Введение к работе
Актуальность проблемы. Совершенствование традиционных пищевых технологий, а также получение новых продуктов и ингредиентов белковой и полисахаридной природы с модифицированными свойствами является актуальной задачей, которая может быть решена c использованием биокатализа.
В настоящее время отмечается тенденция к расширению сырьевой базы для получения ферментативно модифицированных ингредиентов и продуктов за счёт использования вторичных сырьевых ресурсов (ВСР). Учитывая особенности их субстратного состава, необходим новый подход к механизму использования специфичных ферментов для таких нетрадиционных, практически не используемых ранее ВСР, как солодовая дробина, пшеничные отруби, подсолнечный шрот, жом тыквы, альбедо цитрусовых плодов и т.д.
Объемы таких ВСР на пивоваренных, соковых, винодельческих, спиртовых заводах и мелькомбинатах исчисляются миллионами тонн/год по России. Учитывая особенности переработки сырья и химический состав ВСР, их по праву можно отнести к богатейшим источникам пищевого белка (до 47 %) и углеводных ингредиентов пищи (до 60 % к массе ВСР).
Вовлечение в технологический процесс вторичных сырьевых ресурсов ВСР, несомненно, повысит эффективность производств путем создания малоотходных и безотходных предприятий с высокой рентабельностью.
Первостепенное значение приобретает получение и использование белковых ингредиентов для обогащения пищевых продуктов, а также их применения в качестве водосвязывающих и структурообразующих агентов в мясных, молочных и других продуктах питания. Данной проблеме посвящены работы ученых: И.А. Рогова, Н.И. Дунченко, Е.И. Титова, Е.Е. Браудо, А.И. Жаринова, М.В. Гернет, С.Е. Траубенберг, В.В. Колпаковой, Л.А. Ивановой, Л.В. Антиповой, L. Underkoffler, L. Hernandes и др.
Не менее важное значение имеют пищевые ингредиенты полисахаридной природы: пектин и нерастворимые пищевые волокна (ПВ). Их полезные физиологические свойства многочисленны: главные из них – сорбция токсинов, выведение из организма человека и животных радиоактивных элементов и ионов тяжелых металлов. В России в настоящее время препараты пектина, нерастворимых ПВ, а также белка в очищенной форме не производят – отечественная пищевая промышленность использует зарубежные аналоги.
Усилиями российских ученых: А.А. Кочетковой, Л.В. Донченко, Н.П. Нечаева, Г.А. Ермолаевой, В.В. Нелиной, В.Н. Голубева, Н.П. Шелухиной, Н.Д. Лукина и других совершенствуется технология ингредиентов углеводной природы, в частности, за счет использования современных методов гидролиза, очистки и сушки.
Работы И.А. Рогова, Е.И. Титова, Н.И. Дунченко, Ю.А. Ивашкина, В.Г. Высоцкого, Э.С. Токаева, Н.К. Журавской, В.И. Ганиной, И.В. Квитко, К.К. Полянского, В.А. Лосевой, Т.В. Саниной, Л.А. Ивановой, D. Burkit, H. Trowell свидетельствуют о целесообразности использования растительных полисахаридов для получения продуктов общего и функционально-профилактического питания.
Проблема биокаталической переработки традиционных видов растительного сырья, таких как бобовые, зерновые, эфиромасличные культуры, чайное и плодоовощное сырье, морские водоросли, остается актуальной и в настоящее время. Для каждой конкретной технологии необходим научно обоснованный выбор ферментных препаратов, специфичных к субстратам сырья и наиболее полно отвечающий требованиям производства.
Одной из важных задач является исключение из технологического процесса вредных с экологической точки зрения химических реагентов, например, растворителей (эфир), осадителей (этиловый спирт), а также замена кислотного и щелочного гидролиза на ферментативный, имеющий неоспоримые преимущества: щадящие условия, которые позволяют сохранить природные свойства сырья, улучшить качество и увеличить выход продукции.
Анализ литературных и патентных источников позволил оценить перспективы промышленного биокатализа как способа интенсификации технологических процессов получения пищевых продуктов и ингредиентов. Однако обобщающие работы в этой области представлены всего несколькими изданиями И.А. Рогова и Л.В. Антиповой, О.В. Кислухиной, М.В. Гернет, Л.А. Ивановой, Л.И. Войно.
В данной работе представлялось целесообразным обобщить накопленный опыт отечественных и зарубежных исследователей, а также собственный экспериментальный материал в области биокатализа применительно к растительным объектам, выявить особенности и закономерности этого биотехнологического направления, сформулировать концепцию направленного биокатализа и определить пути её реализации.
Работа выполнена в МГУ прикладной биотехнологии в рамках Федеральной научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», включая подпрограмму «Технология живых систем», а также на базе НПО «Биотехнология», Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, по хоздоговорам с фирмами и предприятиями.
Цель и задачи исследований. Целью исследования явилась разработка теоретических и практических основ направленного биокатализа в технологии пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы, получаемых в том числе из нетрадиционного сырья и ВСР.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
исследовать субстратный состав ранее не используемых в процессах биокатализа ВСР и нетрадиционных видов сырья;
изучить каталитические свойства исследуемых микробных ферментных препаратов (МФП) на стандартных и природных субстратах, систематизировать их по направленности действия;
разработать параметрическую модель направленного биокатализа;
научно обосновать методологию направленного биокатализа;
изучить эффективность действия МФП на растительное сырье и ВСР;
обосновать и разработать технологии пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы на основе направленного биокатализа, а также техническую документацию на их производство;
научно обосновать методы ферментативной модификации ФТС ингредиентов и возможность их использования в пищевых продуктах;
провести опытно-промышленную апробацию и внедрение основных результатов исследований.
Научная концепция. В основу теоретического обоснования технологий пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы, получаемых из вторичных сырьевых ресурсов, традиционных и нетрадиционных растительных источников, положена научная гипотеза направленного биокатализа, заключающаяся в целесообразности подбора МФП по абсолютной или групповой субстратной специфичности и механизму каталитического действия, а также создания энзимных композиций, проявляющих синергизм действия в условиях «ограниченного» биокатализа, с целью интенсификации технологических процессов и получения продуктов с заданными показателями выхода и качества.
Основные положения, выносимые на защиту:
Параметрическая модель направленного биокатализа.
Методология направленного биокатализа, включая подбор специфичных микробных ферментов (МФ) и режимов биокатализа для растительных сырьевых источников, в том числе нетрадиционных и ВСР, ранее не перерабатываемых для получения пищевых продуктов и ингредиентов.
Совокупность данных, обуславливающих совершенствование традиционных и создание новых технологий пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы с заданными показателями качества и выхода на основе направленного биосинтеза.
Введение понятия «ограниченного» биокатализа с целью сохранения природных качественных свойств и максимального выхода продукта.
Использование энзимных композиций, включающих как ферменты, непосредственно действующие на субстрат – предшественник готового продукта, так и комплекс ферментов, разрушающих структуру клеточной стенки растений: целлюлазы, ксиланазы, глюканазы.
Решение экологических проблем, в том числе замены кислотного и щелочного гидролиза на ферментативный в производстве ингредиентов белковой и углеводной природы.
Научная новизна работы:
Сформулирована концепция направленного биокатализа и разработана параметрическая модель процесса, позволяющие наиболее полно использовать каталитические возможности МФ при их воздействии на субстраты растительного сырья и ВСР. Обоснованы подходы, принципы и методы использования направленного биокатализа в технологии пищевых продуктов и ингредиентов.
Представлены данные скрининга МФП по каталитической активности на 10 различных субстратах. Изучены каталитические свойства более 20 МФ, относящихся к протеазам, пектиназам, в том числе пектинтрансэлиминазам (ПТЭ), целлюлазам, -глюкозидазам, -глюканазам, амилазам.
Для наиболее активных МФ дана количественная оценка сродства ферментов к субстратам: определены константа Михаэлиса, максимальная скорость гидролиза.
Установлена абсолютная специфичность ферментов:
- -глюкозидазы Aspergillus awamori, полученной в результате 45-кратной очистки в гомогенной форме, а также -глюкозидазы Clostridium thermocellum (генно-инженерный препарат), в отношении гликозидов эфиромасличного сырья;
- групповая специфичность протеаз Bacillus subtilis в отношении белков сои и гороха;
- -глюканазы Bacillus subtilis, целлюлазы Trichoderma reesei в отношении структурных полисахаридов сырья;
- ПТЭ Bacillus macerans в отношении этерифицированных пектинов;
- амилазы Bacillus licheniformis (генно-инженерный препарат) в отношении пшеничного крахмала.
Впервые установлен механизм действия арил--глюкозидазы Aspergillus awamori на гликозиды эфиромасличной розы, заключающийся в отщеплении глюкозы от ароматического агликона.
Обоснован выбор растительного сырья, в том числе ВСР для действия ферментных систем, обусловленный субстратным составом сырья и специфичностью ферментов в отношении конкретных субстратов традиционных и нетрадиционных видов сырья и ВСР – источников пищевых продуктов и ингредиентов.
Установлен синергизм в действии ферментов:
- арил--глюкозидазы Aspergillus awamori и целлюлолитического комплекса Trichoderma viride на гликозидносвязанные субстраты эфиромасличных растений – предшественники линалоола, цитронеллола, нерола, гераниола. Эффект синергитического действия проявляется в улучшении качества эфирных масел за счет увеличения содержания ценных компонентов в 1,5-2 раза (подтверждено хроматографически);
- протеазы и амилазы Bacillus subtilis на белки гороха в процессе его выделения, позволяющий повысить выход продукта более, чем в 4 раза.
Расширены представления об эффективности действия отдельных ферментов и их композиции. Установлена определяющая роль каждого из ферментов в процессах биокатализа (хроматографически):
- -глюкозидазы Aspergillus awamori в процессе выделения эфирного розового масла;
- ПТЭ из культур рода Bacillus, целлюлаз и -глюканаз из культур микроскопических грибов в процессе получения пектина;
- эндо-ПГ Aspergillus foetidus и целлюлазы Trichoderma viride в производстве черного, зеленого, кирпичного видов чая, концентратов чая;
- протеазы из культур Bacillus subtilis и амилазы Bacillus licheniformis (генно-инженерный препарат) в процессе получения ПВ из ВСР;
- протеазы Bacillus subtillis и глюканазы Penicillium emersonii в технологии пищевого белка;
- методом математического моделирования оптимизирован компонентный состав энзимной композиции, обеспечивающий максимальный выход соевого белка – 98,7 % от исходного содержания в сырье.
Новизна технологических решений подтверждена 12 авторскими свидетельствами и патентами РФ, а также 7 патентами в зарубежных странах.
Практическая значимость:
Экспериментально подтверждена возможность и целесообразность использования нетрадиционных видов сырья и ВСР при получении белка (солодовая дробина, пшеничные отруби), пектина (тыквенные и цитрусовые отжимы), нерастворимых ПВ (тыквенные и солодовые ВСР).
Установлена эффективность замены физико-химических способов, в том числе кислотного гидролиза, при получении пектинов, и щелочного – при получении белков на ферментативный.
Методология направленного биокатализа реализована в технологии эфирных масел, различных видов чая, а также соков, экстрактов, пектина и витамина Р при комплексной переработке цитрусовых ВСР, пищевых экстрактов из трав и ягод, агара морских водорослей.
Разработаны биокаталитические технологии белков из бобовых культур, пектина из яблочных, тыквенных, цитрусовых ВСР, а также нерастворимых ПВ из яблочных, свекловичных, тыквенных, пшеничных, солодовых ВСР.
Разработана ТД на производство ингредиентов белковой и углеводной природы:
- ТИ по производству яблочного пектина (концентрат) к ТУ № 15.8-30807701-003-2003 «Концентрат пектиновый яблочный»;
- ТИ по производству белковых изолятов к ТУ№ 914616-011-02068640-07 «Изолят белковый соевый» и ТУ № 914616-012-02068640-07 «Концентрат белковый гороховый»;
- ТИ по производству растительных пищевых волокон к ТУ 916962-814-02068640-08 «Волокна пищевые тыквенные», № 929522-515-02068640-08 «Волокна пищевые ячменные», № 916961-213-02068640-08 «Волокна пищевые яблочные».
Биокаталитические технологии апробированы и внедрены на предприятиях России и зарубежных стран:
- черного, зеленого и кирпичного видов чая на фабриках г. Озургети (Абхазия);
- эфирного масла с использованием биокатализа на комбинатах «Крымская роза» (Украина) и «Казанлыкская роза» (Болгария);
- пектина на заводе ОАО «Виннифрут» (г. Винница, Украина), в ООО «Зеленые линии» (Московская обл., Россия), в РУП «Пищевой комбинат Веселово» (Могилевская обл., Беларусь);
- сока-экстракта-пектина-витамина Р из цитрусового сырья на базе Батумского института аграрных биотехнологий и бизнеса;
- белковых препаратов из пшеничных ВСР – на заводе Объединения крахмальных предприятий Дольна Крупа (г. Трнава, Словакия);
- соевого и горохового белка, а также белка и ПВ при комплексной переработке солодовой дробины – в условиях ООО «Гелла-ТЭКО»;
- агара из морских водорослей и экстрактов из трав и ягод, апробирован на Заводе экстрактов агрофирмы «Накотне» (Латвия).
Показана целесообразность использования ферментативно модифицированного пектина и ПВ в составе желейных кондитерских и молочных продуктов. Разработана и утверждена ТД на продукты с использованием пищевых ингредиентов: ТУ № 922900-09804757-98 «Пудинг плодово-ягодный»; ТУ № 922238-09804737/95 «Йогурт»; ТУ № 101481-02 «Творожный десерт».
Экспериментальные препараты белков и ПВ испытаны с положительным результатом в технологии вареных колбас на базе ВНИИМП им. В.М. Горбатова и в промышленных условиях мясокомбината фирмы «Мясо» (г. Братислава, Словакия).
Дана положительная оценка использования растительных ПВ в составе пшеничного хлеба в опытно-промышленных условиях ГосНИИХП. Установлено улучшение качества хлеба при использовании тыквенных, пшеничных и солодовых ПВ. Показана возможность использования в составе вареных колбас ПВ (солодовых и тыквенных), обеспечивающих увеличение ВУС и улучшение органолептических показателей.
Результаты исследований использованы в учебном процессе при подготовке студентов по специальностям «Пищевая биотехнология» и «Биотехнология» (курс лекций, учебное пособие, 6 лабораторных практикумов).
Апробация работы. Результаты исследований представлялись на Международных и Всероссийских съездах и симпозиумах, в том числе на IV Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1979); Международном симпозиуме по ферментам (Канада, 1980); IV и VII съездах Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980; Алма-Ата, 1985); IV симпозиуме по эфиромасличным растениям и маслам (Симферополь, 1985); II Международном симпозиуме по сахарам и производным тростника (Куба, 1990); Международном конгрессе «Биотехнология. Состояние и перспективы развития» (Москва, ежегодно в 2002-2007 гг.); II съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004); Международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек» (Москва, ежегодно в 1995-2001 гг.) и других Международных и Всероссийских симпозиумах и конференциях (всего 78).
Работа удостоена двух серебряных и двух бронзовых медалей ВДНХ, Знака «Лауреат премии ВОИР» г. Москвы, Дипломов I, II и III степени Правительства Москвы в рамках Международной выставки «Мир биотехнологии» (2007).
Публикации: По результатам исследования опубликовано 126 печатных работ, включая 3 монографии, учебное пособие, 2 обзора, 12 авторских свидетельств и патентов РФ, 7 патентов в зарубежных странах, 102 публикации в научных журналах и материалах Международных и Всероссийских конгрессов, симпозиумов, конференций, из которых 15 опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация построена традиционно: включает введение, 7 экспериментальных глав, основные результаты и выводы, заключение, список используемой литературы и патентов. Работа изложена на 425 страницах, содержит 53 таблицы, 145 рисунков и приложения. Список литературных источников и патентов представлен 450 работами отечественных и зарубежных авторов.
Диссертационная работа является обобщением научных исследований, выполненных лично автором, а также в качестве ответственного исполнителя и руководителя НИР, научного руководителя выпускных квалификационных работ и четырех кандидатских диссертаций, защищенных в период 1998-2007 гг.
