л:о у.гуч-- , -
ионтом. Польшиє усілзхп досалгаут:: в леелсдогг.;:"-.: ,:--
І^ОИ ІСаТПЛіїТі'ЧОСїСОГО alvTG ~п 0Ді:і1>дііД:з, '.Ч.'О' '.'.'і,". ;';
ДЯЦйіІ фврмеНТа in vivo il in 7ІТГ0 , tf.QZiin^Z'V ',;' f,'. : '"
сборки молекулы олнгомера и гекетлкп і-іУКО (^г,';1".: :м .'"''"-.. Однако, исследование надмолекулярних- v; .;;; ';,-,; -зацаа ферментов цикла Кальшна началось только в последнее дасятаяетэв. Одной нэ форм !?яд?.'о,тс:7"ір"" opr-v-?-ции ферментов являются ыульт1!ср;/о:г.дше ::о..'ллг-к.'".', Лос-г-полокение о существовании в строме хлоропластоз тройного комплекса,, состоящего из рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1. 6.), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19).и рлбулозобисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы высказывалось ранее рядом авторов (Pcierkofsky , Racker ., 1961; LlacEli-oy st al. , ISols; duller ,' 1972;Р6маяова,1973). Подобии:: комплекс бил впдолон ИЗ ЛИСТЬеВ Гороха (Sainis , Harris ,1236) л шпината ( Sainis et ai ..,1989). Затем из листьев шпината был
выделен пятафершнтнцй комплекс ферментов цикла Кальвина
( Gontero et а},1988).
Из листьев хлопчатника и арабидопсиса также был выделан дультифершнтный комплекс (Бабадканова,НасыровД992)., состоящий из рнбозофосфатизомеразы (РФИ), фосфорибулокина-8Ы (СРК) и рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксагеназы (РЕФКО). Молекулярная шсса комплекса составила 520+30 кДа,.а на 812 кДа, как ожидалось при сложении молекулярных маос РФй (5? кДа), ФРК (240кДа) и РЕФКО (52СкДа). Таким образом, совокупность данных, полученных разными авторами, указывает на необходимость глубокого изучения структурной организации и функциональных-свойств этого мультиферментного комплекса.' Отсутствие комплексных исследований структурной организации и функциональных свойств мультиферментного комплекса ферментов цикла Кальвина делают эту работу актуальной,
Цель и задачи исследования. Основной целью нашей работы явилось исследование особенностей формирования надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений и выявление функционального и регуляторного значения такой организации.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
- выделить электрофоретичееки гомогенные препараты фермен
тов ШЇ, ФРК и РЕФКО из листьев хлопчатника ;
- определить молекулярные массы нативных молекул ферментов
' РФИ, ФРК и РБФКО и их субъеданиц;
установить, обладают ли ферменты РФИ, ФРК п РБФКО другими ферментативными, активностям;
провести кинетические исследования различных ферментативных активностей, проявляемых ферментными препаратами РФ'Л, ФРК и РБФКО; '
на основании нолучошшх данных выязать особенности в формы надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвя-на в хлоропластах высших растений.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые установлено, что электрофоретичоокг. гомогенные форэднтныа препараты Р-.ЙІ и ФРК обладают трем*! фэрмнтатив-
ннми активностям!! - рябозофосфатпзомерззпой, Фосфорнбуло-кинаэной и рябулозобисфосфаткарбокснлазнсй. Ріа-лО :грояа/л-ет шесть ферментативных активностей — рибо?офосф9тт<ясмо--разную, фосфорибулокиказнум, рябулозойис.Тх?с:ііггкаг.с<с-.сл.г-?.?.-ную, глицеральдогадфосфатдегидрогеназнуд), фосолглицаратки-нязную и фруктозобисфосфзтязнув. У субьояигац 5РК с молекулярной массой 60 кДа и субъедяниц РБїічО с мрлекулярнс-й маосоії .52 кДа опродзлекы три фершнтатипнш активносте г рибозофосфатизомеразная, фосфорнбудок-.іназнач и р::булозс-бисфосфаткарбоксилазная.
Кикетячесіетс ;;сслсдовдцпя :^эдсЛ ФавтйК'хагаьнои «к-таштости, проявляемо!'. форминт,..;;^ препаратами ЬЫ, н&Рл л РБФКО в присутствии различішх субстратов, позволили обнаружить у РФИ, Ф?К и РБФКО функциональный свойства, характерные для мультиферменткых комплексов - "облегченный катализ" и координировашшє регуляторные эффекты.
Обнаружение у субъеданиц ФРК и РБФКО и у катившее форм ферментов РЩ, ФРК и РБФКО различных ферг/ентатввтгх активностей и результаты кинетических исследот-ак:-:'? n:-5sc— лили нам сформулировать новые представления оь o-.-.ix ^ер-ментах : субъединица Piwl является двух/лмзнк;,::.! л-~оетог.-.-.-ческим ферментом ; фермент Рч<И - щлылиохсиа-.'. ;:>'.мс?рг,::': долифункциональніді фермент ; ФРК и РК-ХО - дйнг-м-гіє^.-'." г мультиферментные комшшксн-асссцнаты, способен ^t. .--:,1-ваться в мембрану, образуя метаболой.
Физиологический смысл существовалич іїтр."-.гп ' і:;';.-'.-." Кальвина в трех формах - свободней, мулїЛ'*іфер..;«,іїН/»л. комплексов и метаболона, находящихся в динамическом тапшдо*-сии друг с другом, заключается в реализации рогул^'.с.|.-';.тч механизмов различных уровней. : механизмов гоцаасхаза :; механизмов слежения. Свободные растворимые ферменты участвуют в поддержании клеточного гомеост-аэа с помощью механизмов изостерической и аллостерьческой регуляции. З ідуль-тиферментных комплексах и метаболонах осуществляется регуляция каждой ферментативной активности в отдельности и всей метаболической системы как единого целого через механизмы слежения.. Благодаря механизмам слежения вренехе-
дат переключение метаболической системы иа новый режим функционирования в соответствии с требованиями внешней среды.
На основании всей совокупности полученных нами я имеющихся в литературе экспериментальных данных предложана схема формирования надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений.
Полученные.результаты дают основание предложить в качестве физиологического тэста прл отборе растений для гене тико-селокциошшх работ определение одной из ферментативной активностей ыулътиферментного комплекса, например, рибозофосфатизоморазной.
Апробация результатов' исследований. Материалы диссертационной работы доложены (или представлены) на Первой научной конференции Биохимического общества Республика Таджикистан (Душанбе, 1993), ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского госу-ниварсЕтета (Душанбе,1993,1994), совместных научных семинарах Общества физиологов растений и Биохимического общества Республика Таджикистан, лабораторий молекулярной внзи-мологии и молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии и биофизики растений АН Республики Тадая-кистан (Душанбе,1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5. работ .
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена
на ЮЗ страницах машинописного текста, содержит 26 ри-
оунков, Ф таблиц и состоит из введения, обзора литерату
ры, экспериментальной части, аклачавдаіі две главы, заклю
чения, выводов и списка цитированной литературы {-//.# ра
бот). . '
