Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
Эпидемиология, этиология и профилактика нозокомиального легионеллеза
Особенности экологии легионелл в потенциально опасных водных системах
Факторы патогенности и биологически активные молекулы легионелл
Заключение .
ГЛАВА 2 .Материалы и методы
Материалы
Штаммы легионелл использованные в работе .
Методы
Бактериологическое исследование воды и биопленок .
Идентификация легионелл
Определение легионелл методом ПЦР-РВ
Эпидемиологическое обследование ЛПУ
Типирование легионелл с помощью панели моноклональных анттел
Определение гена глюкозилтрансферазы у легионелл
Электронная микроскопия биопленок легионелл
Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Результаты исследований
Разработка порядка обследования системы горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений
Скрининг системы водоснабжения ряда общественных зданий, в том числе лечебно-профилактических учреждений на наличие легионелл
Анализ эффективности использования ПЦР-РВ для выявления легионелл, в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений
Анализ контаминации легионеллами систем горячего водоснобжения больничных комплексов .
Серологическая характеристика штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения, в том числе лечебно-профилактических учреждений
Идентификация гена глюкозилтрансфераз в различных штаммов легинелл .
Морфологическая характеристика формирования биопленок в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений, с помощью сканирующей электронной микроскопии
Анализ эффективности применения защитных антибактериальных фильтров для профилактики легионеллеза в отделениях групп риска лечебно-профилактических учреждений
Обсуждение .
Выводы
Список литературы
.
- Особенности экологии легионелл в потенциально опасных водных системах
- Бактериологическое исследование воды и биопленок
- Типирование легионелл с помощью панели моноклональных анттел
- Анализ эффективности использования ПЦР-РВ для выявления легионелл, в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений
Введение к работе
Актуальность проблемы. Легионеллезная инфекция («Болезнь легионеров», «Лихорадка Понтиак» и др.) известна уже более 30 лет, разработаны методы ее диагностики и лечения, однако, эта инфекция по-прежнему представляет существенную угрозу общественному здоровью, протекая в виде не только спорадических случаев, но и в виде крупных эпидемических вспышек с высоким процентом летальных исходов в различных странах мира, в том числе и в России. Легионеллез это сапронозное острое инфекционное заболевание, обусловленное различными видами , относящихся к роду . Главным местом обитания легионелл являются абиотические объекты окружающей среды. Резервуар возбудителя — это вода природных водоемов, в природе легионеллы обнаруживаются в пресных водоёмах как симбионты сине-зелёных водорослей или паразиты некоторых организмов. Оптимальная для размножения легионелл температура внешней среды — это 40-60 C. Наряду с естественной нишей, где обитают легионеллы, существует и искусственная — созданная человеком — ниша, а именно водные системы, где циркулирует вода оптимальной температуры. В таких системах создаются условия для образования в воздухе мелкодисперсного бактериального аэрозоля, что позволяет отнести легионеллез к техногенным инфекциям (Edelstein P.H.,1994; Stout J.E., 1997)
Вспышки легионеллеза были зарегистрированы во многих странах мира (США, Голландия, Хорватия, Дания, Испания и др), число заболевших варьировало от 8 случаев до нескольких сотен, были зарегистрированы летальные исходы. Заражения были связаны с использованием кондиционеров, вентиляторов, душевых установок и пр. Заболевания возникали у строителей, посетителей гольф-клуба, торгового центра, выставки цветов, бассейнов и других сооружений, там, где возникала возможность образования инфицированного легионеллами водного аэрозоля и попадания его в нижние отделы респираторного тракта человека. В 2007г была зарегистрирована вспышка легионеллеза в России в г. Верхняя Пышма Свердловской области (более 100 заболевших, 5 летальных исходов) (Онищенко Г.Г., Покровский В.И., Тартаковский И.С. 2008).
Впервые возбудитель легинеллеза был выделен и изучен сотрудниками CDC (США) J.E.McDade и C.C.Shepard (J. E.McDade, C.C.Shepard, Fraser D.M. et. al 1977). В 1978 году в СССР исследование по легионеллезу были начаты под руководством академика РАМН С.В. Прозоровского. В рамках этих исследований были изучены биологические свойства штамма, циркулирующие на территории СССР, разработаны и внедрены в практику серологические методы лабораторной диагностики. Показано, что легионеллез отличается от остальных респираторных инфекций отсутствием контагиозности, неординарными путями и факторами передачи возбудителя, отсутствием периодичности и цикличности в динамике заболеваемости (С.В. Прозоровский 1979г., В.И Васильева с соавт., 1986, Тартаковский И.С., 1982).
Легионеллы – широко распространенный водный микроорганизм, вызывающий при определенных обстоятельствах случаи пневмоний с тяжелым клиническим течением и высоким процентом летальных исходов. Наличие природных хозяев – свободноживущих в воде и почве амеб и простейших, в которых легионеллы паразитируют и сохраняются длительное время при благоприятных температурных условиях (выше 25 0 С), недостаточно для достижения возбудителем высоких концентраций, представляющих угрозу человеку. Для возникновения эпидемического неблагополучия необходимо достижение легионеллами высоких концентраций в искусственных водных системах антропогенного характера (градирня, система горячего водоснабжения, джакузи, душевые установки, кондиционеры и др.), а также контакт восприимчивых контингентов с мелкодисперсным водным аэрозолем, содержащим легионеллы (Legionella and prevention of Legionellosis, 2007).
Образование биоплёнок на внутренних поверхностях труб, шлангов, соединительных узлов систем водоснабжения и охлаждения воздуха способствует достижению высоких эпидемиологически значимых концентраций легионелл (Rogers J. et.al., 1994)
В настоящее время известны 3 основных типа потенциально опасных водных систем, размножение в которых легионелл может привести к возникновению эпидемических вспышек легионеллеза (Тартаковский И.С., Груздева О.А., и соавт. 2013) :
-
Водная система охлаждения промышленных предприятий и общественных зданий;
-
Система горячего водоснабжения (при температуре воды менее 600 с);
-
Бассейны и ванны с циркулирующей под давлением водой (типа джакузи).
Одной из наиболее важных типов систем является система горячего водоснабжения при температуре ниже 60 0С, что благоприятно для размножения легионелл и возникновения случаев легионеллезной инфекции. (Ricketts K.D., Joseph C., Lee J., Wewalka G., 2008).
К клинико-эпидемиологическим особенностям легионеллеза можно отнести наличие трех основных групп заболеваний по характеру приобретения инфекции: внебольничная пневмония (эпидемические вспышки и спорадические случаи), нозокомиальный легионеллез (внутрибольничная инфекция) и легионеллез, связанный с поездками, путешествиями (travel – associated legionellesis).
Изучению эпидемиологии и профилактики нозокомиального легионеллеза до настоящего времени в России не уделяли достаточного внимания, хотя уже было известно, что для нозокомиального легионеллеза характерны как спорадические случаи, так и достаточно крупные эпидемические вспышки.
Случаи нозокомиального легионеллеза, связанные с аспирацией пациентами госпиталя воды, контаминированной легионеллами, описаны в центре трансплантации органов в Оксфорде (Великобритании), в медицинском Центре Лос-Анжелеса (США), в больничных комплексах Ноттингема и Питтсбурга ( Stout J.O., Yu V.L. Vickers R.M. 1982, Edelstein P.H., Meyer R.).
За последние годы в Российской Федерации разработана современная методическая база для выявления легионелл в окружающей среде и внедрены эффективные методы эпиднадзора за легионеллезной инфекцией (Онищенко Г.Г., Демина Ю.В., Тартаковский И.С., 2009).
Целью эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией является оценка эпидемической ситуации, особенностей проявления и тенденций развития эпидемического процесса для принятия управленческих решений и разработки адекватных санитарно-противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на предупреждение возникновения случаев легионеллеза, формирования очагов с групповыми заболеваниями и летальных исходов.
Периодический количественный мониторинг потенциально опасных водных объектов и систем на предмет наличия в них легионелл является необходимым условием эффективной профилактики легионеллеза.
К водным системам, потенциально опасным в отношении легионеллеза, относятся системы горячего и холодного водоснабжения. Система горячего водоснабжения до недавнего времени представлялась наименее значимой для Российской Федерации по сравнению с водными системами охлаждения типа «Cooling towers” и джакузи массового пользования. Прежде всего, это связано с формальными требованиями СанПина СП 3.1.2.2626 -2010 « Профилактика легионеллеза», регламентирующего температуру горячего водоснабжения у нас в стране выше 60оС., тогда как за рубежом эта температура, как правило, не превышает 55оС, что благоприятствует колонизации легионеллами. Наиболее вероятна колонизация легионеллами систем горячего водоснабжения закрытого типа, в которых циркулирующая холодная вода нагревается до требуемой температуры с помощью специального теплоносителя, что характерно для большинства зданий общественного пользования в Российской Федерации: гостиницы, офисные и торговые центры, лечебно-профилактические учреждения. Поэтому для этой группы зданий анализ уровня возможной контаминации легионеллами представляется наиболее важной задачей (Yu V. 1998).
Наличие застойных участков и зон в системе водоснабжения, способность к колонизации микроорганизмами поверхности труб и другого водопроводного оборудования системы, способствует накоплению возбудителя легионеллеза в высоких концентрациях, что объясняет потенциальный риск возникновения нозокомиального легионеллеза. Для пациентов групп риска на фоне иммуносупрессии (отделения трансплантологии, гематологии, онкологии, интенсивной терапии) высока вероятность заражения в результате аспирации контаминированной водопроводной воды, что может приводить к возникновению нозокомиальных вспышек легионеллеза (Anassie E.I., Penzak S.R. et. al. 2002).
В Российской Федерации до начала настоящей работы исследования по анализу уровня контаминации легионеллами систем водоснабжения общественных зданий не проводились ввиду отсутствия необходимой методической базы,
Цель работы: Изучение уровня и особенностей контаминации легионеллами систем водоснабжения лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) в Московском регионе и обоснование адекватной тактики профилактики нозокомиального легионеллеза.
Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:
разработать методику обследования систем горячего водоснабжения ЛПУ на наличие легионелл с помощью бактериологического метода исследования и ПЦР-РВ;
провести мониторинг частоты и уровня контаминации легионеллами водных систем ЛПУ в Московском регионе;
охарактеризовать штаммы легионелл, циркулирующих в водных системах ЛПУ с помощью панели моноклональных антител;
изучить распространение глюкозилтрансфераз различного типа среди штаммов легионелл, выделенных из различных источников;
изучить морфологические особенности формирования биопленок, содержащих легионеллы, в системе горячего водоснабжения ЛПУ;
обосновать тактику профилактики легионеллеза в отделениях ЛПУ и оценить ее эффективность.
Научная новизна работы:
Впервые проведен мониторинг уровня и частоты колонизации легионеллами систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений в Московском регионе. Показано, что Legionella pneumophila присутствует во всех 10 обследованных комплексах и 85% из 20 обследованных зданий ЛПУ, в том числе в 8 отделениях групп риска (нейрохирургии, гематологии, реанимации, интенсивной терапии, трансплантации печени, психосоматики, ожоговом). Уровень колонизации образцов из систем горячего водоснабжения зданий ЛПУ был различен и колебался в диапазоне от 6 х 101 до 6,4 х 105 КОЕ/ на литр воды.
Впервые охарактеризовано серологическое разнообразие легионелл, циркулирующих в системах горячего водоснабжения ЛПУ. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 6 (38%), серогруппы 5 (17%), серогруппы 3 (16%), роль которых значима в этиологии пневмоний, связанных с оказанием медицинской помощи. Для штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения ЛПУ, характерна гомогенность популяции: в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп Legionella pneumophila, в 20% - штаммы не более 2х серогрупп.
Впервые показано распространение глюкозилтрансфераз (Lgt1,2,3) различных типов у штаммов Legionella. pneumophila, выделенных из различных источников. Lgt1 и Lgt3 присутствуют у всех штаммов Legionella pneumophila и отсутствуют у Legionella species. Данные типы глюкозилтрансфераз можно рассматривать в качестве видоспецифических маркеров Legionella pneumophila. Lgt2 в 2 раза чаще (46%) встречается у клинических штаммов легионелл, по сравнению со штаммами Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды.
Впервые показана высокая скорость формирования организованных смешанных микробных биопленок (в течение 2-3 недель) с образованием номад на поверхности защитных фильтров, вмонтированных в водопроводные краны системы водоснабжения ЛПУ, с помощью сканирующей электронной микроскопии. Наряду с легионеллами, в составе биопленок, формируемых в системе водоснабжения ЛПУ, выявлены и другие бактерии, вызывающие внутрибольничную инфекцию.
Практическая значимость работы:
-
Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять уровень контаминации легионеллами системы водоснабжения ЛПУ на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением.
-
Современные методы мониторинга легионелл в системе горячего водоснабжения внедрены в систему государственного санитарно-гигиенического нормирования. По результатам работы в практику здравоохранения внедрены:
Санитарно – Эпидемиологические правила СП 3.1.2.262-10 «Профилактика легионеллеза», 2010г.
Методические рекомендации МР 02.039-09 «Выявление и количественное определение легионелл в водных образцах внешней среды методом полимеразной цепной реакции в реальном времени», 2009г.
-
Показана эффективность профилактического действия фильтров конечной фильтрации в контаминированной легионеллами системе водоснабжения отделения групп риска ЛПУ .
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять контаминированные легионеллами участки и зоны потенциально опасных водных объектов в системе водоснабжения ЛПУ на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением.
-
Осуществлен мониторинг уровня и частоты колонизации легионеллами систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений в Московском регионе. Показано, что Legionella pneumophila присутствует во всех 10 обследованных комплексах и 85% из 20 обследованных зданий ЛПУ, в том числе в 8 отделениях групп риска (нейрохирургии, гематологии, реанимации, интенсивной терапии, трансплантации печени, психосоматики, ожоговом). Уровень колонизации образцов из систем горячего водоснабжения зданий ЛПУ был различен и колебался в диапазоне от 6 х 101 до 6,4 х 105 КОЕ/ на литр воды.
-
Проведен анализ серологического разнообразия легионелл, циркулирующих в системах горячего водоснабжения ЛПУ. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 6 (38%), серогруппы 5 (17%) ,серогруппы 3 (16%), роль которых значима в этиологии пневмоний, связанных с оказанием медицинской помощи. Для штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения ЛПУ, характерна гомогенность популяции: в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп Legionella pneumophila, в 20% - штаммы не более 2х серогрупп.
-
Анализ распространения глюкозилтрансфераз (Lgt1,2,3) различных типов у штаммов Legionella pneumophila, выделенных из различных источников показал, что Lgt1 и Lgt3 присутствуют у всех штаммов Legionella pneumophila и отсутствуют у Legionella species. Данные типы глюкозилтрансфераз можно рассматривать в качестве видоспецифических маркеров Legionella pneumophila. Lgt2 в 2 раза чаще (46%) встречается у клинических штаммов легионелл, по сравнению со штаммами Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды.
-
Показана высокая скорость формирования организованных смешанных микробных биопленок (в течение 2-3 недель) с образованием номад на поверхности защитных фильтров, вмонтированных в водопроводные краны системы водоснабжения ЛПУ, с помощью сканирующей электронной микроскопии. Наряду с легионеллами, в составе биопленок, формируемых в системе водоснабжения ЛПУ, выявлены и другие бактерии, вызывающие внутрибольничную инфекцию.
-
Профилактика легионеллеза в отделении группы риска ЛПУ с помощью метода конечной фильтрации в системе водоснабжения, контаминированной легионеллами, обеспечивала полную защиту пациентов от контакта с возбудителем.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Legionella 2009» (Париж, 2009), на Пленуме Научного совета по экологии и гигиене окружающей среды РАМН (Москва, 2009), 25 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезу (Copenhagen, 2010), 26 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезу (Wienna, Austria,2011).
Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела эпидемиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. – 28.05.2014г., протокол № 3
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 125страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований и их обсуждения, выводы и список литературы, содержащий ссылки на 24отечественных и 107 иностранных источников. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 17 рисунками и 1 схемой.
Особенности экологии легионелл в потенциально опасных водных системах
Впервые проведен мониторинг уровня и частоты колонизации легионел-лами систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений в Московском регионе. Показано, что Legionella pneumophila присутствует во всех 10 обследованных комплексах и 85% из 20 обследованных зданий ЛПУ, в том числе в 8 отделениях групп риска (нейрохирургии, гематологии, реанима-ции, интенсивной терапии, трансплантации печени, психосоматики, ожоговом).
Уровень колонизации образцов из систем горячего водоснабжения зданий ЛПУ был различен и колебался в диапазоне от 6 х 10 до 6,4 х 105 КОЕ/ на литр воды.
Впервые охарактеризовано серологическое разнообразие легионелл, цир-кулирующих в системах горячего водоснабжения ЛПУ. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруп-пы 6 (38%), серогруппы 5 (17%), серогруппы 3 (16%), роль которых значима в этиологии пневмоний, связанных с оказанием медицинской помощи. Для штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения ЛПУ, характерна гомогенность популяции: в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп Legionella pneumophila, в 20% - штаммы не более 2х серогрупп.
Впервые показано распространение глюкозилтрансфераз (Lgt1,2,3) раз-личных типов у штаммов Legionella. pneumophila, выделенных из различных источников. Lgt1 и Lgt3 присутствуют у всех штаммов Legionella pneumophila и отсутствуют у Legionella species. Данные типы глюкозилтрансфераз можно рас-сматривать в качестве видоспецифических маркеров Legionella pneumophila. Lgt2 в 2 раза чаще (46%) встречается у клинических штаммов легионелл, по сравнению со штаммами Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды. Впервые показана высокая скорость формирования организованных сме-шанных микробных биопленок (в течение 2-3 недель) с образованием номад на поверхности защитных фильтров, вмонтированных в водопроводные краны системы водоснабжения ЛПУ, с помощью сканирующей электронной микро-скопии. Наряду с легионеллами, в составе биопленок, формируемых в системе водоснабжения ЛПУ, выявлены и другие бактерии, вызывающие внутриболь-ничную инфекцию. Практическая значимость работы:
1. Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять уровень контаминации легионеллами системы водоснабжения ЛПУ на основе скринин-га с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением.
2. Современные методы мониторинга легионелл в системе горячего водоснабжения внедрены в систему государственного санитарно-гигиенического нормирования. По результатам работы в практику здравоохра-нения внедрены:
Санитарно – Эпидемиологические правила СП 3.1.2.262-10 «Про-филактика легионеллеза», 2010г. Методические рекомендации МР 02.039-09 «Выявление и количе-ственное определение легионелл в водных образцах внешней среды методом полимеразной цепной реакции в реальном времени», 2009г.
3. Показана эффективность профилактического действия фильтров конечной фильтрации в контаминированной легионеллами системе водоснаб-жения отделения групп риска ЛПУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять конта-минированные легионеллами участки и зоны потенциально опасных водных объектов в системе водоснабжения ЛПУ на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением..
2. Осуществлен мониторинг уровня и частоты колонизации легионел-лами систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений в Московском регионе. Показано, что Legionella pneumophila присутствует во всех 10 обследованных комплексах и 85% из 20 обследованных зданий ЛПУ, в том числе в 8 отделениях групп риска (нейрохирургии, гематологии, реанима-ции, интенсивной терапии, трансплантации печени, психосоматики, ожоговом). Уровень колонизации образцов из систем горячего водоснабжения зданий ЛПУ был различен и колебался в диапазоне от 6 х 101 до 6,4 х 105 КОЕ/ на литр воды.
3. Проведен анализ серологического разнообразия легионелл, цирку-лирующих в системах горячего водоснабжения ЛПУ. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруп-пы 6 (38%), серогруппы 5 (17%) ,серогруппы 3 (16%), роль которых значима в этиологии пневмоний, связанных с оказанием медицинской помощи. Для штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения ЛПУ, характерна гомогенность популяции: в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп Legionella pneumophila, в 20% - штаммы не более 2х серогрупп.
4. Анализ распространения глюкозилтрансфераз (Lgt1,2,3) различных типов у штаммов Legionella pneumophila, выделенных из различных источников показал, что Lgt1 и Lgt3 присутствуют у всех штаммов Legionella pneumophila и отсутствуют у Legionella species. Данные типы глюкозилтрансфераз можно рас-сматривать в качестве видоспецифических маркеров Legionella pneumophila. Lgt2 в 2 раза чаще (46%) встречается у клинических штаммов легионелл, по сравнению со штаммами Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды.
5. Показана высокая скорость формирования организованных сме-шанных микробных биопленок (в течение 2-3 недель) с образованием номад на поверхности защитных фильтров, вмонтированных в водопроводные краны системы водоснабжения ЛПУ, с помощью сканирующей электронной микро-скопии. Наряду с легионеллами, в составе биопленок, формируемых в системе водоснабжения ЛПУ, выявлены и другие бактерии, вызывающие внутриболь-ничную инфекцию.
Бактериологическое исследование воды и биопленок
В настоящее время некультивируемые формы легионелл изучают с пози-ций анализа их потенциальной опасности в «искусственных» водных системах. В центре внимания такие проблемы, как уровень устойчивости некультивируе-мых легионелл к дезинфектантам по сравнению с культивируемыми формами; поиск химических соединений в составе пластиковых труб системы водоснаб-жения, индуцирующих переход в культивируемое состояние и последующее размножение; динамика соотношения некультивируемых и культивируемых форм легионелл в потенциально опасных водных системах после применения дезинфектантов [80, 111, 113]. Именно меняющимся соотношением некульти-вируемых и культивируемых форм легионелл можно объяснить повторные вспышки болезни легионеров в гостиницах или больницах после, казалось бы, успешно проведенной, по данным бактериологического высева, дезинфекции.
За более чем 30-летний период стало ясным, что экспериментально вос-произвести условия природной или «искусственной» водной экосистемы прак-тически не реально, но влияние некоторых существенных факторов на размно-жение легионелл в водных системах проанализировать можно. Это такие фак-торы как температура, особенности взаимоотношений с другими микроорга-низмами, наличие природных хозяев – простейших, способность к формирова-нию биопленок.
Температурный фактор является важнейшим в экологии легионелл и эпи-демиологии легионеллезной инфекции. Легионеллы выделяют из систем горя-чего водоснабжения при температуре порядка 66оС и при 70оС из природной воды, но при температуре более 70оС выделить легионеллы не удавалось [45]. Легионеллы способны выделять CO2 при 51,6 оС, подтверждая активность ряда ферментных систем микроорганизма при этой температуре. Yee & Wadowsky (1982) показали, что в природе легионеллы активно размножаются при темпе-ратуре от 25оС до 45оС, а оптимум лежит между 37 и 42оС [126, 130]. Этот тем-пературный диапазон соответствует температурному режиму эксплуатации джакузи и спа-бассейнов. Аналогичную температуру достаточно часто выявля-ют в застойных участках системы горячего водоснабжения или в воде, цирку-лирующей в градирне. Легионеллы могут длительно сохраняться в водной среде. Штаммы Le-gionella pneumophila сохраняли жизнеспособность в водопроводной воде более года, а в дистиллированной - более 4-х месяцев. В воде из пруда при темпера-туре 23оС легионеллы сохраняли жизнеспособность в течение 250 дней. При хранении в стерильной воде титр Legionella pneumophila падал в течение 10 дней с 106-108 КОЕ/мл до 103-105 КОЕ/мл, сохраняясь в дальнейшем неизмен-ным более полугода [110]. В то же время для активного размножения в водных экосистемах «планктонным» культивируемым формам легионелл необходимо взаимодействие с другими микроорганизмами. Показана способность Legionella pneumophila размножаться в стерильной водопроводной воде после добавления туда микроорганизмов, выделенных из этой же воды до стерилизации или в той же нестерильной воде [126]. В модельных системах при проточном культиви-ровании легионеллы длительно размножались в водопроводной воде после фильтрации и добавления в систему смешанной микрофлоры, выделенной из той же водопроводной воды [86, 98]. В стерильной воде в ассоциациях с други-ми микроорганизмами и «резиновыми или синтетическими прокладками» во-допроводных кранов, легионеллы активно размножались в течение 4-7 недель, а в течение 4-х месяцев сохраняли жизнеспособность и высевались из воды [107]. К числу гетеротрофных водных бактерий, для которых показано ассоциативное взаимодействие с легионеллами, относятся Flavobacterium breve, Pseudomonas spp., Alcaligenes spp., Acinetobacter spp. В то же время Toze at al (1990) показал, что около 32% гетероторофных бактерий, выделенных из хлорированной пить-евой воды, включая Aeromonas spp. и Pseudomonas spp., ингибировали рост ле-гионелл. Известно, что для легионелл характерен аминокислотный метаболизм [94]. Аминокислоты и соли железа необходимы им в качестве источника угле-рода, азота и источника энергии. Вероятно, в водных экосистемах потребность легионелл в аминокислотах и других питательных веществах обеспечивается непосредственно или опосредованно за счет жизнедеятельности других бакте-рий или микроорганизмов – обитателей той же экосистемы, природной или ру-котворной. Получены данные о росте легионелл в ассоциациях с зелеными во-дорослями за счет продуктов метаболизма Chlorella spp. и Scenedesmus spp. [77]. Убедительным примером ассоциативного взаимодействия легионелл и во-дорослей в водных экосистемах является работа Tison et al (1980), изучавшего сообщество микроорганизмов из воды искусственного термального стока с температурой 45оС [120]. Сообщество было представлено Legionella pneumophila серогруппы 1 и сине-зелеными водорослями Fisherella spp. и Oscillatorium spp. Штамм Legionella pneumophila рос на минимальной солевой среде при 45оС в ассоциации с Fisherella spp. Причем скорость роста легионелл первые 6 ч. совместного культивирования вдвое превышала скорость роста ле-гионелл на обычных питательных средах. При переносе культуры легионелл в свежую среду с сине-зелеными водорослями, интенсивный рост легионелл во-зобновлялся. При ингибиции фотосинтетической активности Fisherella spp., рост Legionella pneumophila прекращался. Таким образом, продукты метабо-лизма сине-зеленых водорослей в процессе фотосинтетической активности ока-зались источником аминокислот и других необходимых питательных веществ.
Типирование легионелл с помощью панели моноклональных анттел
Образцы воды, биопленок, смывов из систем горячего водоснабжения ис-следовали в соответствии с МУК 4.2.2217-07 «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды» [6].
Отобранные образцы воды пропускали через мембранный фильтр с диа-метром пор 0,4 мкм. После окончания фильтрации мембранные фильтры пере-носили обожженным анатомическим пинцетом в стерильный флакон. Для десорбции микрофлоры с фильтров, флакон помещали на встряхива-тель на 1-2мин. Далее смыв с поверхности фильтра помещали в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость полностью удаляли для последующего обезза-раживания. Осадок тщательно ресуспендировали стерильной пипеткой в 1 мл физиологического раствора и переносили в стерильную пробирку.
Подготовленную таким образом пробу помещали в холодильную камеру при 4 оС до окончания исследования. При необходимости допускалось ее хра-нение в течение года.
Для снижения уровня загрязненности сконцентрированной пробы посто-ронней микрофлорой одну ее часть подвергали прогреванию, а другую обраба-тывали кислотным буфером.
Для прогревания, из подготовленного сконцентрированного образца от-бирали 0,2 мл и переносили в стерильную пробирку, после чего помещали про-бирку на водяную баню при 50 ОС и прогревали в течение 30 минут. Для обра-ботки кислотным буфером, 0,2 мл сконцентрированного образца переносили в стерильную пробирку и добавляли 0,2 мл раствора кислотного буфера KCl-HCl, рH 2,2, инкубировали при комнатной температуре в течение 4 минут. Кислот-ную обработку проводили непосредственно перед посевом на плотные пита-тельные среды.
Образцы биопленок, смывы с поверхностей подвергали концентрирова-нию с помощью центрифугирования, кислотной и термической обработке.
Все штаммы легионелл выращивали на плотной агаризованной среде бу-ферный угольно-дрожжевой агар (БУДРАГ, BCYE) с ростовой и селективной добавкой («Oxoid») при 370С в течение 72ч, также в качестве ростовых добавок применяли L-цистеин 400мг/л (Япония) и пирофосфат железа растворимый 250мг/л («Sigma»), стерилизованные через фильтр с диаметром пор 0,4 мкм. Среду разливали в стерильные чашки Петри по 25мл и подсушивали в термостате при 36оС в течение часа. Среда имела характерный черно-серый цвет.
В качестве контрольной среды, не поддерживающей рост легионелл, ис-пользовали среду БУДРАГ без добавления селективной и ростовой добавки. Для пересева колоний легионелл и дальнейшего культивирования, использова-ли среду БУДРАГ с ростовой, но без селективной добавки.
По 0,1 мл исходного, концентрированного, обработанного кислотным буфером и прогретого при 500С образца высевали на чашки со средой БУДРАГ с ростовой и селективной добавкой. Образец распределяли по поверхности пи-тательной среды шпателем. Чашки инкубировали при 36оС до 10 дней во влаж-ной атмосфере и в присутствии 2,5% СО2.
Просматривать чашки начинали с 2 суток, хотя из воды колонии легио-нелл могут вырасти на 5-7 сутки и в более поздние сроки.
Подозрительные на легионеллы колонии выявляли при стереомикроско-пическом просмотре чашек. На селективной среде колонии легионелл обычно имеют вросший центр, гранулярную или блестящую поверхность, серовато-голубоватую, иногда зеленоватую окраску. Колонии легионелл на 3-5 сутки не-большие, диаметром 1-2 мм, плоско-выпуклые, гладкие с острым краем.
Для идентификации бактерий рода Legionella, подозрительные колонии высевали на среду БУДРАГ без селективной и ростовой добавок. 2-3 подозри-тельные колонии с каждой чашки отсевали параллельно на среду БУДРАГ без селективной добавки и на контрольную среду и инкубировали при 360С в тече-ние 48 часов. В качестве контрольной среды использовали среду БУДРАГ без добавления L-цистеина и растворимого пирофосфата железа. Легионеллы рас-тут на среде БУДРАГ и не растут на контрольной среде. Идентифицированные подобным образом колонии относили к роду Legionella. После подтверждения латексной тест-системой, культуры Legionella pneumophila подсчитывали коли-чественно для последующего определения легионелл в 1 литре воды. Учет результатов бактериологических исследований.
Для определения принадлежности выросших колоний к виду Legionella pneumophila, использовали тест-систему для латекс-агглютинации. Для поста-новки реакции каплю изотонического солевого раствора вносили в каждую из трех лунок на стекле для агглютинации. Отбирали предполагаемые колонии ле-гионелл, выросшие на буферном угольно-дрожжевом агаре с ростовой добав-кой. С помощью петли подозрительные колонии переносили в каждую из лунок и тщательно перемешивали с изотоническим солевым раствором в течение 2 минут. В каждую из лунок последовательно добавляли одну каплю латексного реагента Legionella 1, в другую – одну каплю латексного реагента Legionella 2-15, в третью – одну каплю латексного реагента Legionella spp. Перемешивали каждую латексную суспензию отдельной стеклянной палочкой и, осторожно покачивая стекло, наблюдали за появлением агглютинации в течение 1 минуты. Размер агглютината и скорость его появления вариабельна и зависит от концен-трации антигена легионелл в суспензии.
Анализ эффективности использования ПЦР-РВ для выявления легионелл, в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений
Среди различных типов потенциально опасных в отношении легионелл водных систем, системы горячего водосонабжения до недавнего времени пред-ставлялись наименее значимыми для Российской Федерации по сравнению с водными системами охлаждения типа «Cooling towers” и джакуззи массового пользования. Прежде всего, это связано с формальными требованиями СанПина СП 3.1.2.2626 -2010 « Профилактика легионеллеза», регламентирующего тем-пературу горячего водоснабжения у нас в стране выше 60оС., тогда как за рубе-жом эта температура, как правило, не превышает 55оС, что благоприятствует колонизации легионеллами [16]. Однако, крупная эпидемическая вспышка ле-гионеллеза в Верхней Пышме в 2007 году, свидетельствовала о возможности возникновения ситуации, благоприятной для колонизации системы горячего водсонабжения и в России [9]. Наиболее вероятна колонизация легионеллами систем горячего водоснабжения закрытого типа, в которых циркулирующая хо-лодная вода нагревается до требуемой температуры с помощью специального теплоносителя. Именно такая система горячего водоснабжения характерна для большинства зданий общественного пользования в Российской Федерации: гос-тиницы, офисные и торговые центры, лечебно-профилактические учреждения. Поэтому для этой группы зданий и прежде всего, лечебно-профилактических учреждений анализ уровня возможной контаминации легионеллами представ-ляется наиболее важной задачей [11].
На первом этапе исследований нами была разработана методика обсле-дования общественных зданий на наличие легионелл, так как аналогичные ра-боты ранее в России не проводились, и проведено скрининговое обследование ряда общественных зданий в Московском регионе. Показано, что принципиально важным при исследовании на легионеллы из системы горячего водоснабжения, было взятие образцов воды и смывов с внутренней поверхности водопроводных кранов, сеток душа, внутренней по-верхности труб концевых, редко используемых и «застойных» участков систе-мы горячего водоснабжения. Для исследования берут первую порцию горячей воды из крана или душа без предварительного слива воды. Отсутствует необхо-димость в предварительной дезинфекции поверхности крана или душевой на-садки, используемой при обычном санитарно-бактериологическом исследова-нии водопроводной воды в соответствии с МУК 4.2.2217 -07 «Выявление бак-терий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды».
Скрининг систем горячего водоснабжения общественных зданий (ЛПУ, гостиницы, офисные центры) c помощью разработанной методики показал, что практически на всех обследованных объектах в значительном количестве выяв-лена культура Legionella pneumophila в концентрации от 6х10 до 6,4 х105 КОЕ (геномных копий) на литр воды. Вода систем горячего водоснабжения общест-венных зданий представляла также благоприятную среду для колонизации дру-гими бактериями, прежде всего, Pseudomonas aeruginosa.
Высокий уровень и частота контаминации легионеллами систем горячего водоснабжения данного типа требовал внедрения современных методических подходов для обследования этих объектов. Для этой цели наряду с бактериоло-гическим стандартным методом нами использовалась отечественная тест-система для одновременного количественного выявления Legionella pneumo-phila и качественного выявления Legionella spp. и Pseudomonas aeruginosa (АМПЛИ-ЛЕГ+РВ) в водных образцах. В наборе реагентов одновременно в од-ной пробирке проходили четыре независимых реакции: первая – для обнаруже-ния специфического фрагмента ДНК гена 16S рРНК Legionella spp., вторая – для обнаружения и количественного определения специфического фрагмента ДНК гена mip Legionella pneumophila, третья реакция - реакция внутреннего по-ложительного контроля (ВПК)- позволяет исключить недостоверные результа-ты и контролировать наличие ингибиторов, четвертая реакция позволяет обна-ружить ДНК специфического фрагмента гена gyrB Pseudomonas aeruginosa. Теоретически метод позволяет на уровне скрининга быстро оценить уровень контаминации воды в системе горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений легионеллами и синегнойной палочкой.
Проведенные исследования на базе 10 лечебно-профилактических учреж-дений показали, что наиболее выражена корреляция между результатами бак-териологических исследований и ПЦР при использовании данной тест-системы для Legionella pneumophila (83,3%); для синегнойной палочки корреляция уста-новлена в 66,6% образцов. Наиболее противоречивы результаты при анализе уровня контаминации образцов воды Legionella spp. ДНК Legionella spp. обна-ружена качественно в 52 (44%) образцах воды, в то время как культуры Le-gionella spp. из этих же образцов не были выделены. Следует отметить, что в 85 % данных образцов была выделена культура Legionella pneumophila в достаточ-но высокой концентрации. Можно предположить, что намного быстрее расту-щая культура Legionella pneumophila в высокой концентрации подавила рост значительно более прихотливых и медленно растущих иных видов легионелл. Вероятно, в дальнейшем, по результатам качественного теста в ПЦР на присут-ствие в воде ДНК Legionella spp., необходимо применение количественной мо-дификации ПЦР в реальном времени для оценки степени колонизации объекта Legionella spp.
