Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1 Зернобобовые культуры в балансе пищевого и кормового белка 10
1.2 Белковый комплекс семян гороха 19
1.2.1. Фракционный и аминокислотный состав семян гороха 19
I -2.2. Антиалиментарные факторы зернобобовых культур 22
1-2.3, Ингибиторы протеолитических ферментов 23
1.2.4- Лектины и гемагглютинирующая активность растений 27
1.3 Углеводы зернобобовых культур и их роль в жизнедеятельности растений и значение для получения промышленной продукции 31
1.3.1-Роль сахарозы 32
1,3.2. Роль крахмала 33
1.4 Белково-углеводный комплекс семян в онтогенезе растений 37
1.4.1. Формирование белкового комплекса семян 37
1.4. Онтогенетические изменения синтеза углеводов 41
1.5 Селекция раннеспелых сортов гороха 43
Глава 2. Объект и методы исследования 48
2.1, Объект исследования 48
2.2. Методы исследования 51
2.2.1. Определение сырого протеина (общего азота) 51
2.2.2. Определение запасных белков 51
2.2.3 .Электрофорез белков 51
2.2.4. Определение нитратредуктазной активности 52
2.2.5. Опре деление суммарной активности протеолитических ферментов 52
2.2.6. Определение активности ингибиторов протеиназ 52
2.2.7. Определение гемагтлютинирующей активности 53
2.2.8. Определение моно- и дисахаридов 53
2.2,9- Выделение и определение крахмала и амилозы 54
2.2.10. Статистическая обработка данных 55
Глава 3, Экспериментальная часть 56
3.1. Изменчивость содержания сырого протеина и запасных белков в процессе созревания семян гороха 56
3.2, Полиморфизм белков семян гороха в процессе их созревания 60
3.3 Фракционный состав белков семян в онтогенезе 63
3.4. Активность нитратредуктазы в листьях и корнях гороха в онтогенезе 70
3.5. Взаимосвязь накопления белка в семенах гороха с активностью нитратредуктазы 74
3.6. Активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в семенах гороха 78
3.7.Гемагглютиниругощая активность гороха 81
3.8. Углеводный обмен различных по скороспелости сортов гороха 84
3.9. Синтез крахмала в семенах гороха 95
3.10. Соотношение запасных форм углеводов и белков в семенах гороха 99
Заключение 106
Выводы 112
Список литературы 116
Приложения 133
- Фракционный и аминокислотный состав семян гороха
- Углеводы зернобобовых культур и их роль в жизнедеятельности растений и значение для получения промышленной продукции
- Опре деление суммарной активности протеолитических ферментов
- Взаимосвязь накопления белка в семенах гороха с активностью нитратредуктазы
Введение к работе
Любой живой организм, включая человека, формируется за счет белков растительного и животного происхождения. Они входят в состав соединительных и костных тканей, выполняют динамическую, опорную функцию, обеспечивают взаимосвязь всех органов, их механическую целостность и защиту (Попов,. 1997). Недостаток белка в пище человека вызывает физиологические и функциональные расстройства организма - задержку в росте и развитии, быструю физиологическую и, особенно, умственную утомляемость.
Источником пищевого и кормового белка являются зернобобовые культуры. Они находят широкое применение в качестве продуктов питания, корма. для скота и сырья для промышленности. Актуальность проблемы обеспечения полноценным пищевым белком населения Российской Федерации подчеркнуто в «Концепции государственной политики в области здорового питания и безопасности питания населения России на период до 2005 года». Бобовые культуры особенно богаты углеводами, до 60%, в основном крахмалом, а также тиамином, никотиновой кислотой, Са и Fe. Углеводы бобовых хорошо всасываются и используются организмом. Они представляют собой источник энергии, эквивалентный (по калорийности на единицу сухой массы) углеводам зерновых культур.
Вместе с тем специалисты в области питания, пищевой промышленности и селекции растений должны быть готовы к тому, что новые продукты питания могут содержать те или иные токсичные компоненты (ингибиторы протеиназ, лектины, трисахариды и др.). Этот вопрос приобретет особую актуальность, когда человечество столкнется с проблемой ограничения выбора источников пищевого белка, большая часть которых будет растительного происхождения.
Основной зернобобовой культурой нашей страны является горох. В зерне гороха в зависимости от сорта и условий выращивания содержится 9-15% воды, 18-35% белка, 46-60% безазотистых экстрактивных веществ, в том числе 20-50% крахмала, 4-10% Сахаров, 0,6-1,5% жира, 2-10% клетчатки, 2-4% золы. Бо- ,
гаты витаминами незрелые семена (зеленый горошек), а также свежая зеленая масса гороха.
Одним из путей решения белковой проблемы является получение белковых изолятов из растительных компонентов. Белковые изоляты используются в качестве пищевых ингредиентов или же функциональных добавок в составе разнообразных пищевых продуктов, включая продукты детского, диетического и лечебного питания, а также в качестве сухих пищевых ингредиентов (забели-ватели для кофе, сухие смеси для приготовления напитков и т.п.) (Толстогузов, 1978, 1986, 1987; Steinke at а!, 1992).
Сырьем для получения продуктов питания, корма для скота и сырья для промышленности являются различные сорта зернобобовых культур и, в частности, гороха* Содержание и соотношение составляющих сырье компонентов зависит от генотипа, условий выращивания и способов переработки, что определяет качество получаемой продукции.
Решающее значение для формирования качества семян гороха как источника полноценного белка и крахмала, а также продуктов самого разнообразного назначения играет изучение протеин-углеводных взаимоотношений в процессе развития растений. С целью управления этими процессами требуются сравнительные исследования биохимических особенностей различных по, скороспелости сортов гороха пищевого и кормового назначения.
Проблема скороспелости связана, во-первых, с формированием качества и, во-вторых, с получением ранних урожаев. Однако проблеме скороспелости несправедливо уделяется мало внимания, что в какой-то степени нам удалось восполнить.
Северные районы, Сибирь и регионы с частыми летними засухами остро нуждаются в раннеспелых сортах. Трудность создания раннеспелых сортов за-ключается в требовании производства формировать за короткий срок урожай семян на уровне среднеспелых и не уступающих им по качеству.
7 Диссертация посвящена исследованию белково-углеводного комплекса
гороха группы сортов, различающихся длиной вегетационного периода в онтогенезе и формирующихся семенах.
Целыо настоящего исследования явилось исследование белково-углеводного комплекса гороха группы сортов, различающихся длиной вегетационного периода в онтогенезе и формирующихся семенах,
В задачи исследования входило:
Изучить изменчивость содержания сырого протеина и фракционного состава запасных белков в процессе созревания семян гороха.
Исследовать нитратредуктазную активность в листьях и корнях гороха в онтогенезе и установить ее связь с накоплением запасных белков в семенах.
Изучить активность ингибиторов протеиназ и лектинов в процессе развития семян гороха,
Исследовать углеводный обмен в различных органах гороха в онтогенезе.
5. Выявить динамику накопления крахмала и амилозы в семенах гороха.
6. Установить соотношение запасных форм углеводов и белков в семенах
различных по скороспелости сортов гороха.
Научная новизна.
Впервые изучена взаимосвязь белкового и углеводного обмена в семенах гороха различных по скороспелости сортов в онтогенезе. Работа вносит вклад в развитие представлений о зависимости формирования качества семян от длины вегетационного периода растений и условий выращивания.
Практическая ценность работы.
Выявленные закономерности формирования белково-углеводного комплекса в семенах различных по скороспелости сортов гороха могут быть поло-
8 жены в основу дифференциации сырья в зависимости от потребностей производства.
Апробация работы.
Результаты исследований по теме диссертационной работы докладывались и обсуждались на Ш-ей Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2003); V съезде ОФР «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); на XII Международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье» (Алушта, 2003); научной конференции, посвященной памяти А.А. Землянухина (Воронеж, 2003, 2004); 68-й Межвузовской научной конференции (Курск, 2003); на научной конференции «Вклад земляков-орловцев в развитие и становление российской науки» культуры и образования: «Хирургические науки в России: история, современность и перспективы, к 120-летию научной деятельности ПИ. Дьяконова» (Орел, 2003), научной конференции аспирантов и студентов «Биохимические основы современной агрономии», (Орел, 2004), научной конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (Орел, март 2004).
Публикации результатов исследований.
По материалам диссертации опубликовано: 8 статей, 3 тезиса, 1 статья находится в печати.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных глав, заключения, выводов, библиографического списка и приложения. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 9 рисунков. Список литературы состоит из 180 наименований работ, из которых 60 — зарубежные авторы.
9 На защиту выносятся следующие положения:
1. Качество запасных веществ семян гороха формируется в процессе их развития и зависит от генотипа, длины вегетационного периода и погодных условий года выращивания.
2- Содержание сырого протеина, фракционный состав и активность антиалиментарных компонентов (ингибиторов протеиназ и лектинов) зависят от степени зрелости и скороспелости генотипа гороха.
3. Различие в накоплении запасных форм углеводов в зрелых семенах го
роха заключается в скорости использования отдельных Сахаров в период созре
вания семян в зависимости от длины вегетационного периода.
4, Раннеспелые сорта гороха накапливают в семенах больше крахмала, а
позднеспелые — белка. Белок раннеспелых сортов гороха по фракционному со
ставу и низкому содержанию токсичных компонентов имеет большую биологи
ческую ценность, чем средне- и позднеспелые сорта.
Фракционный и аминокислотный состав семян гороха
В белковый комплекс семян гороха входят запасные, структурные и функциональные белки, включая ферменты, их ингибиторы, сложные протеиды и другие компоненты.
Питательную ценность белка предопределяет не столько его количественное содержание, сколько соотношение белковых фракций и аминокислот и степень этого соотношения со стандартом — белком куриного яйца или стандарта ФАО, или иному. В 1 г стандартного белка содержится 55 мг лизина, 40 мг треонина, 35 мг метионина+цистина, 70 мг изолейцина, 50 мг валина, 60 мг фени-лаланина+тирозина, 10 мг триптофана (Шевелуха и др., 1998).
Одной из причин, сдерживающих увеличение производства животноводческой продукции, является физиологическая неполноценность протеинового питания из-за недостатка отдельных аминокислот. Аминокислоты входят в состав белков органов и тканей, оказывают влияние на гормональную и ферментативную деятельность, содействуют нормализации водного режима, входят в состав антител и антитоксинов. Нарушение соотношения аминокислот - имбаланс, приводит к нарушению определённых физиологических функций и рост животных замедляется.
Первой лимитирующей аминокислотой в белках бобовых культур является метионин, т.е. она находится в наибольшем дефиците по сравнению со стандартным биологически полноценным белком. Недостаток метионина в организме животных приводит к серьёзным нарушениям в обмене веществ. Метионин играет важную роль в синтезе различных аминокислот, углеводно-жировом обмене, обезвреживает ядовитые продукты, активизирует рост волосяного покрова у животных (шерсти овец).
При недостатке другой лимитирующей аминокислоты - триптофана - наблюдается задержка в росте, огрубление волосяного покрова, истощение, сдерживается образование гемоглобина в крови, нарушаются процессы молокообра-зования, половая деятельность.
Лизин входит в состав белков сперматозоидов, активирует сперматогенез в животном организме и необходим для нормального функционирования нервной системы. Недостаток лизина приводит к задержке роста, анемии. От недостатка аминокислот особенно страдают животные с однокамерным желудком (свиньи и птица) и в меньшей степени — крупный рогатый скот и овцы (Имбе, Жукова, 1973).
Количественное содержание отдельных аминокислот зависит от фракционного состава белков. Белки семян гороха состоят из водо-солерастворимой (76 — 83%), щелочерастворимой (8 — 10%) и остаточных фракций. Наибольшее количество незаменимых аминокислот сосредоточено в водо-солерастворимой фракции, включающей альбумины и глобулины (Myrrau, 1979). Какой-либо закономерности в накоплении отдельных белковых фракций в зависимости от белковости семян не установлено, но выявлен ряд образцов, которые при пониженной белковости, содержат больше водорастворимой фракции — альбуминов (Володин, Масалова, 1981).
Исследование фракционного состава четырёх видов гороха показало различие в содержании белка и соотношении фракций: альбуминов, глобулинов и глютелинов. Содержание фракций белка у различных сортов и мутантов гороха колеблется по альбумину от 8 до 21,5%, по глобулину - от 5 8,6 до 76,6%, глю телину —от 10,0 до 19,8% (Володин и др., 1971). Так как наибольшее количество незаменимых аминокислот сосредоточено в водо-солерастворимой фракции, средняя биологическая ценность этой фракции составляет 90 - 92%. Исследования показали, что с увеличением удельного веса этой фракции в белковом комплексе увеличивается и ценность образца как источника белка высокого качества. Это свидетельствует о том, что реальна возможность селекции на отдельные сбалансированные по аминокислотному составу белки (Конарев, 1975; Smart et al., 1975).
Методом электрофореза в ПААГ установлено, что количество субъединиц в альбуминовой фракции белков гороха составляет до 20 - 30. Однако наиболее чётко выделяются около 10, которые именуются основными (Boulter, 1975). Количество различных полос сорто- и видоспецифично и максимально выявлено 19 - 21, 20 — 24 в зависимости от вида (Володин, Гуринович, 1975). Их появление связано с ферментативной активностью. В этом случае считается, что можно идентифицировать тысячи альбуминовых компонентов (Boulter, 1975). Они взаимосвязаны с белками, обладающими высоким содержанием незаменимых аминокислот: подобно стандарту Смита - уреазой у канавалии. Подобные белки составляют до 1% сухой массы семян (Boulter, 1975, 1977) или до 6% белка..
Сравнительное исследование белков семян у различных видов гороха, в основном, связано с глобулинами, как наиболее изученными, и в меньшей степени с альбуминами (Тарлаковская, 1987; Королева и др., 1991; Thomson et al., 1980; Hussein et al., 1998).
В состав глобулиновой фракции белков входит вицилин 1 IS и 7S. Глобулины наиболее полно изучены у гороха и кормовых бобов. Вицилин и легумин синтезируются в семенах в фазе налива и созревания и представляют собой типичные запасные белки тканей семядолей (Конарев и др., 1993). Анализ созревающих семян указывает на более интенсивный биосинтез у них легумина, хотя синтез вицилинов начинается значительно раньше (Boulter et aL, 1978). В зрелых семенах содержание легумина и вицилина находится в соотношении 4:1. Установлено, что биосинтез и количественное накопление этих белков находится под контролем различных генов. Поэтому возможно существование типов и индивидуумов с различным соотношением данных компонентов.
Углеводы зернобобовых культур и их роль в жизнедеятельности растений и значение для получения промышленной продукции
Углеводы являются самой распространённой группой органических соединений в природе- Они образуются в живых клетках в ходе разнообразных процессов синтеза и распада, У зелёных растений к числу важнейших путей обмена
углеводов и их ближайших производных относится фотосинтетическое усвоение углекислоты из воздуха - ведущий автотрофный процесс» лежащий в основе сельскохозяйственного производства и обеспечивающий всё существование жизни на Земле. Углеводы выполняют ряд важнейших функций — являются структурными компонентами, клеточных стенок (целлюлоза, гемицеллюлоза, пектиновые вещества), резервными компонентами в запасающих органах (семенах, клубнях, луковицах и т.д.) в виде крахмала, инулина, гликогена, субстратами дыхания и промежуточными производными - фосфорными эфирами Сахаров в процессах гликолиза и энергетическом обмене клеток, транспортной формой ассимилятов — продуктов фотосинтеза (сахароза), на 85 — 90% составляя флоэмный ток в растениях, в виде пентоз входят в состав важнейших ко-ферментов (НАД, НАДФ, коэнзима А и др.), высокоэнергетического соединения с макроэргическими связями АТФ, а также ДНК и РНК, Углеводы являются основными структурными компонентами лектинов, гликозидов, аминов и т.д. (Ленинджер, 1987; Даффус К., Даффус Дж., 1987).
Роль сахарозы У животных углеводы транспортируются по кровяному руслу в виде глюкозы. Однако у большинства растений главной транспортной формой углеводов служит сахароза. Вероятно, растения предпочитают использовать это соединение, поскольку оно не обладает восстановительной активностью, благодаря чему сахароза менее реактивноспособна и труднее метабилизируется, чем глюкоза. У животных глюкоза — это, прежде всего, легкодоступный источник энергии. для немедленного использования. Для растения такое свойство не особенно важно, и все преимущества такого рода перевешиваются защитным действием (1— 2)-гликозидной связи у сахарозы. Сахароза наиболее распространённый дисахарид растительных тканей и предшественник большинства углеводных запасных отложений в зрелых семенах- При прорастании сахароза высвобождается из этих веществ и обеспечивает энергией и субстратами процессы роста и дифференциации клеток в отсутствие фотосинтеза. По-видимому» сахароза является наиболее доступным источником энергии для поддержания жизни растения в темновые периоды (К- Даффус, Дж. Даффус, 1987).
Наиболее распространёнными субстратами дыхания растений являются углеводы, и поэтому скорость дыхания должна оказывать огромное влияние на углеводный обмен- Скорость дыхания зависит от множества факторов, среди которых важную роль играют факторы внешней среды, в частности температура, концентрация С02» водообмен, гормоны.
Углеводы накапливаются в хлоропластах листьев в виде крахмала. Основным субстратом для его синтеза считают сахарозу. Главными продуктами обмена сахарозы являются УДФ - и АДФ - глюкоза, фруктоза и некоторое количество глюкозы. Поскольку предпочтительным нуклеотидным донором для синтеза крахмала считают АДФ-глюкозу, следует ожидать, что все другие соединения должны превращаться в АДФ-Д-глюкозу.
На долю крахмала приходится около 1% сухой массы листьев. Крахмал листьев представляет собой временный запас углеводов, накапливающийся при фотосинтезе, ночью этот крахмал снова превращается в сахара, которые передвигаются в нефотосинтезирующие ткани.
Изучение распада крахмала в листьях показывает, что его основными про-дуктами являются 3-фосфоглицерат, мальтоза, а иногда глюкоза и небольшие количества глюкозо-6-фосфата и рибозо-5-фосфата. Вероятно, превращения крахмала в сахарофосфаты инициирует фосфорилаза, а а- и р-амилазы вызывают накопление мальтозы и глюкозы.
Синтезируемый крахмал разделяют на две группы: транзитный и резервный. Первый из них аккумулируется на короткий период в хлоропласте в течение дня, затем гидролизуется и транспортируется в другие части растений в виде Сахаров, где резервный крахмал накапливается в виде зёрен в амилопласте (пластиде) (Whistler et al, 1984; Erlander, 1998).
Биосинтез крахмала хорошо изучен у зерновых культур, где углерод фиксированный при фотосинтезе в стебле, верхних листьях и других органах, передвигается в формирующуюся зерновку, где большая его часть попадает в ами лопласты эндосперма и включается там в крахмал. Первичные крахмальные зёрна постепенно увеличиваются в размерах внутри двойной мембраны орга-неллы, и их диаметр у разных культур может достигать от 10 до 100 мкм. Запасной крахмал активно накапливается у бобовых, клубнеплодах и некоторых тропических растений (банан и манго). Напротив, в умеренном климате в плодах накапливается мало крахмала, исключение составляют яблоки.
Крахмальные зёрна чрезвычайно сильно различаются по размерам, форме и особенностям строения, и эти различия используют в таксономических целях. Так, в семенах гороха диаметр крахмальных зёрен не превышает 10 мкм, а в клубнях картофеля достигает 100 мкм. Зёрна нормального запасного крахмала и крахмала, локализованного в хлоропластах, состоят из смеси амилозы и амилопектина, причём обычно амилозы меньше, чем амилопектина (11-35%). Доля амилозы сильно варьирует от вида к виду и от сорта к сорту растений: например, в крахмале кукурузы содержание амилозы составляет 20-36%, в крахмале картофеля — 18-23%, крахмале риса - 8-37%, У гороха содержание амилозы в крахмале гладких семян составляет 15-30%, а в овощных 35-50% (Павловская и др,, 2001; 2003). Содержание амилозы в большинстве крахмалов запасного происхождения нарастает с увеличением возраста исследуемой ткани (в зерновках злаков, клубнях картофеля и корнях кассавы). Вероятно, синтез амилопектина преобладает на ранних этапах роста крахмальных зёрен.
Опре деление суммарной активности протеолитических ферментов
Навеску муки семян гороха 0,2 г заливали 5% NaCl, экстрагировали в течение ночи в холодильнике, после чего центрифугировали - при 5 тыс. оборотов/мин 15 минут. Альбумины отделяли от глобулинов диализом в холодильнике 48 часов. Из оставшегося плотного остатка муки после извлечения альбуминов и глобулинов осадок отмывали 1 М NaCl до исчезновения реакции на белок. Затем из осадка извлекали глютелины 0,05н NaOH. После извлечения белковых фракций определяли в них азот методом Кьельдаля. Концентрацию белка определяли также по Лоури на ФЭКе по калибровочной кривой (Ермаков, 1987).
Диск-электрофорез белков проводили в полиакриламидном геле по методу (Орнстейна и Девис в модификации), В.И. Сафонову и М.П. Сафоновой (1969) в камере фирмы «Reanal» в щелочном геле. Белковые компоненты характеризовали на основании их. относительной электрофоретической подвижности (ОЭП), сравнивая положение каждой зоны компонента с положением зоны индикаторной краски (бромфеноловый синий), мигрирующей впереди всех белковых компонентов. Относительную электрофоретическую подвижность компонентов определяли как отношение расстояния, пройденного данным компонентом, . к расстоянию, пройденному краской-индикатором и принимаемому за единицу.
Электрофорез белков и идентификацию сортов гороха проводили по белковым формулам на пластинах из полиакриламидного геля в ЭФ-камере фирмы «Хеликон» методом В.Г. Конарева и др. (2000). Регистрацию спектров белков гороха осуществляли с помощью скользящей шкалы, по которой компонент обозначают номером позиции, занимаемой им при совмещении спектра со шкалой. В качестве эталона использовали стабильный спектр семян культурной сои.
Метод основан на количественном определении нитритов, образовавшихся при восстановлении нитратов под действием нитратредуктазы (в присутствии восстановленного НАД Н) (Плешков, 1985). Количество образовавшихся нитритов определяют колориметрически с использованием сульфаниловой кислоты и а-нафтиламина. Определение количества нитритов проводят при длине волны 540 нм. Калибровочную кривую строят по раствору нитрита натрия.
Активность нитратредуктазы выражают в нмолях NaN02» образовавшегося под действием фермента за 1 час в расчете на 1г свежей растительной массы, взятой для анализа. (К.Ф.3.4) В основу положен метод Алена (Плешков, 1985). Ферментным препаратом, выделенным из растительного материала, действуют на раствор стандартного белка (казеина), неразложившийся белок осаждают, а в фильтрате определяют количество разложившегося белка по колориметрической реакции Фолина. Оптическую плотность определяют на спектрофотометре при 760 нм. Рассчитывают протеолитическую активность ферментного препарата в условных единицах протеолитической активности на 1 мг белка за 1 час. Выделение ингибиторов протеиназ проводили по методике И.О. Мельниковой (1982) и И.И. Бенкен (1983). Ингибиторы экстрагировали из муки семян гороха (после обезжиривания ацетоном) 0,01 М аммоний-ацетатным буфером рН=4,5, встряхивая в течение 30 минут. Суспензию центрифугировали 20 минут. В надосадочной жидкости определяли активность ингибиторов казеиноли-тическим методом на спектрофотометре СФ-4 при Х= 280 нм. Ингибирующую активность вычисляли по формуле и выражали в мг заторможенных трипсино-вых (химотрипсиновых) единицах на 1 г муки.
Определение гемагглютинирующей активности Выделение лектинов из семян гороха проводили по Г.Я, Алексидзе и др. (1983). Семена гороха размалывали до мелкодисперсной муки, экстрагировали 1%-раствором NaCl и центрифугировали дважды при 1500 g 20 минут. Белок высаливали 60% (NH SO Гемагглютинирующую активность определяли титрованием на планшетах с U-образными лунками. Эритроциты получали путем 5-кратной промывки крови 0,2 М раствором NaCl и последующим центрифугированием в течение 45 минут при 3000 g. После внесения лектинов и эритроцитов крови в планшеты, инкубировали реакционную смесь 45-60 минут при 37 С. За величину лектиновой активности принимали минимальную концентрацию белка, при которой отмечали реакцию гемагглютинации. Лектиновую активность выражали в международных единицах ГАЕ мг/г белка.
Определение моно- и дисахаридов Общее количество моно- и дисахаридов определяли по Елисееву (Ермаков, 1987) с использованием глицерата меди. По калибровочной кривой, построенной по растворам глюкозы, узнают содержание сахара в пробе и рассчитывают по формуле: X=aV100/(H. 1000), где а — содержание Сахаров в пробе (1см3), найденное по калибровочной кривой, мг; V- объем вытяжки, полученной из навески, см3; н - масса навески, г; 100 и 1000 —коэффициенты перевода в миллиграммы и проценты (1-ое определение). . Для определения сахарозы проводят предварительный гидролиз 5% раствором соляной кислоты, а затем ход анализа повторяют, как в первом случае (2-ое определение). По разности между 2-ым и 1-ым определением судят о содержании сахарозы. Качественное и количественное содержание Сахаров в процессе созревания семян гороха определяли методом хроматографии на бумаге, описанному Г.И. Завадской и др. (1962) в 4-6-кратной повторносте. После извлечения углеводов горячим спиртом их анализ проводили нисходящей хроматографией на бумаге марки «Быстрая» в растворе: бутиловый спирт: уксусная кислота: вода (4:1:5). Определенный объем центрифугата наносили микропипеткой и разгоняли 3 раза по 24 часа с последовательным просушиванием. Глюкозу и мальтозу обнаруживали гидрофталатом анилина, а сахарозу, фруктозу, рафинозу выявляли смесью 1:1 спиртового 1%-го раствора резорцина и 0,2н соляной кислоты. Элюцию Сахаров из бумаги проводили абсолютно сухим спиртом и концентрированной соляной кислотой на основании положения сахаров-«свидетелей» и колориметрирования на КФК-2 с синим светофильтром. Для вычисления содержания Сахаров пользуются калибровочной кривой, составленной на каждый сахар отдельно.
Взаимосвязь накопления белка в семенах гороха с активностью нитратредуктазы
В наших исследованиях 2001 год изучалась HP активность в листьях и накопление белка в семенах. Сравнение активности HP в надземных органах с содержанием сырого протеина в семенах различных генотипов гороха показало, что на первых этапах развития семян четкой связи между этими двумя параметрами нет (рис. 3) (Приложение 4).
Нитратредуктазная активность в листьях растений гороха в фазу молочной спелости семян очень низкая, и колебалется- в пределах 1,52...5,22 нмольМОг" /г. У раннеспелых сортов, у которых содержание белка в эту фазу составляло 24,24...25,64%, активность HP колебалась в пределах 1,52...2,61 нмольМОг /г. У среднеспелых сортов гороха при содержании белка 22,26...26,86%, активность составляла 1,52...5,22 нмольК02"/г, а у позднеспелых сортов при содержании белка 24,15...28,79% HP активность составила 1,74...3,04 нмольТМ027г. В фазу восковой спелости семян HP активность в листьях еще больше снизилась и не коррелировала с накоплением запасного белка (рис. 4) (Приложение 5).
Так, HP активность в листьях в данной фазе развития семян гороха колеблется от 1,01 до 3,80 нмоль Ю27г. У раннеспелых сортов при накоплении белка от 22,14 до 24,24% HP активность равна 1,01...2,00 нмольК027г. У среднеспелых сортов при накоплении белка от 21,88 до 26,69% HP активность равна 1,16...3,80 нмольКОг"/г. У позднеспелых сортов накопление белка в семенах колеблется от 22,05 до 27,91% при HP активности в листьях 1,16...2,46 нмольИОг /г. Следует отметить, что HP активность в листьях гороха сорта Алла была в 2-3 раза выше, чем у других сортов и составила в фазу молочной и восковой спелости соответственно 5,22 и 3,80 нмольМСЬ" /г. Наименьшей HP активностью в листьях обладал раннеспелый сорт Шустрик. Однако никакой связи с накоплением белка в семенах не наблюдалось. В семенах гороха сорта Алла содержание белка составило 22.03..,22,26%. а у copra Шустрик 23,71..,24,24%.
Данные 2002 года (рис. 1) подтвердили большее накопление сырого протеина в семенах позднеспелых сортов гороха по сравнению с ранне- и среднеспелыми сортами. Если сравнивать конечный результат (среднее) накопления сырого протеина в семенах полной спелости с самой высокой нитратредуктаз-ной активностью в корнях гороха в фазу 5-го листа и активностью в период цветения (табл. 7), то прослеживается тенденция прямой зависимости между этими двумя признаками- В зрелых семенах раннеспелых сортов гороха среднее содержание сырого протеина составляет 22,65%; у среднеспелых - 22,55%; у позднеспелых сортов - 25,20%, а средняя HP активность соответственно: в фазу 5-го листа у раннеспелых сортов — 143,6 нмольМОг /г; у среднеспелых — 149,4 нмольг-Юг /г; а у позднеспелых - 152,7 нмольМ02 /г. В фазу цветения HP активность в корнях раннеспелых сортов равна 10,6 нмольЫОг /г; у среднеспелых - 10,4 нмольІЧОг"/г; у позднеспелых- 15,7 нмольКОг /г(табл. 9).
Достоверная положительная корреляционная связь (г=0,58) существует между содержанием сырого протеина и HP активностью в фазу 5-го листа у позднеспелых сортов гороха и слабая связь (г=0,33) у среднеспелых сортов в эту фазу и у раннеспелых (г=0,40) в фазу цветения (Приложение 6).
В мобилизации запасного белка в семенах бобовых растений ведущую роль играют протеиназы. Протеиназы обновляют внутриклеточные и тканевые белки, а, следовательно, клеточные и тканевые структуры. А.П. Левицким (1982) установлена связь процесса накопления белков и уровня протеолиза в зерновке злаковых культур. Появляющиеся сразу после оплодотворения специфические протеиназы, действующие на запасные белки в фазу формирования зерновки, обеспечивают внутриклеточное перераспределение этих белков для процесса роста. С прекращением пролиферации снижается активность протеи-наз почти до нуля и резко усиливается накопление запасных белков.
В наших экспериментах исследована активность протеиназ в процессе созревания семян гороха в крайних по скороспелости сортах (табл. 10). Установлено, что в процессе созревания семян гороха активность протеиназ падает. Наивысшие показатели: - в фазу молочной спелости. У раннеспелого сорта - 4,20 у.е., у среднеспелого — 2,70 у.е., у позднеспелого — 3,60 у.е. В восковой спелости активность протеиназ составляет соответственно по сортам: 0,35; 0,45; 3,15 условных единиц, в полную - 0,15; 0,30; 0,45 условных единиц соответственно. Таким образом, очевидно, что резкое снижение активности протеиназ у скороспелого сорта Шустрик связано с коротким периодом созревания семян. У позднеспелого сорта Тройка этот процесс растянут во времени, так как формирование запасных белков у него накапливается медленнее.
Отсюда, очевидно, что протеиназы не только играют роль в формировании запасных белков у гороха, но и служат показателем его зрелости. По мнению М. Анчева и У. Стоилова (1985), уровень протеиназной активности может быть одним из показателей интенсивности белкового обмена и перераспределения соединений азота между органами. Между тем, высокий уровень содержания белка в семенах зернобобовых культур может не соответствовать его биологической эффективности из-за наличия ингибиторов протеиназ - трипсина и химотрипсина.
Ингибиторы составляют особую группу соединений, объединяемых общей способностью образовывать с ферментами стехиометрические комплексы, что приводит к конкурентному ингибированию каталитической активности. Потеря каталитических свойств комплексом происходит в результате присоединения к активному центру фермента, субстратному или аллостерическому. Последнее ведет к изменению третичной структуры молекулы и активность фермента изменяется. Степень ингибирующего действия зависит от числа молекул-ингибиторов, поэтому в одной и той же массе белка-ингибитора может быть разное число ингибирующих белковых единиц, что зависит также от величины молекулярной массы белка. Эффективность биохимических исследований значительно возрастет, если установить зависимость между числом ингибирующих единиц и степенью ингибирующего действия (Володин, 1981). Среди белков-ингибиторов наиболее распространенными и в наибольшей степени изученными являются ингибиторы протеолитических ферментов. Они обнаружены у растений, принадлежащим к различным систематическим группам. Большое количество белковых ингибиторов протеиназ обнаружено в семенах и других запасающих органах растений, где их уровень может достигать 5-10% от общего содержания водорастворимых белков. При этом ингибиторы протеиназ составляют довольно разнообразную по своим свойствам группу растительных белков (Валуева, Мосолов, 1995).
По нашим данным, уровень активности белков-ингибиторов в семенах гороха зависит от фазы созревания (табл. 11). Активность ингибиторов трипсина (ТИА) и химотрипсина (ХИА) увеличивается от фазы молочной спелости до полной, что согласуется с данными, полученными на люцерне (Волынец и др., 1989). В фазу молочной спелости в семенах гороха раннеспелых сортов активность ингибиторов трипсина составляет в зависимости от сорта 0,00...0,59 мг/г, в среднеспелых-0,27...0,50 мг/г, в позднеспелых — 0,00...0,46 мг/г. По мере созревания активность возрастает. В семенах восковой спелости - у раннеспелых сортов — 0,52.. .0,71 мг/г, у среднеспелых - 0,52...0,89 мг/г, у позднеспелых - 0,78...1,30 мг/г. В семенах полной спелости — у раннеспелых сортов — 1,33...2,15 мг/г; у среднеспелых -1,17...1,49 мг/г; у позднеспелых - 1,33.. Л,99 мг/г.
